Summary
Den interrenal körtel i zebrafisk är teleostean motsvarigheten till däggdjur binjuren. Detta protokoll beskriver hur du utför tre-β-hydroxisteroiddehydrogenas (Δ 5-4 isomeras, 3β-HSD) enzymatisk aktivitet analys som detekterar differentierade steroidogena celler i utvecklingszebrafisk.
Introduction
Binjuren, en viktig komponent i hypotalamus-hypofys-binjure-axeln, utsöndrar steroider och samordnar steroid homeostas och kroppslig reaktion på stress. Binjuren innefattar det yttre cortex, som utsöndrar steroider i en zon specifikt sätt, och inre medulla, som syntetiserar katekolaminer. Den interrenal körtel i teleosts är motsvarigheten till binjuren hos däggdjur och består av steroidogena interrenal och kromaffinceller, som är funktionella ekvivalenter av binjurebarken och märg, respektive 1-3. Studier utförda med hjälp av zebrafisk modellen har rapporterat att både steroidogena och kromaffina cellinjer bildas genom molekylära och cellulära mekanismer mycket liknar de hos däggdjur 1,2. Därför är zebrafisk en potentiellt kraftfull modell för att studera genetiska sjukdomar, neuroendokrin kontroll och systembiologi i hypotalamus-hypofys-binjure (interrenal) axel.
4,5. 3β-HSD är avgörande för biosyntes alla typer av hormonella steroider, nämligen progesteron, glukokortikoider, mineralkortikoider, androgener och östrogener. De två mänskliga 3β-HSD isozymer HSD3B1 och HSD3B2 är differentiellt uttryckta 6. HSD3B1 uttrycks i placentan och perifera vävnader, medan HSD3B2 uttrycks i binjurebarken och gonader. Human HSD3B1 och HSD3B2 är co-ortologer av zebrafisk hsd3b1, som uttrycks på interrenal vävnad och vuxna könskörtlar; zebrafisk hsd3b2 är för modern uttryckt gen vars transkript försvinna innan organ 7. Protokollet av hela montering 3β-HSD enzymatisk aktivitet analys för zebrafisk utvecklades genom att modifiera Levy metod, ens beskrivs av Milano et al. På frysta sektioner av åtta teleost arter 8. På grund av vävnads permeabilitet och optisk transparens av utvecklingszebrafisk, hel-mount 3β-HSD histokemi med framgång kan användas för fasta zebrafisk embryot och larver och specifikt beskriva de differentierade interrenal vävnader.
Denna känsliga och snabb analys har tillämpats på olika mutanter och morphants visar olika typer av interrenal dysmorphogenesis. Den interrenal 3β-HSD-aktivitet är frånvarande i embryot där specificering av interrenal vävnaden störs genom en särskild knockdown av Ff1b transkriptionsfaktor och minskar som interrenal differentiering påverkas av en knockdown av Ff1b coregulator Prox1 9,10. Noterbart kan 3β-HSD-aktivitet detekteras i mutanter med allvarliga defekter tidigt stadium, såsom enögd knappnålshuvud och kisa, där 3β-Hsd histokemi skisserar hur interrenal cellmigration påverkas 11. Differentieringen av interrenal vävnaden inte äventyras även i total avsaknad av blod och kärl. Därför hur endotelhärledd signaler forma utveckla interrenal organ kan bestämmas 12,13. Sammantaget har detta histokemisk analys med framgång använts för att studera specifikation, differentiering och migration av steroidogena celler i zebrafisk modellen. Därför bör det vara ett effektivt och tillförlitligt verktyg för eventuella genetiska eller kemiska skärmar riktar binjurarna och interrenal störningar organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla experimentella procedurer på zebrafisk har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Tunghai University (IRB godkännande nr 101-12.) Och genomförs i enlighet med de godkända riktlinjerna.
1. Stamlösningar för 3β-Hsd Enzymatisk aktivitet Färgning
- Framställa trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml i dimetylsulfoxid (DMSO)].
- Förbereda β-nikotinamid-adenin-dinukleotid-hydrat (1,2 mg / ml i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,2).
- Förbered nikotinamid (vitamin B3, 50 mg / ml i H2O).
- Framställa 4-nitroblå tetrazolium (50 mg / ml i 70% dimetylformamid).
- Alikvot alla dessa komponenter till mikrofugrör och förvara vid -20 ° C.
OBS: Enligt vår erfarenhet, upprepad frysning och upptining av de alikvoter av samtliga ovannämnda lösningar inte påverkar intensiteten av 3β-HSD-aktivitet färgning.
2. Whole-mount 3β-HSD aktivitet färgning
OBS: 3β-Hsd enzymatisk aktivitet kan detekteras i zebrafiskembryon så tidigt som 28 timmar efter befruktning (HPF) när de odlas vid 28,5 ° C, vilket är förenligt med starten av mRNA-expression av hsd3b1 2,7. Hela-mount 3β-HSD-aktivitet färgningsprotokollet i denna studie är baserad på en tidigare beskriven metod 8 och var fast besluten att bli framgångsrik i att utveckla zebrafisk upp till 7 dagar efter befruktningen 9. För att analysera den vaskulära mikro av interrenal steroidogena vävnad, hela montering 3β-HSD-aktivitet färgning måste tillämpas på transgena linjer som uttrycker endotel-specifik fluorescens, såsom Tg (kdrl: EGFP) s843 14 och Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . För att analysera interrenal steroidogena vävnaden överväger zebrafisk njure utveckling, kan 3β-HSD-aktivitet färgning vara tillämped till Tg (wt1b: GFP) LI1 fisk 16, där bildandet av glomeruli och pronephric tubuli avgränsas.
- Behandla den utveckla zebrafisk genom att inkubera dem i 0,03% fenyltiourea i ägg vatten (0,06 mg / L rev salt i avjoniserat vatten), utgående från ett steg mellan 12 och 24 HPF, för att inhibera pigmentbildning.
- Fixa dechorionated embryon eller larver i (A) 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 0,1% Tween 20 (PFAT) under 1 h vid rumstemperatur (RT) eller (B) 2% PFAT över natten vid 4 ° C eller under 2 h vid 4 ° C, följt av 4 h vid RT.
Varning: PFA är giftig vid inandning och hudkontakt. Det är skada hud, slemhinnor, ögon och övre luftvägarna. - Tvätta embryona 4x under 10 min med PBS kompletterad med 0,1% Tween 20 (PBST) vid RT.
OBS: Det är viktigt att inte torka proven när du byter tvättlösningar. - Färskt förbereda staining lösning innan reaktionerna (tabell 1). Förbered, virvel, och centrifug delarna A och B i separata rör.
OBS: Lägga alla komponenter rakt in i ett enda rör skulle orsaka allvarliga nederbörd. - Tillsätt hela lösningen i del A till hela lösningen av del B, blanda väl för att förbereda färgningslösningen, och omedelbart fördela en ml i varje mikrofugrör innehållande fasta och tvättade embryon.
- Wrap mikrofugrör med aluminiumfolie för att skydda dem från ljus och plats på antingen en rotator eller en gungande plattform för försiktig skakning vid rumstemperatur.
- Empiriskt bestämma reaktionstiden genom att övervaka kromogena signaler genom mikroskopi. Små utfällningar kommer att utvecklas med tiden; dock kommer de inte stör reaktionen processen.
OBS: För embryon fastställdes till 28 HPF, färgning vid 25 ° C under 4 h genererar en tydlig signal vid interrenal vävnaden. - Stoppa reaktionen genom att tvätta 4x under 10 minuter i PBST. jagf ingen ytterligare immunohistokemisk (IHC) analys krävs, post-fixa de färgade embryon med 4% PFAT under 60 min vid RT. Annars lagra de tvättade embryon vid 4 ° C fram till vidare användning.
- För hela-mount mikroskopi, rensa färgade, efter fasta, och tvättade embryon med 50% glycerol i PBS, orientera dem med ryggsidan uppåt på en bild, och observera att använda en upprätt mikroskop under ljusa fält belysning.
OBS: För att göra en högupplöst bild av interrenal vävnadsmorfologin, platt-mount analys av 3β-HSD-aktivitet-färgade och deyolked embryo rekommenderas. Som interrenal steroidogena vävnaden är placerad precis ovanför gulesäcken, en ventral platt-mount analys av interrenal vävnad möjliggör en direkt och tydlig observation av interrenal morfologi 17.
3. IHC Analys av 3β-HSD Verksamhets färgade Embryon
OBS: För att analysera den vaskulära mikro av steroidogenic vävnad, är 3β-HSD aktivitets färgade embryon med en transgen endotel-specifik fluorescerande reporter utsatt för tvärgående vibratome sektionering och efterföljande IHC analys 12,18.
- Efter fixering
- Post-fixa 3β-HSD-aktivitet-färgade och tvättade embryon med 2% PFA kompletterat med 1% Triton X-100 under 1 timme vid 4 ° C och tvätta 4x under 10 min i PBS innehållande 1% Triton X-100 (PBSTx) vid RT.
- inbäddning
- Förbered 4% lågsmältande agaros genom upplösning av agaros i PBS vid 95 ° C, alikvot in i mikrofugrör och lagra vid 4-8 ° C.
- Smält en alikvot av 4% lågsmältande agaros vid 70 ° C under 10 min, och sedan hålla alikvoten vid 47 ° C. Bädda in varje embryo i smält 4% lågsmältande agaros i ett fristående locket på en 1,5 ml mikrofugrör som tjänar som en form, och låt svalna tills fast ämne.
- vibratome Sektione
- Sticka ett papper tejp till den torra platform av vibratome.
- Ta bort den härdade agarosen blocket från formen genom ett rakblad. Applicera superlim för att papperstejpen på plattformen, och fixa agarosen blocket på papperstejp, med den främre sidan av provet uppåt. Trimma agarosen blocket till en trapetsformad prismaform, med ca 4 mm och 8 mm på varje sida av de övre och undre fasetter, respektive.
- Skölj provinnehållande agaros block med kall PBS supplementerat med 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) genom att använda en pipett.
- Skiva agarosen blocket i 100 fim sektioner enligt bruksanvisningen för vibratome. Ständigt skölja agarosen blocket för att förhindra uttorkning. Eftersom varje skiva skärs bort den från vibratome med hjälp av en 26 G sprutnål, och överför till en plats platta innehållande kall 0,5% PBSTx (500 ul / brunn).
- Samla 3p-HSD aktivitets positiv vävnadssnitt genom att kontrollera under ett dissektionsmikroskop, och överföra delar av en piPette spetsen med sin ände cut-off (ca 1 mm innerdiameter vid öppnandet) in i en 96-brunnars platta innehållande kall 0,5% PBSTx (150 | j, l / brunn). Vävnadsproverna dissociera vanligtvis från agarosen blocket efter detta steg.
- Permeabilisering och tvättning
- Tvätta skivorna 6x under 15 minuter i 0,5% PBSTx vid RT, 10 min i PBS, och 4x under 10 min i PBS kompletterad med 1% bovint serumalbumin / 1% DMSO / 0,1% Triton X-100 (PBDTx).
- Blockering
- Inkubera skivor för en h i 2% fetalt kalvserum (FCS) i PBDTx vid RT.
- Primär antikropp reaktion
- Inkubera skivor under 1,5 dagar i PBDTx innehållande en primär antikropp (t ex kanin-polyklonal anti-humant fibronektin och mus-anti-human fokaladhesion kinas) vid 4 ° C.
- Tvättning
- Tvätta skivorna 6x under 10 min i PBDTx vid RT.
- Blockering
- Inkubera skivor för en h i 2% FCS i PBDTX vid RT.
- Sekundär antikropp Reaktion
- Inkubera skivor för 1,5 dagar i PBDTx innehållande en sekundär antikropp (fluorofor-konjugerad get-anti-kanin eller anti-mus-IgG) vid 4 ° C.
- Tvättning
- Tvätta skivorna 6x under 10 minuter i PBDTx vid RT och 4x i 10 min i PBST vid RT.
OBS: För konfokala mikroskopisk analys, rensa proverna med 50% glycerol i PBS.
- Tvätta skivorna 6x under 10 minuter i PBDTx vid RT och 4x i 10 min i PBST vid RT.
4. Confocal Analys
- Observera hela berget embryot och sektionen av en konfokalmikroskop utrustad med 10X / 0.5 och 20X / 0.75 objektiv.
- För samtidig detektion av fluorescens och 3β-HSD färgning, ställa in multitrack läget enligt följande: 488 nm argonlaser och 505-530 nm bandpassfilter för detektering av GFP; 543 nm helium-neonlaser och 560-615 nm bandpassfilter för detektering av mCherry; och transmitterat ljus kanal för detektering av 3β-HSD-färgning.Pinhole storlek är en Airey enhet, och upplösningen är 1024 x 1024 pixlar.
- Montera z stackar (med 6 um intervall) som en 3D-projektion, och slå samman utsprånget och ljusa fält, genom att använda den inbyggda konfokal programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma hur steroidogena interrenal vävnads codevelops med pronephric njuren glomeruli och dess begynnande kärl var 3β-HSD enzymatisk aktivitet analysen utförs på dubbeltransgena Tg (wt1b: GFP) LI1, Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryo vid 34 HPF (Figur 1). I detta skede är den 3β-HSD-aktivitet-positiva steroidogena vävnad ligger rätt med mittlinjen och omedelbart kaudalt om pronephric njurglomerulus, medan vissa steroidogena celler börja migrera tvärs över mittlinjen och bildar en utskjutande kant från den dorsala vyn. Den steroidogena vävnad är nära förknippad med rygg aorta (DA) och bakre kardinal ven (PCV).
Den 3β-HSD enzymatisk aktivitet analys på Tg (kdrl: GFP) s843 embryon får en tydlig avgränsning av peri-interrenal fartyg, inklusive DA, PCVOch interrenal kärl (IRV, Figur 2). Vibratom delar av 3β-HSD aktivitets färgade embryon utsattes för IHC analys för detektering av extracellulära matrisproteinet fibronektin och dess nedströms effektor fosforylerad Focal Adhesion Kinase. Den peri-DA avsättning av fibronektin är en förutsättning för IRV tillväxt 18.
Figur 1: Hela-mount 3β-HSD-aktivitet färgning utfördes på zebrafisk som uttrycker fluorescerande reportrar. Rygg (vänster paneler) och dorsolaterala (höger sida) vyer av en 3β-HSD-aktivitet-färgade Tg (wt1b: GFP) LI1, Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryo vid 34 HPF, som gör det möjligt att visualisera den relativa rumsliga fördelningen av interrenal vävnad (IR), pronephric glomerulus (PG), pronephric tubuli (PT), dorsal aorta (DA), lateral ryggaorta (LDA), och bakre kardinal ven (PCV). På grund av placeringen av interrenal vävnaden vid detta skede dorsolaterala utsikten är från den högra sidan av embryot. D, rygg; V, ventrala; A, anterior; P, posterior; R, höger; L, vänster. Skalstreck = 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Vibratome sektionering och IHC analys av 3β-HSD-aktivitet-färgade Tg (kdrl: GFP) s843 embryon. Den 34-HPF embryo utsattes för en 3β-HSD enzymatisk aktivitet analys och sedan vibratome sektionering. Den 3β-HSD-aktivitet positiva sektionen färgades genom att dubbel IHC med kanin-anti-humant fibronektin (Fn; 1/200) och mus-anti-human-fosforylerad fokaladhesion kinas (pFak; pY397, 1/100). Den tvärgående sektionen visar den relativa fördelningen av de interrenal vävnad (IR) och dess grann fartyg, inklusive den dorsala aortan (DA), posterior cardinal ven (IRV) och posterior cardinal ven (PCV). NT, neurala röret; NC, notokord; S, somit. Skalstreck = 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| förrådskoncentration | I 1000 il | slutkoncentration | |
| Del A. | |||
| DMSO | 40 ^ | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 pl | 0,1 mg / ml |
| NAD | 1,2 mg / ml | 10 pl | 12 | ig / ml |
| Del B. | |||
| PBST | 936 | il | ||
| vitamin B3 | 50 mg / ml | 2 ^ | 0,1 mg / ml |
| NBT | 50 mg / ml | 2 ^ | 0,1 mg / ml |
Tabell 1: Komponenter i 3β-Hsd färgreaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Signalstyrkan för den 3β-HSD-aktivitet ökade under loppet av reaktionen. Tydliga signaler från 3β-HSD-aktivitet detekterades efter 4 timmars reaktion för stegen från 28 HPF framåt. Kräver emellertid reaktionstiden empiriska bestämningen, beroende på syftet med analysen. I de fall där färgningen kräver över natten bearbetning, tenderar en något blåaktig bakgrund att utveckla på proverna. Detta problem kan övervinnas genom att öka fixerings varaktighet (t.ex., 4 h i 4% PFAT vid RT) innan 3β-HSD-aktivitet färgning. Däremot overfixation, såsom fastställande för över natten med 4% PFAT vid RT, leder till en extremt klar bakgrund. Skulle emellertid längre tid att krävas för att erhålla en önskvärd intensiteten hos signalen. Vi märkte att fastställande av proverna över natten med 2% i stället för 4% PFAT före 3β-HSD-aktivitet färgning typiskt ger mer önskvärda resultat i en efterföljande fluorescerande reporter observation eller jagHC-analys. Men om fastställande av embryon med 4% PFAT tillåter en snabb analys av 3β-HSD-aktivitet (avslutad inom en dag) och skulle därmed gynna genetiska eller kemiska skärmar som riktar sig interrenal steroidogena vävnader.
Post-fastställande av embryon efter 3β-HSD-aktivitet färgning är viktigt eftersom spårmängder av kemiska komponenter tenderar att kvarstå i de färgade proverna även efter omfattande tvättning och skulle resultera i hög bakgrund efter en lång lagringstiden. Men om 3β-HSD aktivitets färgade embryon att utsättas för ytterligare IHC analys, lagra 3β-HSD-aktivitet-färgade och tvättas embryon vid 4 ° C över natten inte resulterar i en märkbar förbättring av bakgrunden.
In situ-hybridisering (ISH) analys av 3β-HSD-aktivitet-färgade embryon är möjlig. Till exempel är uttryck av prox1 transkript samlokaliserades med 3β-HSD-aktivitet vid steroidogenic vävnad 10. För att utföra 3β-HSD-aktivitet färgning förutom ish, måste embryona fixeras i 4% PFAT under 4 timmar både före och efter 3β-HSD-aktivitetsanalys det så att cellulära RNA-transkript kan bevaras med önskvärd kvalitet för ISH-analys.
ISH-analys genom att använda riboprober av ff1b, cyp11a1, hsdb1, och stjärnan har tillämpats i utvecklingsstudier av interrenal steroidogena vävnads 1,2,11. Riboproben av ff1b upptäcker primordiala interrenal celler med 22 HPF, medan de cyp11a1 och stjärna detektera differentiering interrenal celler med 24 HPF. Jämfört med 3β-HSD histokemisk färgning som bara upptäcker differentierade interrenal vävnader från 28 HPF framåt, kan ISH-analys användas för att analysera ett spektrum av interrenal specifika gener i både primordial och differentierade interrenal celler. Ändå 3β-HSD histokemisk färgning haär fördelen av att vara enkel, snabb och tillförlitlig för att analysera fenotypen av differentierade steroidogena interrenal vävnad, och därför är ett kraftfullt verktyg för detaljerade utvecklingsstudier samt storskaliga genetiska eller kemiska skärmar. Enligt vår genomgång av relevant litteratur, finns det ingen specifik antikropp som på ett tillförlitligt sätt kan detektera proteinuttryck på steroidogena interrenal vävnad genom immunohistokemi. Därför är 3β-HSD histokemiska färgningsmetoden särskilt användbara i avgränsar vävnaden och cellulär morfologi steroidogena interrenal vävnaden.
Även 3β-HSD histokemisk färgning är användbar för visualisering av den differentierade steroidogena interrenal vävnad, inte direkt rapporterar steroid syntes kapacitet eller funktionalitet interrenal celler. Mutationer eller kemikalier som påverkar enzymer uppströms eller nedströms 3β-HSD i steroidogena syntes kaskaden får intenödvändigtvis detekteras med detta beskrivna metoden, eftersom de kan eller inte kan störa antingen storlek eller morfologi interrenal vävnad. Därför bör användare av detta protokoll ha i åtanke att vissa enzymatiska nedsättningar påverkar funktion men inte morfologi interrenal vävnad kan inte lätt detekteras genom denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Christoph Englert och professor Didier Stainier för Gifting Tg (wt1b: GFP) LI1 och Tg (kdrl: EGFP) s843 stammar, respektive, och Taiwan Zebrafish Core Facility för att tillhandahålla Tg (kdrl: mCherry) CI5. Denna studie har finansierats med bidrag från Taiwans ministeriet för vetenskap och teknik (96-2628-B-029-002-My3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-My3, 102- 2321-B-400 till 018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W.
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
