Summary
Den interrenal kirtel i zebrafisk er teleostean modstykke til pattedyr binyrerne. Denne protokol introducerer hvordan du udfører den 3-β-hydroxysteroiddehydrogenase (Δ 5-4 isomerase; 3β-HSD) enzymatisk aktivitet assay, der detekterer differentierede steroidogene celler i udviklingslandene zebrafisk.
Introduction
Binyrerne, en afgørende komponent i hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen, udskiller steroider og koordinerer steroid homeostase og den kropslige reaktion på stress. Binyrerne omfatter den ydre cortex, som udskiller steroider i en zone-specifik måde, og indre medulla, som syntetiserer catecholaminer. Den interrenal kirtel i benfisk er modstykket til binyrerne i pattedyr, og er sammensat af steroidogene interrenal og kromaffinceller, som er funktionelle ækvivalenter af binyrebarken og medulla henholdsvis 1-3. Undersøgelser udført ved hjælp af zebrafisk model har rapporteret, at både steroidogene og chromaffin cellelinier er dannet af molekylære og cellulære mekanismer meget ligner dem i pattedyr 1,2. Derfor er zebrafisk er et potentielt magtfuldt model til at studere genetiske sygdomme, neuroendokrine kontrol og systemer biologi hypothalamus-hypofyse-binyre (interrenal) akse.
4,5. 3β-HSD er afgørende for biosyntese af alle klasser af hormonale steroider, nemlig progesteron, glucocorticoider, mineralcorticoider, androgener og østrogener. De to menneskelige 3β-HSD isozymer HSD3B1 og HSD3B2 udtrykkes forskelligt 6. HSD3B1 udtrykkes i placenta og perifere væv, mens HSD3B2 udtrykkes i binyrebarken og gonader. Menneskelig HSD3B1 og HSD3B2 er co-ortologer af zebrafisk hsd3b1, som udtrykkes ved interrenal væv og voksne gonader; zebrafisk hsd3b2 er et maternelt udtrykt gen, hvis udskrifter forsvinder før organogenese 7. Protokollen for hel-mount 3β-HSD enzymatisk aktivitet assay for zebrafisk blev udviklet ved at modificere Levy metode, ens beskrevet af Milano et al. På frosne snit af otte teleost arter 8. På grund af vævet permeabilitet og optisk transparens af det udviklende zebrafisk, hel-mount 3β-HSD histokemi held kan anvendes til den faste zebrafisk embryoner og larver og specifikt afgrænse de differentierede interrenal væv.
Dette følsomme og hurtige assay er blevet anvendt på forskellige mutanter og morphants udvise forskellige typer interrenal dysmorphogenesis. Den interrenal 3β-HSD-aktivitet er fraværende i embryo hvor specifikation af interrenal væv forstyrres gennem en særlig knockdown af Ff1b transskription faktor, og er faldet, idet interrenal differentiering er påvirket af en knockdown af Ff1b coregulator Prox1 9,10. Især kan detekteres 3β-HSD-aktivitet i mutanter med alvorlige fase defekter tidligt, såsom enøjet pinhead og skele, hvor 3β-Hsd histokemi skildrer hvordan interrenal cellevandring påvirkes 11. Differentieringen af interrenal væv ikke kompromitteres, selv i den fuldstændige mangel på blod og kar. Derfor, hvordan endotelafledt signaler forme udvikle interrenal organ kan bestemmes 12,13. Alt i alt har denne histokemisk assay med succes blevet brugt til at studere specifikation, differentiering og migration af steroidogene celler i zebrafisk model. Derfor bør det være et effektivt og pålideligt værktøj til eventuelle genetiske eller kemiske skærme rettet mod adrenale og interrenal orgel lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle eksperimentelle procedurer på zebrafisk blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Tunghai University (IRB Godkendelse NO 101-12.) Og udføres i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
1. Stock Løsninger til 3β-HSD Enzymatisk aktivitet Farvning
- Forbered trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml i dimethylsulfoxid (DMSO)].
- Forbered β-Nikotinamidadenindinucleotid hydrat (1,2 mg / ml i 0,1 M phosphatpuffer, pH 7,2).
- Forbered nicotinamid (vitamin B3, 50 mg / ml i H2O).
- Forbered 4-nitro blå tetrazolium (50 mg / ml i 70% dimethylformamid).
- Alikvote alle disse komponenter i mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
BEMÆRK: Det er vores erfaring, gentagen nedfrysning og optøning af portioner af alle de førnævnte løsninger ikke påvirker intensiteten af 3β-HSD-aktivitet farvning.
2. Whole-mount 3β-HSD Activity Farvning
BEMÆRK: 3β-HSD enzymatisk aktivitet kan påvises i zebrafisk embryoner så tidligt som 28 timer efter befrugtning (HPF), når dyrket ved 28,5 ° C, hvilket er i overensstemmelse med debut af mRNA ekspression af hsd3b1 2,7. Hele-mount 3β-HSD-aktivitet farvning protokol i denne undersøgelse er baseret på en tidligere beskrevet metode 8 og blev bestemt til at være en succes i udviklingslandene zebrafisk op til 7 dage efter befrugtning 9. Til analyse af vaskulær mikromiljø interrenal steroidogeniske væv, hel-mount 3β-HSD-aktivitet farvning skal anvendes på transgene linjer udtrykker endothel-specifik fluorescens, såsom Tg (kdrl: EGFP) s843 14 og Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . For at analysere den interrenal steroidogene væv overvejer zebrafisk nyre udvikling, kan 3β-HSD-aktivitet farvning være ansøged til Tg (wt1b: GFP) LI1 fisk 16, hvor dannelsen af glomerulus og tubuli pronephric afgrænses.
- Behandl udvikle zebrafisk de inkuberes i 0,03% phenylthiourea i æg vand (0,06 mg / L reef salt i deioniseret vand) ud fra en fase mellem 12 og 24 HPF, at inhibere pigment formation.
- Fix dechorionated embryoner eller larver i (A) 4% paraformaldehyd (PFA) i phosphatbufret saltvand (PBS) suppleret med 0,1% Tween 20 (PFAT) i 1 time ved stuetemperatur (RT) eller (B) 2% PFAT natten over ved 4 ° C eller i 2 timer ved 4 ° C efterfulgt af 4 timer ved stuetemperatur.
Advarsel: PFA er giftig ved indånding og ved kontakt med huden. Det er ødelæggende for hud, slimhinder, øjne og øvre luftveje. - Vask embryoner 4x i 10 minutter med PBS suppleret med 0,1% Tween 20 (PBST) ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det er vigtigt at ikke tørre prøverne, mens du udskifter vask løsninger. - Frisk forberede stalingen opløsning før reaktionerne (tabel 1). Forbered, vortex, og centrifuger del A og B i separate rør.
BEMÆRK: Tilføjelse alle komponenter lige ind et enkelt rør ville forårsage alvorlig nedbør. - Tilføje hele opløsning af del A til hele opløsning af del B, bland godt at forberede farvningsopløsningen, og straks distribuere 1 ml i hver mikrofugerør indeholdende faste og vaskede embryoner.
- Wrap mikrocentrifugerør med aluminiumfolie for at beskytte dem mod lys og sted på enten en rotator eller en vippende platform for forsigtig rystning ved stuetemperatur.
- Empirisk bestemmelse af reaktionstiden ved at overvåge chromogene signaler gennem mikroskopi. Mindre nedbør vil udvikle sig over tid; de vil dog ikke forstyrrer reaktionen processen.
BEMÆRK: For embryoner fastsat til 28 HPF, farvning ved 25 ° C i 4 timer genererer et klart signal på interrenal væv. - Reaktionen standses ved vaskning 4x i 10 minutter i PBST. jegf kræves der ingen yderligere immunhistokemisk (IHC) analyse, post-fix de farvede embryoner med 4% PFAT i 60 minutter ved stuetemperatur. Ellers gemme de vaskede embryoner ved 4 ° C indtil videre brug.
- For hel-mount mikroskopi, rydde de farvede, post-faste, og vaskede embryoner med 50% glycerol i PBS, orientere dem med dorsale opad på et dias, og observere bruge en opretstående mikroskop under lyse belysning felt.
BEMÆRK: For at gøre en høj opløsning billede af interrenal væv morfologi, fladskærms-mount analyse af 3β-HSD-aktivitet-farves og deyolked embryo anbefales. Som det interrenal steroidogene væv er placeret lige over blommesækken, en ventral flad-mount analyse af interrenal væv tillader en direkte og klar observation af interrenal morfologi 17.
3. IHC Analyse af 3β-HSD Aktivitet-farvede embryoer
BEMÆRK: For at analysere den vaskulære mikromiljø af steroidogenic væv, er 3β-HSD aktivitet-farvede embryoner med en transgen endotel-specifikke fluorescerende reporter udsat for tværgående vibratome sektionering og efterfølgende IHC-analyse 12,18.
- Post-fiksering
- Post-fastsætte 3β-HSD-aktivitet-farvede og vaskede embryoner med 2% PFA suppleret med 1% Triton X-100 i 1 time ved 4 ° C og vask 4x i 10 minutter i PBS indeholdende 1% Triton X-100 (PBSTx) ved stuetemperatur.
- indlejring
- Forbered 4% lavtsmeltende agarose ved at opløse agarose i PBS ved 95 ° C, alikvot i mikrocentrifugerør, og opbevares ved 4-8 ° C.
- Smelt en alikvot af 4% lavtsmeltende agarose ved 70 ° C i 10 minutter, og derefter holde portionen på 47 ° C. Integrer hver embryo i smeltet 4% lavtsmeltende agarose i en fritliggende hætte af en 1,5 ml mikrocentrifugerør, der tjener som en form, og lad den køle indtil fast.
- vibratome Sektionsinddeling
- Stick et stykke papir tape til den tørre platform af vibratome.
- Fjern den hærdede agarose blok fra formen ved et barberblad. Påfør superlim til papiret tape på platformen, og fastgør den agarose blokken på papiret tape, med den forreste side af prøven opad. Trimme agarose blok til en trapezformet prismeform, med ca. 4 mm og 8 mm på hver side af de øvre og nedre facetter hhv.
- Det skylles derefter indeholdende agarose blok med kold PBS suppleret med 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) ved anvendelse af en pipette.
- Skær agarose blokken i 100 um snit i henhold til betjeningsvejledningen til vibratome. Konstant skylle agarose blok for at forhindre udtørring. Da hver skive skæres, fjerne det fra vibratome ved hjælp af en 26 G kanyle, og overføre til en spot plade indeholdende koldt 0,5% PBSTx (500 ul / brønd).
- Saml 3p-HSD aktivitet-positive vævssnit ved at kontrollere under en dissektion mikroskop, og overføre de sektioner ved en piPette spids med sin ende cut-off (ca. 1 mm indre diameter ved åbningen) i en 96-brønds plade indeholdende koldt 0,5% PBSTx (150 pl / brønd). Vævsprøverne sædvanligvis dissocierer fra agarosen blok efter dette trin.
- Permeabilisering og vask
- Vask skiverne 6x i 15 min i 0,5% PBSTx ved stuetemperatur, 10 minutter i PBS, og 4x i 10 minutter i PBS suppleret med 1% bovint serumalbumin / 1% DMSO / 0,1% Triton X-100 (PBDTx).
- Blokering
- Inkubér skiver i 1 time i 2% føtalt kalveserum (FCS) i PBDTx ved stuetemperatur.
- Primært antistof Reaction
- Inkuber skiverne i 1,5 dage i PBDTx indeholdende et primært antistof (fx kanin-polyklonalt anti-humant fibronectin og muse-anti-humant fokal adhæsion kinase) ved 4 ° C.
- Vask
- Vask skiverne 6x i 10 minutter i PBDTx ved stuetemperatur.
- Blokering
- Inkubér skiver for 1 time i 2% FCS i PBDTX ved stuetemperatur.
- Sekundær antistof-reaktion
- Inkubér skiver i 1,5 dage i PBDTx indeholdende et sekundært antistof (fluorofor-konjugeret gede-anti-kanin eller anti-mus IgG) ved 4 ° C.
- Vask
- Vask skiverne 6x i 10 minutter i PBDTx ved stuetemperatur og 4x i 10 minutter i PBST ved stuetemperatur.
BEMÆRK: For konfokal mikroskopisk analyse, rydde prøverne med 50% glycerol i PBS.
- Vask skiverne 6x i 10 minutter i PBDTx ved stuetemperatur og 4x i 10 minutter i PBST ved stuetemperatur.
4. Konfokal Analysis
- Overhold hele mount embryo og afsnittet med en konfokal mikroskop udstyret med 10X / 0,5 og 20X / 0,75 objektiv.
- For samtidig påvisning af fluorescensen og 3β-HSD-farvning, indstilles multitrack indstillingen som følger: 488 nm argon-laser og 505-530 nm båndpasfilter til påvisning af GFP; 543 nm Helium-Neon laser og 560-615 nm båndpasfilter til påvisning af mCherry; og transmitteret lys kanal til påvisning af 3β-HSD-farvning.Den pinhole størrelse er en Airey enhed, og opløsningen er 1024 x 1024 pixel.
- Saml z stakke (med 6 um interval) som en 3D-projektion, og flette projektion og lyse felt, ved at bruge den indbyggede konfokal software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme, hvordan de steroidogene interrenal væv codevelops med pronephric nyre glomerulus og dens spirende vaskulatur blev 3β-HSD enzymatisk aktivitet assay udført på den dobbelte transgene Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryo på 34 HPF (Figur 1). På dette stadium er det 3β-HSD-aktivitet-positive steroidogene væv placeret lige med midterlinjen og umiddelbart kaudalt for pronephric nyre glomerulus, mens nogle steroidogene cellerne begynder at migrere hen over midterlinjen og danner en udragende kant fra den dorsale visning. Den steroidogene væv er tæt forbundet med den dorsale aorta (DA) og posterior kardinal vene (PCV).
Den 3β-HSD enzymatisk aktivitet assay på Tg (kdrl: GFP) s843 embryoner tilladt en klar afgrænsning af de peri-interrenal fartøjer, herunder DA, PCVOg interrenal fartøj (IRV, figur 2). Vibratome dele af 3β-HSD aktivitet-farvede embryoner blev underkastet IHC-analyse til påvisning af ekstracellulært matrixprotein fibronectin og dets nedstrøms effektor phosphoryleret fokal adhæsionkinase. Den peri-DA aflejring af Fibronectin er afgørende for at understøtte IRV vækst 18.
Figur 1: Whole-mount 3β-HSD aktivitet farvning udført på zebrafisk udtrykke fluorescerende reportere. Dorsal (venstre paneler) og dorsolaterale (højre paneler) udsigt over en 3β-HSD-aktivitet-farvet Tg (wt1b: GFP) LI1, Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryo på 34 HPF, som gør det muligt at visualisere den relative rumlige fordeling af interrenal væv (IR), pronephric glomerulus (PG), pronephric tubuli (PT), dorsale aorta (DA), lateral dorsaleaorta (LDA), og posterior kardinal vene (PCV). Grundet placeringen af interrenal væv på dette tidspunkt, dorsolaterale synspunkter er fra højre side af embryoet. D, dorsal; V, ventrale; A, anterior; P, posterior; R, højre; L, starter. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vibratome sektionering og IHC-analyse af 3β-HSD-aktivitet-farvet Tg (kdrl: GFP) s843 embryoner. Den 34-HPF embryon blev underkastet en 3β-HSD enzymatisk aktivitet assay og derefter vibratome skæring. Den 3β-HSD-aktivitet-positive afsnit blev farvet ved dobbelt IHC med kanin-anti-human fibronectin (Fn; 1/200) og muse-anti-humant phosphoryleret fokal adhæsion kinase (pFak, pY397, 1/100). Den tværgående afsnit viser den relative fordeling af interrenal væv (IR) og dets nabolande fartøjer, herunder den dorsale aorta (DA), posterior kardinal vene (IRV), og posterior kardinal vene (PCV). NT, neurale rør; NC, notochord; S, somit. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
| stamkoncentration | I 1000 pi | Endelig koncentration | |
| Del A. | |||
| DMSO | 40 pi | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 pi | 0,1 mg / ml |
| NAD | 1,2 mg / ml | 10 pi | 12 ug / ml |
| Del B. | |||
| PBST | 936 pi | ||
| B3-vitamin | 50 mg / ml | 2 pi | 0,1 mg / ml |
| NBT | 50 mg / ml | 2 pi | 0,1 mg / ml |
Tabel 1: Komponenter af 3β-HSD farvningsreaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Signalstyrken af 3β-HSD-aktivitet steg i løbet af reaktionen. blev påvist klare signaler af 3β-HSD-aktivitet efter 4 timers reaktion for stadier fra 28 HPF fremefter. Imidlertid kræver reaktionen varighed empiriske bestemmelse, afhængigt af formålet med analysen. I tilfælde, hvor farvningen kræver indlæggelse behandling, en lidt blålig baggrund tendens til at udvikle på prøverne. Dette problem kan overvindes ved at øge varigheden fiksering (fx 4 timer i 4% PFAT ved stuetemperatur), før 3β-HSD-aktivitet farvning. Derimod overfixation, såsom fastsættelse for natten over med 4% PFAT ved stuetemperatur, fører til en meget klar baggrund. Imidlertid ville længere tid være påkrævet til opnåelse af en ønskelig intensitet af signalet. Vi bemærkede, at fastsættelse af prøverne natten over med 2% og ikke 4% PFAT før 3β-HSD-aktivitet farvning typisk giver mere ønskelige resultater i en efterfølgende fluorescerende reporter observation eller jegHC-analyse. Men om fastsættelse af embryoner med 4% PFAT tillader en hurtig analyse af 3β-HSD-aktivitet (afsluttet inden for 1 dag) og vil således gavne genetiske eller kemiske skærme rettet mod interrenal steroidogene væv.
Post-fastsættelse af embryoner efter 3β-HSD-aktivitet farvningen er afgørende, fordi spormængder af kemiske komponenter tendens til at vare i de farvede prøver selv efter omfattende vask og ville resultere i høj baggrund efter en lang lagring varighed. Men hvis 3β-HSD aktivitet-farvede embryoner skal underkastes yderligere IHC analyse, lagring af 3β-HSD-aktivitet-farves og vasket embryoner ved 4 ° C natten over ikke resulterer i en mærkbar forøgelse af baggrunden.
In situ-hybridisering (ISH) analyse af 3β-HSD aktivitet-farvede embryoner er mulig. For eksempel er ekspressionen af prox1 transkripter colocalized med 3β-HSD-aktivitet ved steroidogenic væv 10. For at udføre 3β-HSD-aktivitet farvning udover ish, skal embryonerne være fikseret i 4% PFAT i 4 timer både før og efter 3β-HSD-aktivitet assay, således at cellulær RNA-transkripter kan bevares med ønskelig kvalitet til ISH analyse.
ISH-analyse ved hjælp af riboprober af ff1b, CYP11A1, hsdb1, og stjerne er blevet anvendt i de udviklingsmæssige undersøgelser af interrenal steroidogene væv 1,2,11. Riboproben af ff1b registrerer primordiale interrenal celler med 22 HPF, mens de CYP11A1 og stjerne opdage differentiere interrenal celler ved 24 HPF. Sammenlignet med 3β-HSD histokemisk farvning, som kun detekterer differentierede interrenal væv fra 28 HPF fremefter, kan ISH analyse anvendes til at analysere et spektrum af interrenal-specifikke gener i både primordiale og differentierede interrenal celler. Alligevel 3β-HSD histokemisk farvning har den fordel at være enkel, hurtig og pålidelig til at analysere fænotypen af den differentierede steroidogene interrenal væv, og derfor er et stærkt værktøj til detaljerede udviklingsmæssige undersøgelser samt store genetiske eller kemiske skærme. Som pr vores gennemgang af relevant litteratur, der ikke findes nogen specifik antistof, som pålideligt kan detektere proteinekspression på steroidogene interrenal væv gennem immunhistokemi. Derfor er 3β-HSD histokemisk farvning metode er særligt nyttigt i afgrænse vævet og cellulære morfologi steroidogene interrenal væv.
Selvom 3β-HSD histokemisk farvning er nyttig til visualisering af den differentierede steroidogeniske interrenal væv, betyder det ikke direkte rapportere steroid syntese evne eller funktionalitet interrenal celler. Mutationer eller kemikalier, der påvirker enzymer opstrøms eller nedstrøms 3β-HSD i steroidogene syntese kaskade må ikkenødvendigvis påvises med denne beskrevne fremgangsmåde, da de kan eller ikke kan forstyrre enten størrelse eller morfologi interrenal væv. Derfor bør brugere af denne protokol huske på, at visse enzymatiske nedskrivninger påvirker funktion, men ikke morfologi interrenal væv kan ikke umiddelbart påvises ved denne metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker professor Christoph Englert og Prof. Didier Stainier for gifting Tg (wt1b: GFP) LI1 og Tg (kdrl: EGFP) s843 stammer henholdsvis og Taiwan zebrafisk Core Facility for at give Tg (kdrl: mCherry) CI5. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Taiwans Ministeriet for Videnskab og Teknologi (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
