Summary
在斑马鱼的interrenal腺是哺乳动物的肾上腺的硬骨鱼类的对应。此协议引入了如何执行3-β羟基类固醇脱氢酶（Δ5-4异构酶;3β-HSD）的酶活性测定法，其检测在显影斑马鱼分化类固醇合成的细胞。
Introduction
肾上腺，下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴的重要组成部分，分泌类固醇和类固醇协调平衡和身体应激反应。肾上腺包括外皮层，可分泌类固醇在特定区域的方式，和内髓质，其中合成儿茶酚胺。在硬骨鱼的interrenal腺是在哺乳动物中肾上腺的对应，并且由类固醇合成interrenal和嗜铬细胞，这是分别1-3肾上腺皮质和髓质，功能等价物。已经使用斑马鱼模型进行的研究报告，这两个类固醇和嗜铬细胞谱系是由分子和细胞机制高度类似于那些在哺乳动物1,2-形成。因此，斑马鱼是研究的遗传性疾病，神经内分泌控制和下丘脑 - 垂体 - 肾上腺（interrenal）轴的系统生物学潜在强大的模型。
4,5-转换，和雄烯二酮。 3β-HSD为生物合成的激素类固醇，即孕酮，糖皮质激素，盐皮质激素，雄激素，和雌激素的所有类重要的。两个人3β-HSD同工酶HSD3B1和HSD3B2差异表达6。 HSD3B1在胎盘和外周组织中表达，而HSD3B2在肾上腺皮质和性腺表达。人类HSD3B1和HSD3B2是斑马鱼HSD3B1，这是在interrenal组织和成人性腺表达的共同的直向同源物;斑马鱼hsd3b2是一个母系基因表达的转录的器官前7消失。在整个安装3β-HSD酶活性测定斑马鱼的方案，通过修改利维的方法发达，■通过米兰等描述。上八硬骨鱼类8种冰冻切片。因为组织渗透性和显影斑马鱼的光学透明的，整个安装3β-HSD组织化学可成功地用于固定斑马鱼胚胎和幼虫和具体划定分化interrenal组织。
这个敏感和快速的测定法已应用于各种突变体和morphants展示不同类型interrenal dysmorphogenesis的。所述interrenal3β-HSD活性在其中interrenal组织的规范是通过Ff1b转录因子的特定击倒打乱并作为interrenal分化由Ff1b coregulator Prox1的9,10的击倒影响被降低的胚胎不存在。值得注意的是，3β-HSD活性可在重症早期缺陷的突变体进行检测，如独眼针头和眯 ，其中3β-HSD组织化学界定了interrenal细胞迁移是如何影响11。所述interrenal组织的分化不即使在完全不存在的血液和血管损害。因此，内皮源性信号是如何塑造发展interrenal机关可确定12,13。总体而言，此组织化学测定法已被成功地用于在斑马鱼模型学习规范，分化和类固醇合成的细胞的迁移。因此，它应该是一个高效率和为任何遗传或化学屏幕定位肾上腺和interrenal器官障碍的可靠工具。
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Protocol
伦理声明：对斑马鱼的所有试验程序都经东海大学的机构动物护理和使用委员会（IRB批准文号101-12），并按照批准的指导方针进行。
1.3β-HSD酶的活性染色股票方案
- 制备反式dehydroandrosterone [10毫克/毫升的二甲亚砜（DMSO）。
- 制备β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（1.2毫克/毫升的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.2）。
- 准备烟酰胺（维生素B3，50毫克/毫升H 2 O）。
- 制备4-硝基蓝四唑（在70％的二甲基甲酰胺50毫克/毫升）。
- 分装所有这些组件到离心管并储存在-20°C。
注意：根据我们的经验，反复冷冻和所有上述解决方案的等分试样解冻不影响3β-HSD活性染色的强度。
2.W¯¯孔贴装3β-HSD活性染色
注：3β-HSD的酶活性是在斑马鱼胚胎检测早28个小时后受精（HPF）培养时在28.5℃下，它是与HSD3B1 2,7- mRNA表达的开始相一致。在这项研究中整个安装3β-HSD活性染色协议是基于一个先前描述方法8和被确定为成功的显影斑马鱼7天受精后9。用于分析interrenal类固醇生成组织的血管的微环境，整个安装3β-HSD活性染色必须应用到转基因株系表达特定内皮荧光，例如为Tg（kdrl：EGFP）S843 14和TG（kdrl：mCherry）CI5 15 。为了分析interrenal类固醇生成组织考虑斑马鱼肾脏发育，3β-HSD活性染色可APPLI编到的Tg（wt1b：GFP）LI1鱼16，其中肾小球和pronephric小管的形成划定。
- 在鸡蛋水0.03％苯基硫脲培养他们（在去离子水0.06毫克/升礁盐）治疗发展斑马鱼，从12和24之间HPF一个阶段开始，抑制色素形成。
- 在补充有0.1％吐温20（PFAT）在室温下（RT）或（B）2％PFAT 1小时过夜磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定在（A）中的4％多聚甲醛（PFA）dechorionated胚胎或幼虫4℃或在4℃下2小时，接着在RT 4小时。
注意：PFA是通过吸入和皮肤接触有毒。它是破坏性的皮肤，粘膜，眼睛和上呼吸道。 - 洗胚胎4倍10分钟，用PBS补充有在RT 0.1％吐温20（PBST）。
注意：这是在改变洗涤溶液不干燥样品的关键。 - 刚准备站反应之前进不去溶液（ 表1）。准备，旋涡，并在不同的离心管A和B部分。
注意：添加所有组件直接到一个单管会引起强降水。 - A部分的整个解决方案添加到B部分的整个解决方案，拌匀准备染色液，立即分发1毫升到含有固定的，洗的胚胎各离心管。
- 包裹离心管用铝箔保护他们免受光和地方在任一个旋转或轻微振荡在RT摇摆平台。
- 凭经验确定通过显微镜监测显色信号的反应时间。轻微降水将随着时间的发展;但是，它们将不与反应过程产生干扰。
注：对于胚胎固定在28 HPF，染色在25℃下4小时产生在interrenal组织的明确信号。 - 停止洗涤4倍于在PBST 10分钟的反应。一世f被不需要进一步免疫组织化学（IHC）分析，后固定染色的胚胎，用4％PFAT在RT 60分钟。否则，在4℃下保存的胚胎冲洗，直到进一步使用。
- 对于全安装显微镜，清除染色，后固定，洗胚胎在PBS 50％甘油，投影片上朝上背侧定位它们，并使用在明亮的视场照明正置显微镜观察。
注意：为了使interrenal组织形态的高分辨率图像，平面安装3β-HSD活性染色和deyolked胚胎的分析，建议。由于interrenal类固醇合成组织定位正确的卵黄囊上述情况，interrenal组织的腹平贴分析允许interrenal形态17的直接和清晰的观察。
3.3β-HSD活性染色胚胎IHC分析
注：为了分析steroi的血管微环境dogenic组织，用转基因特异性内皮荧光报道的3β-HSD活性染色的胚胎经受横向vibratome切片和随后的免疫组织化学分析12,18。
- 后固定
- 在4℃下后固定3β-HSD活性染色和洗涤胚胎用2％PFA补充有1％的Triton X-100 1小时并洗4倍于含有1％Triton X-100的10分钟的PBS（PBSTx）在室温。
- 嵌入
- 制备4％的在PBS琼脂糖溶解在95℃下，分装成微量离心管，并存储在4-8℃的琼脂糖低熔点。
- 熔体4％低熔点琼脂糖的等分试样在70℃下进行10分钟，然后保持等分试样在47℃。嵌入每个胚在熔融4％琼脂糖低熔点在用作一个模具1.5 ml离心管的分离的盖子，并允许冷却，直到固体。
- Vibratome切片
- 坚持一纸胶带到干p在vibratome的latform。
- 由一个刀片除去从模具硬化琼脂糖块。应用强力胶到平台上的纸带，并琼脂糖块固定到所述纸带，具有朝上的样品的前侧。修剪琼脂糖块为梯形棱镜的形状，分别与大约4毫米，在上部和下部小面的每个侧8毫米。
- 通过使用滴管冲洗用冷PBS将含有样品的琼脂糖块补充有0.5％的Triton X-100（0.5％PBSTx）。
- 根据vibratome的使用说明书切片琼脂糖块成100微米的部分。不断冲洗琼脂糖块，防止干燥。由于每片被切断，用＆G注射器针头从vibratome删除它，转移到冷含0.5％PBSTx（500微升/孔）现货板。
- 通过解剖显微镜下检查收集3β-HSD活性阳性的组织切片，并通过PI传送节佩特前端以其端截止（约1mm的开口内径）到含有冷0.5％PBSTx（150微升/孔）在96孔板中。的组织样品通常从该步骤后的琼脂糖块解离。
- 通透性和洗
- 洗片6倍于室温在0.5％PBSTx 15分钟，在PBS中10分钟，和4倍于在PBS中10分钟补充有1％牛血清白蛋白/ 1％DMSO / 0.1％的Triton X-100（PBDTx）。
- 闭塞
- 孵育在PBDTx 1小时2％胎牛血清（FCS）在RT切片。
- 主要抗体反应
- 孵育切片1.5天在PBDTx含有第一抗体（ 例如 ，兔多克隆抗人纤连蛋白和小鼠抗人粘着斑激酶）在4℃下。
- 洗涤
- 洗净切片6倍在RT在PBDTx 10分钟。
- 闭塞
- 孵育1小时的切片在PB 2％FCS的DTx中在室温。
- 二级抗体反应
- 在4℃下孵育1.5天在PBDTx含有二级抗体（荧光团缀合的山羊抗兔或抗小鼠IgG）的片。
- 洗涤
- 洗片6倍于RT在PBDTx 10分钟和4倍，在室温在PBST 10分钟。
注：对于共焦显微镜分析，用PBS中的50％甘油清除样品。
- 洗片6倍于RT在PBDTx 10分钟和4倍，在室温在PBST 10分钟。
4.共聚焦分析
- 观察整个安装胚胎，并配备了10X / 0.5和20X / 0.75的物镜共聚焦显微镜的部分。
- 对于荧光和3β-HSD染色同时检测，设置如下多轨模式：488nm的氩激光和检测GFP的505-530纳米带通滤波器; 543纳米的氦氖激光器和用于检测mCherry的560-615纳米的带通滤波器;并传输用于检测3β-HSD染色的光信道。针孔的大小是1艾雷单元，分辨率为1024×1024像素。
- 组装的Z堆叠（具有6微米的间隔），为3D投影，并合并突起和明场，通过使用内置的共聚焦软件。
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Representative Results
要确定如何与pronephric肾小球及新生血管的生成类固醇interrenal组织codevelops中，3β-HSD酶活性测定的双转的Tg（wt1b：GFP）进行LI1;的Tg（kdrl：mCherry）CI5胚胎在34 HPF （ 图1）。在这个阶段，3β-HSD活性阳性类固醇合成组织位于右向中线，并立即尾鳍到pronephric肾小球，而一些类固醇合成细胞开始跨越中线迁移并形成从背视图一个突出边缘。的类固醇合成组织紧密地与背主动脉（DA）和后部主静脉（PCV）相关联。
上的Tg（kdrl：GFP）的3β-HSD酶活性测定胚胎S843允许围interrenal船只的明确界定，包括DA，PCV和interrenal容器（IRV; 图2）。的3β-HSD活性染色的胚胎Vibratome切片进行IHC分析，用于检测所述细胞外基质蛋白纤连蛋白和其下游效应磷酸粘着斑激酶。纤维连接蛋白的围DA沉积是支持IRV增长18是必不可少的。
图1： 整个安装对斑马鱼表达荧光记者进行3β-HSD活性染色。背（左图）和背侧（右图）美景的3β-HSD活性染色的Tg（wt1b：GFP）的LI1; Tg的（kdrl：mCherry）在34 HPF CI5胚胎，它允许可视化interrenal的相对空间分布组织（IR），pronephric肾小球（PG），pronephric管（PT），背主动脉（DA），足背外侧主动脉（LDA）和后部主静脉（PCV）。由于在此阶段interrenal组织的位置，背外侧观点从胚胎的右侧。 D，背; V，腹; A，前壁; P，后路; R，右; L，离开了。比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：Vibratome 切片和3β-HSD活性染色 的Tg（kdrl：GFP） 的IHC分析 S843 胚胎 。 34 HPF胚胎进行一个3β-HSD的酶活性测定法，然后vibratome切片。的3β-HSD活性阳性部分是由双IHC染色用兔抗人纤连蛋白（FN; 1/200）和小鼠抗人磷酸粘着斑激酶（pFak; pY397，1/100）。横截面示出了interrenal组织（IR）和其相邻的船只，包括背主动脉（DA），后主静脉（IRV）和后主静脉（PCV）的相对分布。 NT，神经管; NC，脊索; S，体节。比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 股权集中度 | 在1000微升 | 最终浓度 | |
| A部分： | |||
| DMSO | 40微升 | ||
| DHEA | 10毫克/毫升 | 10微升 | 0.1毫克/毫升 |
| NAD | 1.2毫克/毫升 | 10微升 | 12微克/毫升 |
| B部分 | |||
| PBST | 936微升 | ||
| 维生素B3 | 50毫克/毫升 | 2微升 | 0.1毫克/毫升 |
| NBT | 50毫克/毫升 | 2微升 | 0.1毫克/毫升 |
表1：3β-HSD染色反应的成分。
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Discussion
的3β-HSD活性的信号强度增加了反应过程。 4小时从28 HPF向前阶段反应后，检测所述3β-HSD活性的明确信号。然而，反应的持续时间，需要经验确定，这取决于测定的目的。在染色要求夜间处理的情况下，略微偏蓝的背景往往对样品开发。这个问题可以通过3β-HSD活性染色之前增加注视时间（ 例如 ，在在RT 4％PFAT 4小时）来克服。相比之下，overfixation，如固定过夜与RT 4％PFAT，导致了一个非常清晰的背景。然而，较长的时间就需要获取的信号的希望的强度。我们注意到，3β-HSD活性染色之前过夜，用2％，而不是4％PFAT定影样品通常产生在随后的荧光报告观察或我更理想的结果HC分析。然而，4％PFAT固定胚胎允许3β-HSD活性（1天之内完成）的快速检测，并会因此遗传或化学屏幕瞄准interrenal类固醇组织受益。
3β-HSD活性染色后后固定胚胎是必不可少的，因为化学成分的微量往往即使经过充分洗涤染色样品中坚持并会导致长期存放时间后高的背景。然而，如果3β-HSD活性染色胚要经受进一步IHC分析，存储3β-HSD活性染色，并在4℃下洗涤胚胎过夜不会导致在后台的一个显着的提高。
在 3β-HSD活性染色胚胎原位杂交（ISH）分析是可能的。例如，Prox1的转录物的表达是在steroidogen共定位与3β-HSD活性IC组织10。去除了执行3β-HSD活性染色到ISH，胚胎必须固定在4％的PFAT为前和3β-HSD活性测定后，使细胞RNA转录物可以与用于ISH分析期望质量被保留4小时。
通过使用ff1b，CYP11A1，hsdb1，和明星的核糖核酸探针的ISH分析已在interrenal类固醇1,2,11组织的发育研究中得到应用。 ff1b的核糖体探针检测原始interrenal细胞22 HPF，而CYP11A1和明星的检测由24 HPF分化interrenal细胞。相比，3β-HSD组织化学染色仅检测来自28 HPF起分化interrenal组织，ISH分析可用于分析的interrenal特异性基因的频谱中两个原始和分化interrenal细胞。尽管如此，3β-HSD组织化学染色公顷的S是简单，快速和可靠的，用于分析所述分化类固醇interrenal组织的表型的优势，并且因此是用于详细发育研究的强有力的工具，以及大规模的遗传或化学屏幕。根据我们的相关文献复习，不存在能够可靠地通过免疫组化检测在类固醇interrenal组织中的表达特异性抗体。因此，3β-HSD组织化学染色的方法是在划定组织和类固醇合成interrenal组织的细胞形态特别有用。
虽然3β-HSD组织化学染色为分化的类固醇interrenal组织的可视化是有用的，它并不直接报告类固醇合成的能力或interrenal细胞功能。突变或化学影响上游或3β-HSD的下游在类固醇合成级联酶可能不一定与该所述方法被检测到，因为它们可能会或可能不会干扰任一大小或interrenal组织的形态。因此，该协议的用户应牢记，影响某些酶的损伤作用，但interrenal组织形态没有可能不会用这种方法很容易检测。
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Acknowledgments
我们感谢克里斯托夫·恩格勒特教授和Didier Stainier教授送礼的的Tg（wt1b：GFP）LI1和TG（kdrl：EGFP）S843 株，分别与台湾斑马鱼核心设施提供的Tg（kdrl：mCherry）CI5。这项研究是由赠款科技（96-2628-B-029-002-MY3，101-2313-B-029-001，102-2628-B-029-002-MY3台湾省，支持102- 2321-B-400-018）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
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