Summary
La ghiandola interrenale in zebrafish è la controparte teleostei della ghiandola surrenale mammiferi. Questo protocollo introduce come eseguire la deidrogenasi 3-β-idrossisteroide (Δ 5-4 isomerasi; 3β-HSD) saggio di attività enzimatica, che rileva le cellule differenziate steroidogeniche nel zebrafish in via di sviluppo.
Introduction
La ghiandola surrenale, una componente fondamentale dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene, secerne gli steroidi e coordina l'omeostasi di steroidi e la risposta del corpo allo stress. La ghiandola surrenale comprende la corteccia esterna, che secerne steroidi in maniera specifica per la zona, e midollo interni, che sintetizza catecolamine. La ghiandola interrenale in teleostei è la controparte della ghiandola surrenale nei mammiferi ed è composto da cellule interrenale e cromaffini steroidogenici, che sono equivalenti funzionali della corteccia surrenale e midollare, rispettivamente, 1-3. Studi condotti utilizzando il modello zebrafish hanno riferito che entrambe le linee cellulari steroidogenici e cromaffini sono formate da meccanismi molecolari e cellulari altamente simili a quelle dei mammiferi 1,2. Pertanto, il pesce zebra è un modello potenzialmente potente per lo studio di malattie genetiche, controllo neuroendocrino, e la biologia dei sistemi dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (interrenale).
4,5. 3β-HSD è essenziale per biosynthesizing tutte le classi di steroidi ormonali, vale a dire il progesterone, glucocorticoidi, mineralcorticoidi, androgeni ed estrogeni,. I due umana 3β-Hsd isoenzimi HSD3B1 e HSD3B2 sono espressi in modo differenziale 6. HSD3B1 è espressa nella placenta e nei tessuti periferici, mentre HSD3B2 si esprime nella corteccia surrenale e gonadi. HSD3B1 umana e HSD3B2 sono co-ortologhi di hsd3b1 zebrafish, che si esprime al tessuto interrenale e gonadi adulti; hsd3b2 zebrafish è un gene maternamente espresso le cui trascrizioni scomparire prima organogenesi 7. Il protocollo di tutto il montaggio 3β-Hsd saggio di attività enzimatica per zebrafish è stato sviluppato modificando il metodo di Levy, uns descritto da Milano et al. , Su sezioni congelate di otto specie di teleostei 8. A causa della permeabilità dei tessuti e la trasparenza ottica del pesce zebra in via di sviluppo, tutto il montaggio 3β-Hsd istochimica può essere utilizzato con successo per l'embrione zebrafish fisso e larve e specificamente delineare i tessuti interrenale differenziati.
Questo test sensibile e rapida è stata applicata a vari mutanti e morphants dimostrano diversi tipi di dysmorphogenesis interrenale. L'attività interrenale 3β-HSD è assente nell'embrione se le specifiche del tessuto interrenale è interrotta attraverso una specifica atterramento del fattore di trascrizione Ff1b ed è diminuito come la differenziazione interrenale è influenzata da un atterramento del coregulator Ff1b Prox1 9,10. In particolare, l'attività 3β-Hsd può essere rilevato in mutanti con gravi difetti nelle fasi iniziali, come ad esempio un occhio capocchia di spillo e strabismo, dove il 3β-Hsd istochimica delinea come la migrazione delle cellule interrenale è influenzata 11. La differenziazione del tessuto interrenale non è compromessa anche in completa assenza di sangue e vascolare. Pertanto, come forma di segnali endotelio-derivati in via di sviluppo dell'organo interrenale può essere determinato 12,13. Nel complesso, questo saggio istochimico è stato utilizzato con successo per lo studio specificazione, differenziazione e migrazione delle cellule steroidogeniche nel modello zebrafish. Pertanto, dovrebbe essere un efficiente e uno strumento affidabile per eventuali schermi genetici o chimici di targeting disturbi degli organi surrenali e interrenale.
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Protocol
Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sperimentali su zebrafish sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Tunghai University (IRB Soddisfazione NO 101-12.) E realizzato in conformità con le linee guida approvate.
1. Soluzioni azioni 3β-Hsd enzimatico attività di colorazione
- Preparare trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml in dimetilsolfossido (DMSO)].
- Preparare β-nicotinammide adenina dinucleotide idrato (1,2 mg / ml in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,2).
- Preparare nicotinamide (vitamina B3, 50 mg / ml in H 2 O).
- Preparare 4-nitro tetrazolio blu (50 mg / ml nel 70% dimetilformammide).
- Aliquota tutti questi componenti in tubi microcentrifuga e conservare a -20 ° C.
NOTA: Nella nostra esperienza, ripetuti di congelamento e scongelamento delle aliquote di tutte le soluzioni di cui sopra non influenzano l'intensità della 3β-Hsd attività di colorazione.
2. Whole-mount 3β-Hsd attività di colorazione
NOTA: L'attività enzimatica 3β-HSD è rilevabile in embrioni di zebrafish come già 28 ore dopo la fecondazione (HPF) quando coltivate a 28,5 ° C, che è coerente con l'inizio di espressione dell'mRNA di hsd3b1 2,7. Il tutto il montaggio 3β-Hsd protocollo attività colorazione in questo studio si basa su un metodo precedentemente descritto 8 ed era determinato ad avere successo nel zebrafish in via di sviluppo fino a 7 giorni dopo la fecondazione 9. Per analizzare il microambiente vascolare del tessuto steroidea interrenale, tutto il montaggio 3β-Hsd attività colorazione deve essere applicato a linee transgeniche che esprimono fluorescenza specifica-endotelio, come ad esempio Tg (kdrl: EGFP) s843 14 e Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . Per analizzare il tessuto steroidogenica interrenale considerando lo sviluppo del rene zebrafish, 3β-Hsd attività colorazione può essere applied al Tg (wt1b: GFP) pesci LI1 16, dove si delinea la formazione del glomerulo e pronephric tubuli.
- Trattare il zebrafish sviluppo incubandoli in 0,03% phenylthiourea in acqua uovo (0,06 mg / L barriera sale in acqua deionizzata), partendo da una fase compresa tra 12 e 24 HPF, per inibire la formazione di pigmento.
- Fix embrioni dechorionated o larve in (A) 4% paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) supplementato con 0,1% Tween 20 (PFAT) per 1 ora a temperatura ambiente (RT) o (B) 2% PFAT notte a 4 ° C o per 2 ore a 4 ° C, seguita da 4 ore a RT.
Attenzione: PFA è tossico per inalazione e per contatto con la pelle. E 'distruttivo per la pelle, le mucose, gli occhi e le vie respiratorie superiori. - Lavare il embrioni 4x per 10 minuti con PBS integrato con 0,1% di Tween 20 (PBST) a temperatura ambiente.
NOTA: E 'fondamentale per non secca i campioni, mentre la modifica delle soluzioni di lavaggio. - Appena preparare la STAsoluzione ining prima delle reazioni (Tabella 1). Preparare, vortice, e componenti per centrifughe di A e B in tubi separati.
NOTA: L'aggiunta di tutti i componenti direttamente in un unico tubo potrebbe causare gravi precipitazioni. - Aggiungere l'intera soluzione della parte A per l'intera soluzione di parte B, mescolare bene per preparare la soluzione colorante, e subito distribuire 1 ml in ogni provetta da microcentrifuga contenente embrioni fissi e lavati.
- Avvolgere i tubi microcentrifuga con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce e luogo sia su un rotatore o di una piattaforma oscillante per gentile agitazione a temperatura ambiente.
- Empiricamente determinare il tempo di reazione per il monitoraggio dei segnali cromogenici mediante microscopia. precipitazioni lievi si svilupperà nel corso del tempo; tuttavia, essi non interferiscano con il processo di reazione.
NOTA: per gli embrioni fissati a 28 HPF, colorazione a 25 ° C per 4 ore genera un segnale chiaro al tessuto interrenale. - Arrestare la reazione lavando 4x per 10 min in PBST. iof è richiesta alcuna ulteriore immunoistochimica (IHC) analisi, post-correggere gli embrioni colorate con 4% PFAT per 60 minuti a temperatura ambiente. Altrimenti, memorizzare gli embrioni lavati a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Per tutto il montaggio microscopia, cancellare gli embrioni macchiati, post-fisso, e lavato con il 50% glicerolo in PBS, orientarli con il lato dorsale rivolto verso l'alto su una diapositiva, e osservare con un microscopio verticale sotto illuminazione in campo chiaro.
NOTA: per creare un'immagine ad alta risoluzione della morfologia del tessuto interrenale, analisi dell'embrione 3β-Hsd attività macchiato e deyolked TV a montaggio è raccomandato. Come il tessuto steroidogenica interrenale è posizionato proprio sopra il sacco vitellino, una ventrale analisi TV a monte del tessuto interrenale permette una osservazione diretta e chiara della morfologia interrenale 17.
3. Analisi IHC di 3β-HSD embrioni attività macchiati
NOTA: Per analizzare il microambiente vascolare del steroitessuto dogenic, gli embrioni di attività macchiati 3β-HSD con un reporter fluorescenti transgenici specifici endotelio sono sottoposti ad trasversali vibratome sezionamento e la successiva analisi IHC 12,18.
- Post-fissaggio
- Post-rimuovere gli embrioni 3β-Hsd activity-tinto e lavato con 2% PFA integrato con 1% Triton X-100 per 1 ora a 4 ° C e lavare 4x per 10 min in PBS contenente 1% Triton X-100 (PBSTx) a RT.
- Incorporare
- Preparare 4% a basso punto di fusione agarosio sciogliendo l'agarosio in PBS a 95 ° C, aliquota in tubi microcentrifuga, e conservare a 4-8 ° C.
- Sciogliere un'aliquota del 4% bassofondente agarosio a 70 ° C per 10 minuti, e quindi mantenere il un'aliquota a 47 ° C. Incorpora ogni embrione nel fuso 4% a basso punto di fusione agarosio in un berretto distaccata di una provetta da 1,5 ml microcentrifuga che funge da stampo e lasciare raffreddare fino solido.
- vibratome sezionamento
- Attaccare un pezzo di nastro di carta per la p seccalatform del vibratome.
- Rimuovere il blocco di agarosio indurito dallo stampo da una lama di rasoio. Applicare colla al nastro di carta sulla piattaforma, e fissare il blocco di agarosio sul nastro di carta, con il lato anteriore del campione verso l'alto. Tagliare il blocco di agarosio a una forma trapezoidale prismatica, con circa 4 mm e 8 mm per lato delle faccette superiore ed inferiore, rispettivamente.
- Risciacquare blocco agarosio campioni contenenti con PBS freddo integrato con 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) utilizzando un contagocce.
- Tagliare il blocco di agarosio in 100 sezioni micron secondo il manuale di istruzioni del vibratome. Costantemente lavare il blocco di agarosio per evitare l'essiccazione. Come ogni fetta viene tagliata, toglierlo dal vibratome utilizzando un ago G 26 della siringa, e trasferire in un posto piatto contenente freddo 0,5% PBSTx (500 microlitri / pozzetto).
- Raccogliere le sezioni di tessuto di attività-positivo 3beta-Hsd controllando al microscopio dissezione, e trasferire le sezioni da un PIpunta Pette con la sua estremità cut-off (circa 1 mm di diametro interno, in apertura) in una piastra a 96 pozzetti contenente freddo 0,5% PBSTx (150 ml / pozzetto). I campioni di tessuto di solito dissociano dal blocco agarosio dopo questo passaggio.
- Permeabilizzazione e lavaggio
- Lavare le fette 6x per 15 minuti a 0,5% PBSTx a RT, 10 min in PBS, e 4x per 10 min in PBS integrato con 1% di siero albumina bovina / 1% DMSO / 0,1% Triton X-100 (PBDTx).
- Blocco
- Incubare le fette per 1 hr a 2% di siero fetale bovino (FCS) in PBDTx a RT.
- Reazione anticorpo primario
- Incubare le fette per 1,5 giorni in PBDTx contenente un anticorpo primario (ad esempio, policlonale di coniglio anti-fibronectina umana e topo anti-umano adesione focale chinasi) a 4 ° C.
- Lavaggio
- Lavare le fette 6x per 10 min in PBDTx a temperatura ambiente.
- Blocco
- Incubare le fette per 1 ora a 2% FCS in PBDTx a temperatura ambiente.
- Reazione anticorpo secondario
- Incubare le fette per 1,5 giorni in PBDTx contenenti un anticorpo secondario (fluoroforo coniugato capra anti-coniglio o anti-topo IgG) a 4 ° C.
- Lavaggio
- Lavare le fette 6x per 10 min in PBDTx a temperatura ambiente e 4x per 10 min in PBST a temperatura ambiente.
NOTA: Per l'analisi al microscopio confocale, cancellare i campioni con il 50% glicerolo in PBS.
- Lavare le fette 6x per 10 min in PBDTx a temperatura ambiente e 4x per 10 min in PBST a temperatura ambiente.
4. Analisi confocale
- Osservare l'intero embrione monte e la sezione con un microscopio confocale dotato di 10X / 20X e 0,5 / 0,75 lente dell'obiettivo.
- Per la rilevazione simultanea di fluorescenza e la colorazione 3β-Hsd, impostare la modalità multitraccia come segue: 488 nm laser argon e 505-530 nm filtro passa-banda per il rilevamento di GFP; 543 nm laser a elio-neon e 560-615 nm filtro passa-banda per il rilevamento di mCherry; e trasmessa canale di luce per la rivelazione di 3β-Hsd colorazione.La dimensione del foro stenopeico è 1 unità Airey, e la risoluzione è 1.024 x 1.024 pixel.
- Montare le pile z (con 6 intervalli micron) come proiezione 3D, e unire la proiezione e il campo luminoso, utilizzando il software incorporato confocale.
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Representative Results
Per determinare come i codevelops steroidogenici tessuto interrenale con il glomerulo renale pronephric e la sua vascolarizzazione nascente, il saggio di attività enzimatica 3β-HSD è stato eseguito sul doppio transgenici Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embrione a 34 HPF (Figura 1). In questa fase, il tessuto steroidogenico activity-positive 3β-Hsd si trova alla linea mediana e caudale immediatamente glomeruli renali pronephric, mentre alcune cellule steroidogeniche iniziano migrazione attraverso la linea mediana e formano un bordo sporgente dalla vista dorsale. Il tessuto steroidea è strettamente associata con l'aorta dorsale (DA) e la vena cardinale posteriore (PCV).
Il saggio di attività enzimatica 3β-Hsd sul Tg (kdrl: GFP) s843 embrioni permesso una chiara definizione dei vasi peri-interrenale, tra cui la DA, PCVE di un recipiente interrenale (IRV; Figura 2). Vibratomo sezioni dei 3β-HSD embrioni attività macchiate stati sottoposti ad analisi IHC per rilevare la extracellular matrix protein fibronectina e il suo effettori a valle fosforilata Focal Adhesion Kinase. La deposizione peri-DA di fibronectina è essenziale per sostenere la crescita IRV 18.
Figura 1: tutto il montaggio 3β-Hsd attività colorazione eseguita su zebrafish esprimere reporter fluorescenti. Dorsale (sinistra pannelli) e dorsolaterale (pannelli di destra) vista su un 3β-Hsd attività macchiato di Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embrione a 34 HPF, che permette di visualizzare la distribuzione spaziale relativa del interrenale tessuti (IR), glomerulo pronephric (PG), tubuli pronephric (PT), dorsale dell'aorta (DA), dorsale lateraledell'aorta (LDA), e posteriore cardinale vena (PCV). Grazie alla posizione del tessuto interrenale in questa fase, le viste dorsolaterali sono dal lato destro dell'embrione. D, dorsale; V, ventrale; A, anteriore; P, posteriore; R, a destra; L, a sinistra. Barra di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Vibratome sezionamento ed analisi IHC di 3β-Hsd attività macchiato di Tg (kdrl: GFP) s843 embrioni. L'embrione 34-HPF stato sottoposto ad un saggio di attività enzimatica 3β-Hsd quindi vibratome sezionamento. La sezione 3β-Hsd attività-positivo è stato macchiato con un doppio IHC con coniglio fibronectina anti-umano (Fn; 1/200) e topo anti-umano fosforilata adesione focale chinasi (pFak; pY397, 1/100). La sezione trasversale mostra la relativa distribuzione del tessuto interrenale (IR) e le sue navi vicine, tra cui l'aorta dorsale (DA), posteriore cardinale vena (IRV), e posteriore cardinale vena (PCV). NT, tubo neurale; NC, notochord; S, somite. Barra di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| la concentrazione della | In 1.000 ml | concentrazione finale | |
| Parte A. | |||
| DMSO | 40 ml | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 microlitri | 0,1 mg / ml |
| NAD | 1,2 mg / ml | 10 microlitri | 12 mg / ml |
| Parte B. | |||
| PBST | 936 ml | ||
| La vitamina B3 | 50 mg / ml | 2 ml | 0,1 mg / ml |
| NBT | 50 mg / ml | 2 ml | 0,1 mg / ml |
Tabella 1: Componenti della reazione di colorazione 3β-HSD.
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Discussion
La forza dell'attività 3β-Hsd segnale aumentato nel corso della reazione. chiari segnali di attività 3β-HSD sono stati rilevati dopo 4 ore di reazione per fasi, dalla 28 in poi HPF. Tuttavia, la durata della reazione richiede determinazione empirica, a seconda dello scopo del test. Nei casi in cui la colorazione richiede elaborazione notturna, uno sfondo leggermente bluastra tende a svilupparsi sui campioni. Questo problema può essere superato aumentando la durata di fissaggio (ad esempio, 4 ore a 4% PFAT a RT) prima dell'attività colorazione 3β-Hsd. Per contro, overfixation, come ancoraggio per una notte con 4% PFAT a RT, porta ad un fondo estremamente chiara. Tuttavia, più tempo sarebbe necessario per ottenere un'intensità desiderabile del segnale. Abbiamo notato che fissa i campioni durante la notte con il 2% invece che al 4% PFAT prima 3β-Hsd attività colorazione produce in genere risultati più desiderabili in una successiva osservazione reporter fluorescente o ioanalisi HC. Tuttavia, fissando gli embrioni con il 4% PFAT permette una rapida analisi delle attività 3β-Hsd (completata entro 1 giorno) e sarebbe quindi beneficiare schermi genetici o chimici di targeting dei tessuti steroidogenici interrenale.
Post-fissa i embrioni dopo 3β-Hsd attività colorazione è essenziale perché tracce di componenti chimici tendono a persistere nei campioni macchiati anche dopo ampia lavaggio e si tradurrebbe in fondo elevato dopo una durata di stoccaggio a lungo. Tuttavia, se le 3β-HSD embrioni attività macchiate devono essere sottoposti ad ulteriore analisi IHC, memorizzare l'attività macchiate 3β-Hsd ed embrioni lavato a 4 ° C overnight non comporta un miglioramento notevole dello sfondo.
In situ ibridazione analisi (ISH) di 3β-HSD embrioni attività macchiato è possibile. Ad esempio, l'espressione dei trascritti Prox1 è colocalizzava con l'attività 3β-Hsd al steroidogenic tessuto 10. Per eseguire 3β-Hsd attività colorazione oltre ISH, gli embrioni devono essere fissati in 4% PFAT per 4 ore prima e dopo il dosaggio dell'attività 3β-Hsd modo che trascritti di RNA cellulare possono essere conservati con qualità desiderabile per l'analisi ISH.
Analisi ISH utilizzando riboprobes di ff1b, cyp11a1, hsdb1, e la stella sono stati applicati negli studi di sviluppo del interrenale 1,2,11 tessuto steroidea. Il riboprobe di ff1b rileva le cellule primordiali interrenale da 22 HPF, mentre quelli di cyp11a1 e stella rilevare differenziazione delle cellule interrenale da 24 HPF. Rispetto al 3β-Hsd colorazione istochimica che rileva solo i tessuti interrenale differenziati da 28 HPF in poi, l'analisi ISH può essere utilizzato per analizzare una gamma di geni specifici interrenale in entrambe le cellule primordiali interrenale e differenziati. Tuttavia, 3β-Hsd istochimiche colorazione ettaris il vantaggio di essere semplice, rapido e affidabile per analizzare il fenotipo del tessuto interrenale steroidogenico differenziata, e quindi è un potente strumento per studi sullo sviluppo dettagliati nonché schermi genetici o chimici su larga scala. Come per la nostra revisione della letteratura rilevante, non esiste un anticorpo specifico in grado di rilevare in modo affidabile l'espressione della proteina al tessuto interrenale steroidogenica attraverso immunoistochimica. Pertanto, il metodo di colorazione istochimica 3β-HSD è particolarmente utile nel delineare il tessuto e la morfologia cellulare del tessuto interrenale steroidogenica.
Anche se 3β-Hsd colorazione istochimica è utile per la visualizzazione del tessuto interrenale steroidogenico differenziata, che non riporta direttamente capacità di sintesi degli steroidi o la funzionalità delle cellule interrenale. Le mutazioni o sostanze chimiche che interessano enzimi a monte oa valle di 3β-HSD nella cascata di sintesi steroidea non possononecessariamente essere rilevato con questo metodo descritto, dato che possono o non possono perturbare sia dimensione o la morfologia del tessuto interrenale. Pertanto, gli utenti di questo protocollo dovrebbe tenere a mente che alcune alterazioni enzimatiche che colpisce la funzione ma non la morfologia del tessuto interrenale non possono essere facilmente rilevati da questo metodo.
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Acknowledgments
Ringraziamo il Prof. Christoph Englert e il Prof. Didier Stainier per regalare il Tg (wt1b: GFP) LI1 e Tg (kdrl: EGFP) s843 ceppi, rispettivamente, e il meccanismo di Taiwan Zebrafish Nucleo per la fornitura di Tg (kdrl: mCherry) CI5. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 di Taiwan, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
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