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Biology

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Abstract

Kaposi-Sarkom (KS) ist eine ungewöhnliche Tumor bestehend aus wuchernden Spindel Zellen, die durch Infektion der Endothelzellen (EG) mit KSHV initiiert und entwickelt sich in den meisten Fällen im Rahmen der Immunsuppression. Trotz jahrzehntelanger Forschung optimale Behandlung von KS bleibt schlecht definiert und klinischen Ergebnisse sind besonders ungünstig in beschränkten Ressourcen. KS-Läsionen sind getrieben von pathologischen Angiogenese, chronische Entzündungen und Onkogenese und verschiedene in-vitro- Kultur Zellmodelle wurden entwickelt, um diese Prozesse zu studieren. KS ergibt sich aus KSHV-infizierten Zellen endothelialen Ursprungs, also EC-Linie Zellen am besten geeignete in-vitro- Surrogate von der Spindel Zelle Vorläufer zur Verfügung stellen. Da EG haben eine begrenzte in-vitro- Lebensdauer, und die onkogenen Mechanismen KSHV angestellt sind weniger effizient als die der anderen tumorigenic Viren, es war jedoch schwierig zu beurteilen, die Prozesse der Transformation in der PV oder Telomerase-verewigt EC Daher wurde ein neuartiger EG basierende Kultur-Modell entwickelt, die Transformation nach Infektion mit KSHV bereitwillig unterstützt. Ektopische Expression der Gene des menschlichen Papillomavirus Typ 16 E6 und E7 erweiterte Kultur von Alter und Durchgang abgestimmt Mock und KSHV-infizierten EG ermöglicht und unterstützt die Entwicklung einer wahrhaft transformierten (d. h. tumorigenic) Phänotyp in infizierten Zellkulturen . Diese gefügig und hoch reproduzierbare Modell KS hat die Entdeckung von mehreren wesentlichen Signalwege mit hohem Potenzial für die Übersetzung in klinischen Umgebungen erleichtert.

Introduction

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Multi-focal Angioproliferative Tumor Auswirkungen auf Haut, Schleimhaut und viszeralen Websites, der am häufigsten in der Umgebung von fortgeschrittenen Immununterdrückung1entwickelt. Vier epidemiologische Formen sind beschrieben worden: Classic, eine träge Form, das in der Regel ältere Menschen des Mittelmeerraums und des Nahen Ostens Erbes; iatrogene, durch Behandlung mit immunsuppressiven Medikamenten nach Organtransplantationen; Epidemie, eine AIDS-definierenden Krebs; und eine HIV-unabhängige Form häufig bei Kindern in endemischen Gebieten in Afrika endemisch. Mit dem Aufkommen der effektive Kombination Anti-retroviral Drogen-Therapien für die Behandlung von HIV ist Epidemie KS in Entwicklungsländern viel seltener diagnostiziert. Jedoch bleiben die klinisch aggressiven endemischen und epidemischen Formen unter die am häufigsten diagnostizierten Krebsarten in vielen afrikanischen Ländern2,3,4. Daher ist die Identifizierung von wirksame Pathogenese gezielt Medikamente zur Behandlung von KS Forschungsschwerpunkt.

Histologisch, zeichnen sich KS-Läsionen durch umfangreiche aber abnorme Neovaskularisation wobei Spindel Zellen EG Ursprungs diskontinuierliche vaskulären Netzwerken5bilden. Diese abnormen Gefäße ("vaskuläre Schlitze") erlauben Extravasation der Erythrozyten, die Läsionen ihre charakteristische Farbe geben. Darüber hinaus enthalten Läsionen zahlreiche Leukozyten, die chronischen Entzündung (z.B. Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen) charakterisieren. Rückbildung der KS-Läsionen nach Immunrekonstitution wurde beschrieben, was darauf hindeutet, dass KS Funktionen einer hyper-proliferative Läsion und wahre Tumor6,7,8,9.

KS Herpesvirus (KSHV), dem Erreger der KS, wurde im Jahr 199410identifiziert. Seit dann viele in Vitro Zellkultur Modelle entwickelt worden um Pathogenese Studien ermöglichen, einschließlich der Zellen aus Biopsie Tumormaterial und primäre explantiert oder Telomerase exprimierenden EG infiziert mit KSHV in-vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. keines der derzeit verfügbaren Modelle voll rekapituliert die KS Tumor Mikroumgebung, aber alle haben wertvolles Wissen zu unserem Verständnis der Pathobiologie KSHV Infektion beigetragen. Im Gegensatz zu den anderen bekannten tumorigenic menschliche Herpesvirus Epstein - Barr-Virus (EBV), KSHV nicht leicht transformiert Zellen in Kultur nach de Novo Infektion19,20,21, 22. aber diese Einschränkung überwunden durch transducing primären menschlichen EG entweder gemischt mikrovaskuläre oder lymphatischen Ursprungs mit der E6 und E7 Gene aus humanem Papillomavirus Typ 16 vor der Infektion mit KSHV23,24 . Ausdruck dieser exogene Onkogene erhöht drastisch das transformierende Potenzial der KSHV in-vitro- teilweise durch weitere Hemmung der Retinoblastoma Protein und p5323,24. Diese EG-Transduktion Methode hat mehrere Labore, wichtige Veränderungen im Host zu identifizieren erlaubt Zelle Genexpression, die durch KSHV Infektion hervorgerufen und, die Erleichterung der KS Zelle überleben und Verbreitung25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. der hierin beschriebenen Protokolle sind unkompliziert und hoch reproduzierbare und führt zu der Generation von Alter und Durchgang abgestimmt KSHV-infizierten EG und Mock-infizierten Steuerelemente, können viel länger als primäre Zellen gezüchtet werden und werden, ermöglichen Sie die Untersuchung von onkogenen Mechanismen KSHV angestellt. Obwohl das Protokoll enthält ein Verfahren zur Herstellung von Wildtyp KSHV aus der primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1, E6/E7-verewigt EG sind auch sehr anfällig für Infektionen mit rekombinanten BACmid abgeleitet KSHV-BAC1630. Protokolle für die Vorbereitung des BAC16 sind an anderer Stelle beschrieben33,34.

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Protocol

Hinweis: alle in diesem Protokoll beschriebene Verfahren durchgeführt werden, unter Bedingungen der BSL-2.

1. KSHV Lager Vorbereitung

  1. bereiten TNE Puffer: auflösen 292,24 mg EDTA in DdH 2 O, 225 mL bringen, und passen Sie auf pH 8. 605,7 mg Tris in DdH 2 O auflösen, bis 225 mL bringen und auf pH 8 anpassen. EDTA und Tris Lösungen kombinieren, hinzufügen 4,38 g NaCl, endgültige Lautstärke bis 500 mL, filtern, Sterilisation und Lagerung bei 4 ° C .
  2. Kultur KSHV-positiv, EBV-Negative primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 in RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und Antibiotika, ca. 1 1.2 x 10 6 Zellen pro mL.
  3. Induzieren KSHV Produktion aufgeteilt Kulturen 1:2 mit frischem Medium und eine Endkonzentration von 20 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzu und inkubieren Sie Kulturen für 5 Tage. Als Alternative Behandlung von Zellen mit Natrium-Butyrat (NaB; 0,1 mM) für 3 Tage induzieren lytische Virusreplikation.
  4. Um Viruspartikel zu ernten, Zentrifugieren Sie zuerst die Kultur Überstand bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur pellet-Zellen und Überstände auf frischen Rohre übertragen.
  5. Zur weiteren Klärung des Überstands um Zelltrümmer, vermeiden Zentrifugieren bei 2.500 x g für 10 min bei 4 ° c
    Hinweis: als Alternative zu high-Speed Zentrifugation zur Klärung der Kultur Überstände, Filtration durch eine sterile 0,45 µm Filter durchgeführt werden kann. Wir haben einen deutlichen Rückgang der Titer mit Filtration beobachtet; Daher führen wir den zweiten Zentrifugationsschritt routinemäßig statt.
  6. 5 mL 25 % Saccharoselösung in TNE Puffer mit etwa 30 mL der Überstand in 6 Ultrazentrifugen Rohre geklärte Kultur als nächstes überlagern.
  7. Zentrifuge ausgeglichen bei 75.000 x g für 2 h bei 4 ° C unter Vakuum Röhren.
  8. Kultur überstand abgießen und tupfen Sie den Rand des jedes Rohr, so viel überstand und Saccharose Lösung wie möglich zu entfernen, dann Aufschwemmen der Virus-Pellets, die möglicherweise nicht sichtbar, in 150 µL TNE Puffer.
  9. Alle Pool Nukleinsäuretablette Virus, vermengen, und frieren 25 µL-Aliquots bei-80 ° C .

2. Transduktion der EG mit E6 und E7 Papillomavirus Genes

Hinweis: Wir verwenden routinemäßig standard Gewebe Kulturflaschen für den Anbau von primären EC Jedoch wenn unbefriedigende Wachstum der EG erhalten werden dann die Verwendung von kommerziellen Kulturflaschen berücksichtigt werden.

  1. Kultur primären menschlichen dermalen mikrovaskuläre oder lymphatischen EG in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 im EG Wachstumsmedium (EGM; enthält EG basal Medium [EBM] mit EGM-2 BulletKit [mit FBS, ergänzt Hydrocortison, menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-B vaskulären EG Wachstumsfaktor, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1, Ascorbinsäure, menschliche epithelialen Wachstumsfaktor, Antibiotika und Heparin]) in einem T75 Zelle Kultur Kolben um ca. 50 % Zusammenfluss.
  2. Für die Transduktion, Kultur PA317 LXSN 16E6E7 Zellen 24 , 35 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C zuzüglich 5 % CO 2 in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotika in ergänzt eine T150 Zelle Kultur Flasche bis sie ca. 90 % Zusammenfluss sind. Dann über Nacht in 16 mL Medium inkubieren.
  3. Das PA317 Medium durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu klären.
  4. Entfernen die EGM aus den EG-Kultur und Overlay-Zellen mit 12 mL des Mediums geklärte PA317 und inkubieren Sie für 4 Std.
    Hinweis: Zentrifugieren 16 mL konditionierten Medium 300 X g für 5 min ergibt eine kompakte Kugel, die durch die sorgfältige nachträgliche Entfernung von 12 mL geklärte Überstand nicht gestört wird. Jedoch wenn Übertragung der PA317 LXSN 16E6E7 Zellen Primärkulturen EG ist ein Anliegen (die Verpackung-Zell-Linie wird schnell entwachsen EG), dann Filtration von konditionierten Überstand durch einen 0,45 µm-Filter vor dem Transfer erfolgen kann.
  5. 6 mL des Mediums PA317 mit frischen EGM zu ersetzen und über Nacht inkubieren.
  6. Refeed EG mit 12 mL frische EGM und inkubieren Sie eine weitere 48 h.
  7. EG, Sub-Kultur Medium zu entfernen und waschen mit 12 mL PBS ohne kationen, und geben Sie 3 mL kommerzielle enzymatische Dissoziation Lösung (z.B. TrypLE) und Inkubation bei 37 ° C für 3 min.
  8. Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in frischen EGM und teilen gleichmäßig in 3 x T75 Flaschen mit einem Endvolumen von 12 mL EGM pro Flasche.
  9. G418 hinzufügen um EG ausgestrahlt mit E6 und E7 zu wählen, eine Endkonzentration von 200 µg/mL für zwei Durchgänge, nach denen die transduced EG vernickelt für Infektion oder in flüssigem Stickstoff eingefroren.

3. Infektion der ausgestrahlt EG mit KSHV

  1. am Tag vor der Infektion ernten EG durch enzymatische Verdauung mit der kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung, wie oben beschrieben. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 1 mL der EGM. Verwenden Sie 5 µL Zellen, um eine 1/10-Verdünnung in Trypan blau vorzubereiten. Lebende Zellen mit einem Hemocytometer zu zählen und Samen 2,5 x 10 5 lebende Zellen in 2 mL EGM pro Bohrloch in 6-well-Platten.
  2. Am Tag der Infektion entfernen EGM waschen Zellen mit 3 mL PBS mit Calcium und Magnesium pro Bohrloch, und fügen Sie dann 2 mL EBM.
    Hinweis: Es ist unerlässlich, EBM, anstatt EGM während der Infektion, zu verwenden, wie das Heparin in EGM Viruspartikel zu Bindung und anschließende Infektion des Ziels EC hemmen wird
  3. Zellen mit KSHV, infizieren 5 bis 20 µL Virus Brühe in jede Vertiefung und wirbeln Teller mischen. Für Mock-infizierten Zellen ein gleiches Volumen an TNE Puffer in jede Vertiefung hinzufügen.
  4. Zentrifugieren Sie Platten bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 90 min.
  5. , Wenn das Ziel der Studie werden frühe Ereignisse erfordern eine synchrone virale Infektion, z.B. frühe Ereignisse in de Novo Infektion untersucht soll entfernen das virale Inokulum an dieser Stelle. Spülen und refeed Zellen mit 2 mL frische EGM. Andernfalls fügen 2 mL EGM und Kulturen über Nacht inkubieren.
  6. Zellen mit 2 mL EGM am Tag nach der Infektion und dann jeden zweiten Tag refeed.
  7. Wenn Zellen sind etwa 90 % Zusammenfluss Ernten durch enzymatische Verdauung mit kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung wie oben beschrieben, dann die Zellen aus drei Brunnen in einem T75 unter Hinweis auf die gesamte Durchgangsnummer und die Passage zu bündeln nach der Infektion.
  8. Erweitern Mock und KSHV-infizierten EG mit 1:3 Zwischenzeiten für mindestens zwei weitere Passagen zu welchem Zeitpunkt Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren oder in Experimenten verwendet werden können.
    Hinweis: Wie bei der Aufteilung der EG mit E6 und E7 ausgestrahlt, Wartung Kulturen von Mock und KSHV-infizierten Zellen sollte aufgeteilt werden vor dem Erreichen der Mündung (~ 85 bis 90 %).

4. Bestätigung Infektion mit KSHV durch Immunfluoreszenz

Hinweis: Erkennung von der KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA-1/ORF73) bietet eine zuverlässige quantitative Messung der Infektion. Anti-LANA-Antikörper sind im Handel erhältlich.

  1. Am Tag vor der Färbung, Platte zwei Brunnen, die jeweils mit Mock-KSHV-infiziert oder EG auf einer 24-Well-Platte 1 x 10 5 pro Zellen nun in 1 mL EGM und über Nacht inkubieren.
  2. Waschen Zellen zweimal mit 500 µL PBS plus Calcium und Magniseum. Waschen für 30 s auf einem schaukelnden Plattform.
  3. Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur in einem extern-beatmete Dampfhaube befestigen.
  4. Waschen Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer (0,1 % Triton x-100 plus 0,02 % Ziegenserum in PBS plus kationen).
  5. Zellen mit 500 µL 2 % Ziegenserum in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur blockieren.
  6. Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.
  7. Kennzeichnen einen Brunnen von Mock-KSHV-infiziert oder EG mit 200 µL Primärantikörper 01:10 verdünnt0 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Inkubieren Sie die verbleibenden zwei Brunnen in 200 µL Waschpuffer nur.
  8. Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.
  9. Beschriften aller vier Brunnen mit 200 µL Sekundärantikörper verdünnt 1: 100 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rocker.
  10. Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.
  11. In jede Vertiefung gelten 20 µL Montage mittlerer mit DAPI und ein Deckglas und bewerten Färbung mit einem inversen Mikroskop fluoreszierende.
  12. Bestimmen die prozentuale Infektion KSHV-infizierten Zellen durch zählen der Anzahl der LANA-positiven Kerne in mindestens 200 Zellen. Infektion mit rekombinanten KSHV-Bac16 sich auch durch Beobachtung der Kulturen für den Ausdruck der GLP lässt.

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Representative Results

Die Morphologie der primären EG wird klassisch als "Kopfsteinpflaster" beschrieben, und diese Morphologie wird nicht durch Ausdruck der Papillomavirus E6 und E7 Gene (Abbildung 1A) verändert. Ausdruck der E6 und E7 Gene allein nicht dazu veranlassen, einen veränderten Phänotyp; so Zellen sind anfällig für Hemmung wenden Sie sich an und werden nicht mehr geteilt beim Zusammenfluss in Kultur zu erreichen. Die Zellen werden jedoch vermehren und nachwachsen, Zusammenfluss von Trypsinization und replating auf eine geringere Dichte, so dass für die Pflege Alter und Durchgang abgestimmt Kulturen für den Einsatz als Mock-infizierten Kontrollen.

Infektion der E6/E7-ausgestrahlt EG mit KSHV verursacht dramatische morphologische Veränderungen in Kultur, die erinnert an die "Spindel Zelle" Phänotyp in KS-Läsionen (Abbildung 1 b) beobachtet werden. Ein transformierter Phänotyp ist auch nach Infektion mit KSHV, induziert, was ist Manifest teilweise durch Verlust des Kontakt-Hemmung, wenn Zellen kultiviert nach dem Zusammenfluss (Abbildung 1) und Anchorage-unabhängige Wachstum in weichen Agar (Abbildung 2) sind. Kontakt-Hemmung und die Abhängigkeit der extrazellulären Matrix Interaktionen (Verankerung) während der Onkogenese sind zwei Kennzeichen des zellulären Transformation36. Es ist wichtig zu beachten, dass primäre EG sind auch anfällig für Infektionen mit KSHV und Primärsysteme EG äußerst wertvoll wurden für die Aufklärung diverse Aspekte von Virus-Wirt-Interaktion und deren Folgen. Solche Studien sind in der Literatur gut vertreten und einige Beispiele werden hier zitiert37,38,39,40,41,42,43 ,44.

Immunofluorescent Färbung zeigt, dass die Spindel Morphologie der KSHV-infizierten Zellen Expression der viralen Proteins LANA-1/ORF73 (Abbildung 3A und 3 b, rot) zugeordnet ist. Wie die Konzentration des Virus in Aktien zwischen Zubereitungen variieren, sollte das Volumen des Virus pro Bohrloch hinzugefügt angepasst werden, so dass KSHV-infizierten Kulturen erreichen > 90 % Infektion innerhalb von ein oder zwei Passagen. Mit seriellen Passage der Prozentsatz der Infektion wird 100 % nähern und erhalten für die Dauer der Kultur (ca. 20 Stellen). Geringere Mengen des Virus können verwendet werden, wenn eine Studie parakrine Einflüsse werden soll oder wenn benachbarte nicht infizierte Zellen als Steuerelemente (z. B.für Immunfluoreszenz Studien mit anderen interessierenden Proteine) wünschenswert sind. Infizierten Kulturen unterstützen auch Ausdruck der lytischen virale Proteine, aber wie in KS-Läsionen beobachtet wird, wird nur eine Minderheit der Zellen in Kultur spontan lytische Reaktivierung (Abb. 3 b, grün) unterzogen. Zellen, die infizierte KSHV-BAC16, die mit GFP versehen ist, entwickeln auch eine Spindel Morphologie (Abbildung 3 und 3D). Wenn KSHV-BAC16 verwendet wird, können virale Titer durch Zellen mit einem seriell verdünnt konzentrierter Virus zu infizieren und Bewertung von Zellen für die GFP Expression bei 48 h Post Infektion mit Flow Cytometry30erreicht werden.

Für rekombinante und WT-Virus können viraler Genome in Lager Zubereitungen auch durch die Reinigung der DNA aus infizierten Zellen, gefolgt von PCR-Quantifizierung der KSHV DNA-Ebenen gemessen werden; Allerdings sollte man nicht davon ausgehen, dass alle Genome infektiöse45sind. Ist die Studie des KSHV lytischen Zyklus bestimmt, Virus-Reaktivierung lässt durch Stimulierung EG mit Induktion Agenten wie oben beschrieben für BCBL-1-Zellen, obwohl die Effizienz der Reaktivierung unteren23ist. Der lytische Zyklus kann auch durch Transduktion der EG mit dem KSHV Transaktivator Protein ORF5046induziert werden. Einklang mit Ergebnissen in anderen Kultur Zellmodellen KS, spontanen Ausdruck und chemische Induktion KSHV lytische Gene in E6/E7-Ausdruck EG sinkt im Laufe der Zeit trotz Wartung eine stabile latente Infektion11,16 .

Figure 1
Abbildung 1: Morphologie der Mock- und KSHV infiziert EC (A) Mock-infizierten EG Monolagen Ausstellung der klassischen Kopfsteinpflaster Stein Auftritt von lebenswichtigen Phasenkontrastmikroskopie. Ohne die Aktionen der KSHV Gene werden dieser Zellen werden nicht umgewandelt und daher nicht mehr geteilt und Kontakt Hemmung beim Zusammenfluss in Kultur zu erreichen. (B) KSHV-infizierten Zellen entwickeln dagegen eine längliche "Spindel" Zellmorphologie erinnert an KS Spindel Zellen. Dieses Fenster zeigt die Morphologie der KSHV-infizierten Zellen am Tag 5 PI beim Zusammenfluss erreichen. (C) In KSHV-infizierten Zellen führen umfangreiche Änderungen im Genausdruck Wirt Zelle zellulären Transformation, die offensichtlich werden, wenn KSHV-infizierten Zellen ohne Durchgang kultiviert werden. Unter diesen Bedingungen weiter KSHV-infizierten Zellen wuchern auch nach Zusammenfluss, die zur Entwicklung von mehrschichtigen Brennpunkte der Zellen zu erreichen. Dieses Fenster zeigt die Morphologie der KSHV-infizierten Zellen am 14. Tag PI, für 9 Tage nach dem Zusammenfluss kultiviert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Anchorage unabhängiges Wachstum. Untransformierten Zellen durchlaufen in der Regel apoptotischen Zelltod nach Verlust des Kontaktes mit einem Substrat, einen Prozess namens Anoikis. (A) wenn E6/E7-ausgestrahlt Mock-infizierten EG, die nicht transformiert, in weiche Agar suspendiert und für zwei Wochen, die Sie nicht Kolonien bilden kultiviert. (B) KSHV-infizierten EG, der Virus verwandelt werden, sind resistent gegen Anoikis und bilden Kolonien in weichen Agar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Demonstration der viralen Proteinexpression. (A) die Spindel Morphologie ist offensichtlich nach Infektion mit KSHV (40 X Vergrößerung). (B) Immunofluorescent Färbung desselben Feldes gezeigt in (A) zeigt, dass die Spindel Morphologie Expression des Proteins virale Latenz ORF73 (rot) zugeordnet ist. Infizierte Zellen unterstützen lytische Virusreplikation ebenso, wie ein kleiner Prozentsatz der Zellen, die mit dem Ausdruck der viralen Profis zeigtCessivity Faktor ORF59 (grün). (A und B von Referenz26geändert.) Die Spindel Morphologie der Zellen, die infizierte KSHV-BAC16 Virus (C) ist Ausdruck der GFP (D) zugeordnet (20 X Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Onkogenese ist ein mehrstufiger Prozess, der wichtige Sicherheitsvorkehrungen innerhalb eines Organismus36umgeht. KS-Läsionen entlang ein Spektrum der chronischen Entzündung zu wahren Sarkome bestehen, erfordert Aufklärung bestimmter pathophysiologischen Prozesse durch KSHV vermittelt, dass einige Studien in Zellmodellen Kultur durchgeführt werden, die Umwandlung9unterstützen. Es sollte angemerkt werden, dass Verlust von Kontakt-Hemmung und Anchorage-abhängigen Wachstum, Phänotypen indikativ der zellulären Transformation, nicht ohne weiteres entwickeln Infektionen des primären EG oder EC verewigt durch exogene Ausdruck der Telomerase. Deshalb, während der in-vitro- Modell der KS beschrieben hier nicht alle Aspekte der KS Tumor Mikroumgebung oder Verhalten von explantierten KS-Zellen rekapitulieren, ist es eindeutig geeignet für die Untersuchung von Veränderungen der Host Zelle Genexpression induziert durch eine Infektion mit KSHV, die KS Tumorgenese beitragen.

Die erste berichtet, dass gen-Expressions-profiling Studie hierin beschriebene Kultursystem mit der Rezeptor-Tyrosin-Kinase c-Kit als ein Beitrag zu den transformierten Phänotyp KSHV-infizierten Zellen25identifiziert. Von c-Kit-Ausdruck mit SiRNA niederzuschlagen oder Hemmung der c-Kit-Signal über eine dominante negative Konstrukt oder Tyrosin Kinase-Inhibitor STI 571 (Imatinib) beeinträchtigt die verwandelnde Fähigkeit der KSHV Manifest durch Verlust von Schwerpunkten Bildung nach längerem Kultur der infizierten Zellen. Spätere klinische Auswertung der Imatinib hat die Wirksamkeit dieses Medikaments bei Patienten mit epidemischer KS47,48,49gezeigt. Andere mögliche Behandlungsziele wurden auch einschließlich Häm Cyclooxygenase-126,50, CXCR727und der Beta-adrenergen Rezeptoren28, die eine im Wachstum oder in der Umwandlung der Rolle identifiziert, EG in-vitro-. Bestätigung dieser gen-Ausdruck-Muster in der primären EG sowie KS Biopsie Gewebe bestätigt die physiologische Relevanz dieses Systems und unterstreicht seinen Wert als der präklinischen Modell KS Therapeutik25,26 51,52,53,54,55.

Eine weitere Stärke des E6/E7 Transduktion Systems ist, dass die längere Lebensdauer im Vergleich zu primären EG ermöglicht die langfristige Erhaltung der Alter und Durchgang abgestimmt Mock-infizierten Kontrollzellen für vergleichende Bewertung der Ergebnisse der KSHV verewigt Infektion. Es ist wichtig zu beachten, dass zur Maximierung der Anzahl der Passagen der EG ausgestrahlt mit E6 und E7 ist es entscheidend für die Kulturen vor dem Erreichen der Mündung (~ 85 bis 90 %) aufgeteilt. Darüber hinaus vertragen diese Zellen serumfreien Bedingungen über einen längeren Zeitraum hinweg. Primäre EG schnell unterziehen programmierten Zelltod nach Wachstumsfaktor Zurücknahme und können daher kultiviert über lange Zeiträume ohne Serum oder rekombinanten Wachstumsfaktoren56,57. Diese Abhängigkeit macht autokrine Signalwege induziert durch eine Infektion mit KSHV schwer zu identifizieren und zu untersuchen, wie vor der vollständigen Umwandlung KSHV-infizierten Zellen auch programmierter Zelltod nach Wachstumsfaktor Zurücknahme (unveröffentlicht unterzogen werden (Beobachtung). Das Vorhandensein der E6 und E7 Proteine in diesem Modell, jedoch verhindern programmierten Zelltod nach Wachstumsfaktor Rückzug und ermöglichen längere (z.B.48 h) Kultur im niedrigen Serum oder Serum gratis mittlere25,26 , 28.

KS ist eine komplexe und ungewöhnliche Erkrankung mit chronischer Entzündung und zellulären Transformation. Der klinische Bedarf für neue therapeutische Strategien ist groß, und die hierin beschriebenen Zellmodell für Kultur hat einzigartige Eigenschaften, die Bewertung der Kandidaten Drogeziele.

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Disclosures

Keine.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch K12 HD068322 (SCM) unterstützt; R01 CA179921 und P51 OD011092 (AVM); und 14PRE20320014 aus Amerika Heart Association (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Krebs-Biologie Ausgabe 126 Kaposi-Sarkom primären Erguss Lymphome KSHV Transformation Onkogenese Endothelzellen
Ein <em>In-vitro- </em>Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus
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McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

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