Summary
La glándula interrenal en el pez cebra es la contraparte teleósteos de la glándula adrenal de los mamíferos. Este protocolo presenta cómo realizar la deshidrogenasa 3-β-hidroxiesteroide (Δ 5-4 isomerasa; 3β-HSD) ensayo de actividad enzimática, que detecta las células esteroidogénicas diferenciadas en el pez cebra en desarrollo.
Introduction
La glándula suprarrenal, un componente crucial del eje hipotálamo-pituitario-adrenal, segrega esteroides y coordina la homeostasis de esteroides y la respuesta del cuerpo al estrés. La glándula suprarrenal comprende la corteza exterior, que segrega los esteroides de manera-zona específica, y médula interna, que sintetiza las catecolaminas. La glándula interrenal en teleósteos es la contraparte de la glándula suprarrenal en los mamíferos y se compone de células cromafines interrenal y androgénica, que son equivalentes funcionales de la corteza suprarrenal y la médula, respectivamente 1-3. Estudios llevados a cabo utilizando el modelo de pez cebra han informado de que los dos linajes de células esteroidogénicas y cromafines se forman por los mecanismos moleculares y celulares altamente parecidas a las de los mamíferos 1,2. Por lo tanto, el pez cebra es un modelo potencialmente poderosa para el estudio de enfermedades genéticas, el control neuroendocrino, y la biología de sistemas del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (interrenal).
4,5. 3β-HSD es esencial para la biosíntesis de todas las clases de esteroides hormonales, a saber, la progesterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, andrógenos y estrógenos. Los dos humana 3β-HSD isoenzimas hsd3b1 y HSD3B2 se expresan diferencialmente 6. Hsd3b1 se expresa en la placenta y en los tejidos periféricos, mientras que HSD3B2 se expresa en la corteza adrenal y las gónadas. Hsd3b1 humana y HSD3B2 son co-orthologs de hsd3b1 pez cebra, que se expresa en el tejido interrenal gónadas y adultos; HSD3B2 pez cebra es un gen expresado maternalmente cuyas transcripciones desaparecer antes de la organogénesis 7. El protocolo de todo el montaje en el ensayo de actividad enzimática 3β-HSD para el pez cebra fue desarrollado modificando el método de Levy,s descrito por Milano et al. , En secciones congeladas de ocho especies de teleósteos 8. Debido a la permeabilidad del tejido y la transparencia óptica del pez cebra en desarrollo, todo el montaje 3β-HSD la histoquímica se puede utilizar con éxito para el embrión del pez cebra fija y larvas y específicamente delinear los tejidos interrenal diferenciadas.
Este ensayo sensible y rápido se ha aplicado a diversos mutantes y morphants que demuestran diferentes tipos de dysmorphogenesis interrenal. La actividad 3β-HSD interrenal está ausente en el embrión, donde la especificación del tejido interrenal se interrumpe a través de una caída específica del factor de transcripción ff1b y se disminuyó a medida que la diferenciación interrenal se ve afectada por una caída de la coregulator ff1b Prox1 9,10. En particular, la actividad 3β-HSD se puede detectar en los mutantes con defectos severos en fase inicial, tales como una cabeza de alfiler de ojos y estrabismo, donde el 3β-Hhistoquímica sd delinea cómo la migración de las células se ve afectado interrenal 11. La diferenciación del tejido interrenal no se vea comprometida incluso en ausencia completa de la sangre y la vasculatura. Por lo tanto, cómo las señales derivadas del endotelio forma al órgano interrenal en desarrollo puede ser determinada 12,13. En general, este ensayo histoquímico ha sido utilizado con éxito para el estudio de la especificación, diferenciación y migración de las células esteroidogénicas en el modelo de pez cebra. Por lo tanto, debe ser un una herramienta fiable para todas las pantallas genéticas o químicas dirigidas a trastornos de los órganos suprarrenales y interrenal eficiente y.
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Protocol
Ética Declaración: Todos los procedimientos experimentales en el pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Tunghai (Aprobación del IRB NO 101-12.) Y llevada a cabo de conformidad con las directrices aprobadas.
1. Soluciones de archivo para 3β-HSD actividad enzimática de tinción
- Preparar trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (DMSO)].
- Preparar β-nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (1,2 mg / ml en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,2).
- Preparar nicotinamida (vitamina B3, 50 mg / ml en H 2 O).
- Preparar azul tetrazolio 4-nitro (50 mg / ml en 70% de dimetilformamida).
- Alícuotas todos estos componentes en tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C.
NOTA: En nuestra experiencia, los ciclos de congelación y descongelación de las alícuotas de todas las soluciones mencionadas no afectan a la intensidad de la 3β-HSD actividad de las manchas.
2. Worificio de montaje en 3β-HSD actividad de tinción
NOTA: La actividad enzimática 3β-HSD es detectable en embriones de pez cebra tan pronto como 28 horas después de la fertilización (hpf) cuando se cultivan a 28,5 ° C, lo cual es consistente con la aparición de la expresión de ARNm de hsd3b1 2,7. El protocolo de todo el montaje en la actividad tinción 3β-HSD en este estudio se basa en un método descrito previamente 8 y estaba decidido a tener éxito en el pez cebra en desarrollo hasta 7 días después de la fecundación 9. Para analizar el microambiente vascular del tejido steroidogenic interrenal, todo el montaje 3β-HSD actividad tinción se debe aplicar a las líneas transgénicas que expresan fluorescencia de endotelio específica, como la Tg (kdrl: EGFP) s843 14 y Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . Para analizar el tejido androgénica interrenal teniendo en cuenta el desarrollo del riñón pez cebra, 3β-HSD actividad de tinción puede ser aplied a la Tg (wt1b: GFP) pescado LI1 16, donde se delinea la formación de los glomérulos y túbulos pronéfricos.
- Se trata el pez cebra en desarrollo mediante su incubación en 0,03% feniltiourea en agua de huevo (sal de 0,06 mg / L arrecife en agua desionizada), a partir de una etapa entre 12 y 24 hpf, para inhibir la formación de pigmento.
- Fijar embriones dechorionated o larvas en (A) 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con 0,1% de Tween 20 (PFAT) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) o (B) 2% PFAT durante la noche a 4 ° C o durante 2 horas a 4 ° C, seguido por 4 horas a RT.
Precaución: PFA es tóxico por inhalación y por contacto con la piel. Es destructivo para la piel, las mucosas, los ojos y el tracto respiratorio superior. - Lavar el embriones 4x para 10 min con PBS suplementado con 0,1% de Tween 20 (PBST) a TA.
NOTA: Es muy importante no secar las muestras, mientras que el cambio de las soluciones de lavado. - Recién preparar el stasolución caniza antes de las reacciones (Tabla 1). Preparar, vórtice, y partes de centrifugadoras A y B en tubos separados.
NOTA: La adición de todos los componentes directamente en un único tubo provocaría la precipitación severa. - Añadir la solución de la totalidad de la parte A a la totalidad de la solución de la parte B, mezclar bien para preparar la solución de tinción, e inmediatamente distribuir 1 ml en cada tubo de microcentrífuga que contiene embriones fijos y lavadas.
- Envolver tubos de microcentrífuga con papel de aluminio para protegerlas de la luz y el lugar ya sea en un rotador o una plataforma de agitación durante agitación suave a temperatura ambiente.
- Empíricamente determinar el tiempo de reacción mediante el control de las señales a través de microscopía cromogénicos. precipitaciones ligeras van a desarrollar con el tiempo; sin embargo, que no interfieran con el proceso de reacción.
NOTA: Para los embriones fijan en 28 HPF, tinción a 25 ° C durante 4 horas genera una señal clara en el tejido interrenal. - Detener la reacción lavando 4 veces durante 10 minutos en PBST. yof no se requiere un mayor análisis de inmunohistoquímica (IHC), posterior a fijar los embriones teñidos con 4% PFAT durante 60 minutos a temperatura ambiente. De lo contrario, almacenar los embriones lavados a 4 ° C hasta su uso posterior.
- Para todo el montaje de microscopía, borrar los embriones teñidos, después de la fijada, y se lavó con 50% de glicerol en PBS, orientarlos con el lado dorsal hacia arriba sobre un portaobjetos, y observar el uso de un microscopio vertical bajo iluminación de campo claro.
NOTA: Para hacer una imagen de alta resolución de la morfología de los tejidos interrenal, el análisis del embrión teñido con actividad 3β-HSD y deyolked plana de montaje se recomienda. A medida que el tejido androgénica interrenal se coloca justo encima del saco vitelino, un análisis ventral plana de montaje del tejido interrenal permite una observación directa y clara de la morfología interrenal 17.
3. Análisis IHC de 3β-HSD embriones Actividad manchados
NOTA: Para analizar el microambiente vascular de la steroidogenic tejido, los embriones de actividad manchados de 3β-HSD con un indicador fluorescente específico del endotelio transgénico se someten a transversal vibratome seccionamiento y posterior análisis IHC 12,18.
- Posterior a la fijación
- Post-fijar los embriones teñidos con actividad 3β-HSD y se lavó con 2% PFA suplementado con 1% de Triton X-100 durante 1 hora a 4 ° C y lavar 4x para 10 min en PBS que contenía 1% de Triton X-100 (PBSTx) a TA.
- Incorporación
- Prepare un 4% bajo punto de fusión de agarosa al disolver la agarosa en PBS a 95 ° C, alícuota en tubos de microcentrífuga y se almacena a 4-8 ° C.
- Fundir una parte alícuota del 4% de agarosa de bajo punto de fusión a 70 ° C durante 10 minutos, y luego mantener la alícuota a 47 ° C. Incrustar cada embrión en fundido 4% bajo punto de fusión de agarosa en un casquillo individual de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que sirve como un molde y se deja enfriar hasta que solidifique.
- vibratome Seccionamiento
- Pegue un trozo de cinta de papel a la p secalatform de la vibratome.
- Retire el bloque de agarosa endurecido del molde por una hoja de afeitar. Aplicar pegamento de la cinta de papel en la plataforma, y fijar el bloque de agarosa en la cinta de papel, con la cara anterior de la muestra hacia arriba. Recorte el bloque de agarosa a una forma trapezoidal del prisma, con aproximadamente 4 mm y 8 mm a cada lado de las facetas superior e inferior, respectivamente.
- Enjuague el bloque de agarosa que contiene la muestra con PBS frío suplementado con 0,5% de Triton X-100 (0,5% PBSTx) mediante el uso de un cuentagotas.
- Cortar el bloque de agarosa en 100 micras secciones de acuerdo con el manual de instrucciones de la vibratome. Constantemente enjuagar el bloque de agarosa para evitar que se seque. A medida que se corta cada rebanada, quitarlo de la vibratome utilizando una aguja de 26 G jeringa, y transferir a una placa que contiene punto frío 0,5% PBSTx (500 l / pocillo).
- Recoger las secciones de tejido de actividad positivos 3ß-HSD marcando con un microscopio de disección, y transferir las secciones por un pipunta pette con su extremo de corte (alrededor de 1 mm de diámetro interior en la apertura) en una placa de 96 pocillos que contenía 0,5% frío PBSTx (150 l / pocillo). Las muestras de tejido generalmente se disocian a partir del bloque de agarosa después de este paso.
- Permeabilización y Lavado
- Lavar las rodajas 6x durante 15 minutos en 0,5% PBSTx a TA, 10 min en PBS, y 4x para 10 min en PBS suplementado con 1% de albúmina de suero bovino / 1% de DMSO / 0,1% de Triton X-100 (PBDTx).
- El bloqueo
- Incubar las rebanadas de suero 1 hr en 2% de ternera fetal (FCS) en PBDTx a TA.
- Reacción primaria de anticuerpos
- Se incuban las rodajas durante 1,5 días en PBDTx que contienen un anticuerpo primario (por ejemplo, policlonal de conejo anti-fibronectina humana y de ratón anti-humano quinasa de adhesión focal) a 4 ° C.
- Lavado
- Lavar las rodajas de 6x para 10 min en PBDTx a TA.
- El bloqueo
- Se incuban las rodajas de 1 hora en 2% de FCS en PBDTX a TA.
- Reacción secundaria de anticuerpos
- Incubar las rebanadas de 1,5 días en PBDTx que contienen un anticuerpo secundario (fluoróforo conjugado de cabra anti-conejo o anti-IgG de ratón) a 4 ° C.
- Lavado
- Lavar las rodajas de 6x para 10 min en PBDTx a TA y 4x para 10 min en PBST a TA.
NOTA: Para el análisis microscópico confocal, desactive las muestras con 50% de glicerol en PBS.
- Lavar las rodajas de 6x para 10 min en PBDTx a TA y 4x para 10 min en PBST a TA.
4. Análisis Confocal
- Observar todo el embrión de montaje y la sección por un microscopio confocal equipado con 10X / 20X y 0,5 / 0,75 lente objetivo.
- Para la detección simultánea de la fluorescencia y la tinción 3β-HSD, ajuste el modo multipista de la siguiente manera: 488 nm láser de argón y 505 a 530 nm de paso de banda de filtro para la detección de GFP; 543 nm láser helio-neón y 560 a 615 nm de paso de banda de filtro para la detección de mCherry; y transmitida canal de luz para la detección de manchas 3β-HSD.El tamaño del agujero de alfiler es de 1 unidad Airey, y la resolución es de 1.024 x 1.024 píxeles.
- Montar las pilas z (con intervalo de 6 micras) como una proyección en 3D, y combinar la proyección y el campo brillante, utilizando el software incorporado confocal.
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Representative Results
Para determinar cómo las codevelops tejido interrenal androgénica, con el glomérulo renal pronephric y su naciente sistema vascular, el ensayo de actividad enzimática 3β-HSD se llevó a cabo en el doble transgénico Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embrión en 34 HPF (Figura 1). En esta etapa, el tejido steroidogenic actividad positiva 3β-HSD está situado justo a la línea media y caudal inmediatamente al glomérulo renal pronephric, mientras que algunas células esteroidogénicas de iniciar la migración a través de la línea media y forman un borde que sobresale de la vista dorsal. El tejido steroidogenic está estrechamente asociado con la aorta dorsal (DA) y la vena cardinal posterior (PCV).
El ensayo de actividad enzimática 3β-HSD en Tg (kdrl: GFP) s843 embriones permitió una clara delimitación de los vasos peri-interrenal, incluyendo la DA, PCVY un recipiente interrenal (IRV; Figura 2). Vibratome secciones de los embriones de actividad manchados de 3β-HSD se sometieron a análisis IHC para detectar la proteína de la matriz extracelular fibronectina y su efector aguas abajo fosforilado Quinasa de Adhesión Focal. La deposición peri-DA de fibronectina es esencial para apoyar el crecimiento IRV 18.
Figura 1: Todo el montaje 3β-HSD actividad tinción se realiza en el pez cebra que expresan indicadores fluorescentes. Dorsal (paneles de la izquierda) y dorsolateral (paneles de la derecha) puntos de vista de una actividad manchados de Tg 3β-HSD (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) embrión CI5 en 34 HPF, que permite visualizar la distribución espacial relativa de la interrenal tejido (IR), glomérulo pronephric (PG), túbulos pronéfricos (PT), la aorta dorsal (DA), dorsal lateralvena aorta (LDA), y la posterior cardinal (PCV). Debido a la ubicación del tejido interrenal en esta etapa, los puntos de vista dorsolaterales son del lado derecho del embrión. D, dorsal; V, ventral; A, anterior; P, posterior; R, derecha; L, a la izquierda. Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Vibratome seccionar y análisis IHC de Tg teñido con actividad 3β-HSD (kdrl: GFP) s843 embriones. El embrión de 34 hpf se sometió a un ensayo de actividad enzimática 3β-HSD y luego vibratome seccionamiento. La sección de 3β-HSD actividad positiva se tiñó con un doble IHC con conejo anti-humano de fibronectina (Fnorte; 1/200) y el ratón anti-humano fosforilado quinasa de adhesión focal (pFak; pY397, 1/100). La sección transversal muestra la distribución relativa de los tejidos interrenal (IR) y sus vasos vecinos, incluyendo la aorta dorsal (DA), cardinal vena posterior (IRV), y la vena cardinal posterior (PCV). NT, tubo neural; NC, notocorda; S, somite. Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| de la concentración | En 1.000 l | La concentración final | |
| Parte A. | |||
| DMSO | 40 l | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 l | 0,1 mg / ml |
| NAD | 1,2 mg / ml | 10 l | 12 mg / ml |
| Parte B. | |||
| PBST | 936 l | ||
| La vitamina B3 | 50 mg / ml | 2 l | 0,1 mg / ml |
| NBT | 50 mg / ml | 2 l | 0,1 mg / ml |
Tabla 1: Los componentes de la reacción de tinción 3β-HSD.
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Discussion
La intensidad de la señal de la actividad 3β-HSD aumentó durante el curso de la reacción. se detectaron señales claras de la actividad 3β-HSD después de 4 horas de reacción para las etapas de 28 hpf en adelante. Sin embargo, la duración de la reacción requiere la determinación empírica, dependiendo de la finalidad del ensayo. En los casos en que la tinción requiere procesamiento durante la noche, un fondo ligeramente azulado tiende a desarrollarse en las muestras. Este problema se puede superar mediante el aumento de la duración de fijación (por ejemplo, 4 horas en 4% PFAT a RT) antes de la actividad tinción 3β-HSD. Por el contrario, overfixation, tales como la fijación de una noche con 4% PFAT a TA, conduce a un fondo muy claro. Sin embargo, se requeriría más tiempo para obtener una intensidad deseable de la señal. Nos dimos cuenta de que la fijación de las muestras durante la noche con 2% en lugar del 4% PFAT antes de 3β-HSD actividad tinción normalmente produce resultados más deseables en una observación posterior indicador fluorescente o yoanálisis de HC. Sin embargo, la fijación de los embriones con un 4% PFAT permite un rápido análisis de la actividad de 3β-HSD (finalizado el plazo de 1 día) y se beneficiará pues pantallas genéticas o químicas dirigidas a los tejidos androgénica interrenal.
Posterior a la fijación de los embriones después de 3β-HSD actividad tinción es esencial, ya que pequeñas cantidades de componentes químicos tienden a persistir en las muestras teñidas incluso después de un prolongado lavado y se traduciría en alto fondo después de un tiempo de almacenamiento largo. Sin embargo, si los embriones de actividad manchados de 3β-HSD están siendo objeto de un análisis más profundo de IHC, el almacenamiento de la actividad manchada y lavada embriones a 4 ° C durante la noche 3β-HSD no se traduce en una mejora notable de los antecedentes.
En el análisis de hibridación in situ (ISH) de 3β-HSD actividad embriones teñidos es posible. Por ejemplo, la expresión de las transcripciones Prox1 se colocalized con la actividad 3β-HSD en el steroidogentejido ic 10. Para realizar 3β-HSD actividad tinción además de ISH, los embriones deben ser fijados en 4% PFAT durante 4 horas antes y después el ensayo de actividad 3β-HSD de modo que los transcritos de ARN celular se pueden conservar con la calidad deseable para el análisis de ISH.
El análisis de ISH usando ribosondas de ff1b, CYP11A1, hsdb1, y la estrella se han aplicado en los estudios de desarrollo del tejido 1,2,11 androgénica interrenal. La ribosonda de ff1b detecta células primordiales interrenal por 22 HPF, mientras que las de CYP11A1 y estrella detectar diferenciación de las células interrenal por 24 HPF. En comparación con 3β-HSD tinción histoquímica que sólo detecta tejidos interrenal diferenciadas de 28 hpf en adelante, el análisis de ISH se puede utilizar para analizar un espectro de genes-interrenal específica tanto en las células primordiales interrenal y diferenciados. Sin embargo, 3β-HSD histoquímica ha tincións la ventaja de ser sencillo, rápido y fiable para analizar el fenotipo del tejido interrenal androgénica diferenciada, y por lo tanto es una herramienta poderosa para los estudios de desarrollo detalladas, así como pantallas genéticas o químicas a gran escala. De acuerdo con nuestra revisión de la literatura relevante, no existe un anticuerpo específico que puede detectar de forma fiable la expresión de la proteína en el tejido interrenal androgénica, a través de inmunohistoquímica. Por lo tanto, el método de tinción histoquímica 3β-HSD es particularmente útil para delinear el tejido y la morfología celular del tejido interrenal androgénica.
Aunque 3β-HSD tinción histoquímica es útil para la visualización del tejido interrenal steroidogenic diferenciada, no informa directamente la capacidad de la síntesis de esteroides o la funcionalidad de las células interrenal. Las mutaciones que afectan las enzimas o productos químicos aguas arriba o aguas abajo de 3β-HSD en la cascada de la síntesis androgénica, no puedenecesariamente ser detectado con este método descrito, ya que pueden o no pueden perturbar tamaño o la morfología del tejido interrenal. Por lo tanto, los usuarios de este protocolo debe tener en cuenta que ciertas deficiencias enzimáticas que afectan a la función pero no la morfología del tejido interrenal no pueden ser fácilmente detectados por este método.
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Acknowledgments
Agradecemos al Prof. Christoph Englert y el Prof. Didier Stainier para regalar la Tg (wt1b: GFP) LI1 y Tg (kdrl: EGFP) s843 cepas, respectivamente, y el Fondo para el pez cebra Taiwán Core para proporcionar Tg (kdrl: mCherry) CI5. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 de Taiwán, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
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