Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inducido por infección con el virus oncogénico herpesvirus-8/KS el herpesvirus humano (HHV-8/KSHV). El modelo de cultura de célula endotelial descrito aquí está especialmente preparado para el estudio de los mecanismos por los cuales KSHV transforma las células del huésped.

Abstract

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inusual compuesto por proliferación de las células del huso que se inicia por la infección de células endoteliales (CE) con KSHV y se desarrolla más a menudo en el ajuste de la immunosupresión. A pesar de décadas de investigación, un tratamiento óptimo de KS permanece pobremente definido y los resultados clínicos son especialmente desfavorables en contextos con recursos limitados. Las lesiones de KS son conducidas por angiogénesis patológica, inflamación crónica y oncogénesis, y varios en vitro modelos celulares de cultura se han desarrollado para estudiar estos procesos. KS surge de las células infectadas de KSHV de origen endotelial, por lo que las células de linaje CE proporcionan el más apropiado en vitro sustitutos del precursor de la célula del huso. Sin embargo, porque CE tienen una vida útil limitada en vitro , y los mecanismos oncogénicos de KSHV son menos eficientes que los de otros virus tumorigenic, ha sido difícil de evaluar los procesos de transformación primaria o telomerasa inmortalizó EC Por lo tanto, se desarrolló un modelo de la nueva cultura basada en la EC que soporta fácilmente la transformación después de la infección con KSHV. Expresión ectópica de los genes E6 y E7 del virus del papiloma humano tipo 16 permite la extendida cultura de pareados por edad y paso mock y KSHV infectadas - CE y apoya el desarrollo de una verdadera transformación (es decir, tumorígeno) fenotipo en cultivos de células infectadas . Este modelo manejable y altamente reproducible de KS ha facilitado el descubrimiento de varias vías de señalización esenciales con alto potencial para la traducción en ajustes clínicos.

Introduction

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor angioproliferative multi-focales que afectan sitios cutáneos, mucosos y viscerales que se desarrolla más comúnmente en el ajuste de inmunosupresión avanzado1. Se han descrito cuatro formas epidemiológicas: clásico, una forma indolente que típicamente afecta a las personas mayores del patrimonio mediterráneo y de Oriente; yatrogénica, resultantes del tratamiento con fármacos inmunosupresores después del trasplante de órganos; epidemia, un definición de SIDA cáncer; y, una forma independiente de VIH común en los niños en las regiones endémicas en África. Con el advenimiento de los regímenes de medicamentos anti-retrovirales eficaz combinación para el tratamiento del VIH, mucho menos comúnmente se diagnostica la KS epidémicas en los países en desarrollo. Sin embargo, las formas endémicas y epidémicas clínicamente agresivas permanecen entre los más comúnmente diagnosticado cáncer en muchos países africanos2,3,4. Por lo tanto, la identificación de drogas orientada a patogenesia eficaces para el tratamiento del KS es una prioridad de investigación.

Histológico, las lesiones de KS son caracterizadas por neovascularización extensa pero anormal, por el que las células del huso de origen CE forma discontinua redes vasculares5. Estos vasos anormales ("hendiduras vasculares") permiten la extravasación de los eritrocitos, que lesiones su color característico. Además, las lesiones contienen numerosos leucocitos que caracterizan a la inflamación crónica (es decir, linfocitos, macrófagos y células plasmáticas). Se ha descrito regresión de las lesiones de KS después de reconstitución inmune, sugiriendo que el KS tiene características de una lesión hiper-proliferativa y un verdadero tumor6,7,8,9.

Herpesvirus de KS (KSHV), el agente causativo de KS, fue identificado en 199410. Desde entonces muchos en vitro cultura de célula han desarrollado modelos para permitir estudios de patogénesis, incluyendo las células explantados de material de biopsia de tumor y primario o CE expresan telomerasa infectados con KSHV en vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ninguno de los modelos disponibles en la actualidad totalmente recapitula el microambiente tumoral de KS, pero todos han aportado conocimientos valiosos al conocimiento de la Patobiología de la infección de KSHV. A diferencia de lo otros conocido tumorigenic herpesvirus humano virus de Epstein - Barr (EBV), KSHV no fácilmente transformar células en cultivo después de novo infección19,20,21, 22. sin embargo, esta limitación ha sido superada por transducción primaria CE humano de cualquier origen microvascular o linfática de mezclado con la E6 y E7 genes de virus del papiloma humano tipo 16 antes de la infección con KSHV23,24 . Expresión de los oncogenes exógenos aumenta dramáticamente el potencial transformador de KSHV en vitro en parte facilitando aún más la inhibición de la retinoblastoma proteína y p5323,24. Este método de transducción de la CE ha permitido múltiples laboratorios para identificar alteraciones claves en host de expresión génica de la célula que son inducidos por infección de KSHV y que parecen facilitar el KS de la célula proliferación y supervivencia25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. los protocolos descritos son simple y altamente reproducible y resultará en la generación de pareados por edad y paso CE KSHV-infectados y controles mock-infectados que pueden cultivarse para mucho más que las pilas primarias y permiten la investigación de mecanismos oncogénicos de KSHV. Aunque el protocolo incluye un método para la producción de tipo salvaje KSHV desde la línea de célula de efusión primaria en linfoma BCBL-1, CE E6/E7-inmortalizado también son altamente susceptibles a la infección con BACmid recombinante derivado KSHV-BAC1630. Protocolos para preparación de BAC16 se describen en otra parte33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nota: todos los procedimientos descritos en este protocolo deben realizarse bajo condiciones BSL-2.

1. preparación de Stock de KSHV

  1. buffer de TNE de preparar: disolver 292,24 mg EDTA en ddH 2 O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Disolver mg 605,7 Tris en ddH 2 O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Combinar soluciones de EDTA, Tris, añadir 4,38 g de NaCl, ajustar el volumen final a 500 mL, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C .
  2. De la cultura el KSHV-positivo, EBV-negativo primario de la efusión linfoma de la célula línea BCBL-1 en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO 2 en RPMI suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y antimicrobianos para aproximadamente 1 a 1.2 x 10 6 células / mL.
  3. Para inducir la producción de KSHV, dividir culturas 1:2 con medio fresco y añadir forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a una concentración final de 20 ng/mL e incubar culturas durante 5 días. Como alternativa, tratar las células con butirato de sodio (NaB; 0,1 mM) durante 3 días inducir replicación viral lítica.
  4. Para recolectar partículas virales, primero centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para que sedimenten las células y transferir sobrenadante a tubos de nuevos cultura.
  5. Para aclarar aún más el sobrenadante con el fin de evitar la transferencia de los desechos celulares, centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: como alternativa a la centrifugación de alta velocidad para la clarificación de sobrenadantes de cultivo, filtración a través de una estéril 0.45 μm filtro puede realizarse. Hemos observado un descenso en el título mediante filtración; por lo tanto, periódicamente realizamos el segundo paso de centrifugación en su lugar.
  6. Recubierto a continuación 5 mL de solución de sacarosa de 25% en buffer TNE con aproximadamente 30 mL de la cultura clarificado sobrenadante en 6 tubos de ultracentrífuga.
  7. Centrífuga balanceado tubos a 75.000 x g durante 2 h a 4 ° C en vacío.
  8. Decantar sobrenadante de cultivo seque el borde de cada tubo para quitar tanta solución sobrenadante y sacarosa como sea posible, y resuspender el precipitado de virus, que puede no ser visible, en 150 μL de tampón TNE de.
  9. Virus de la piscina todas suspendida, mezcle bien y congelar alícuotas de μl 25 a -80 ° C .

2. Transducción de la CE con Papillomavirus Genes E7 y E6

Nota: Habitualmente utilizamos frascos de cultivo de tejido estándar para el cultivo de EC primaria Sin embargo, si el insuficiente crecimiento de la CE se obtiene entonces el uso de frascos de cultivo comercial debe considerarse.

  1. Cultura primaria humana dérmica microvascular o linfático CE en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO 2 en un medio de EC (EGM; contiene medio basal de CE [EBM] complementado con EGM-2 BulletKit [que contiene FBS, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblasto humano-B, factor de crecimiento vascular CE, factor de crecimiento insulínico-1, ácido ascórbico, factor de crecimiento epitelial humano, antibióticos y heparina]) en un matraz de cultivo celular T75 a aproximadamente 50% de confluencia.
  2. Para la transducción, cultura PA317 LXSN 16E6E7 células 24 , 35 en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO 2 en DMEM suplementado con 10% FBS y antimicrobianos en un Frasco de cultura de T150 celular hasta aproximadamente 90% confluente. Luego incubar durante una noche en 16 mL de medio.
  3. Aclarar el medio PA317 por centrifugación a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Retire el EGM las células CE cultura y sobreimpresión con 12 mL de medio PA317 clarificado e incubar durante 4 h.
    Nota: Centrifugación 16 mL de medio condicionado a 300 x g para obtener resultados de 5 min en un pellet compacto que no es perturbada por el retiro subsecuente cuidado de 12 mL de sobrenadante clarificado. Sin embargo, si la transferencia de PA317 LXSN 16E6E7 células en cultivos primarios de CE es una preocupación (la línea de envasado de la célula rápidamente superan CE), entonces filtración del sobrenadante condicionada a través de un filtro de 0.45 μm antes de la transferencia puede realizarse.
  5. 6 mL del medio PA317 EGM fresco e incubar durante una noche.
  6. CE de realimentación con 12 mL EGM fresco e incubar una mayor 48 h.
  7. Para la CE, el de la cultura quiten medio y con 12 mL de PBS sin cationes y añadir 3 mL de solución comercial de disociación enzimática (p. ej., TrypLE) por e incubar a 37 ° C durante 3 min.
  8. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado de células resultante en EGM fresco y dividir en 3 frascos de x T75 con un volumen final de EGM de 12 mL por frasco.
  9. Para seleccionar para CE transduced con E6 y E7, añadir G418 a una concentración final de 200 μg/mL para los dos pasos, después de que la CE transduced puede ser plateada para infección o congelada en nitrógeno líquido.

3. Infección de CE-Transduced KSHV

  1. en el día antes de la infección cosecha CE por digestión enzimática, mediante la solución comercial disociación enzimática como se describió anteriormente. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de EGM. Utilice 5 μl de las células para preparar una dilución 1/10 en tripán azul. Contar células vivas usando un hemocitómetro y semilla de 2.5 x 10 5 células vivas en 2 mL de EGM por pozo en 6 placas bien.
  2. En el día de la infección, quiten EGM y células con 3 mL de PBS con calcio y magnesio por pozo, y luego agregar 2 mL EBM.
    Nota: Es esencial utilizar la EBM en lugar de EGM durante la infección, como la heparina en EGM inhibirá de partículas virales a y posterior infección de blanco EC
  3. Para infectar las células con KSHV, añadir caldo de virus de 5 a 20 μl en cada pocillo y agitar la placa para mezclar. Para las células infectadas de mock agregue un volumen igual de buffer TNE a cada pocillo.
  4. Centrifugue las placas a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente y luego incubar las placas a 37 ° C durante 90 min.
  5. Si el objetivo del estudio es investigar los acontecimientos tempranos que requieren una sincrónica infección viral, por ejemplo, los acontecimientos tempranos de la infección de novo, eliminar el inóculo viral en este punto. Enjuague y realimentación de las células con 2 mL fresco EGM. De lo contrario, añadir 2 mL EGM e incubar los cultivos durante la noche.
  6. Realimentación a las células con 2 mL EGM el día después de la infección y luego cada dos días.
  7. Cuando las células son aproximadamente 90% confluente, cosecha por digestión enzimática con solución comercial disociación enzimática como se describe anteriormente, a continuación, las células de los tres pozos en un T75, señalando el número de paso total y paso de la piscina infección post.
  8. Ampliar mock y KSHV infectadas - CE con divisiones de 1:3 para por lo menos dos pasajes más, momento en el que las células pueden utilizarse en experimentos o congeladas en nitrógeno líquido.
    Nota: Como con la división de la CE transduced con E6 y E7, culturas de mantenimiento de las células infectadas de mock y KSHV deben dividirse antes de llegar a confluencia (~ 85 a 90%).

4. confirmación de la infección con KSHV por inmunofluorescencia

Nota: detección de KSHV asociado a latencia nuclear antígeno (LANA-1/ORF73) proporciona una medida cuantitativa fiable de infección. Anticuerpos anti-LANA están disponibles en el mercado.

  1. El día antes de la tinción, placa dos pozos cada uno con mofa o KSHV infectadas - CE en una placa de 24 pocillos a 1 x 10 5 células por bien en 1 mL EGM e incubar durante una noche.
  2. Células de lavado dos veces con 500 μl de PBS plus calcio y magniseum. Lavar durante 30 s en una plataforma oscilante.
  3. En una capilla del humo ventillated externamente, fijar las células con 500 μl de paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
  4. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado (0,1% Tritón X-100 y 0,02% de suero de cabra en PBS más cationes).
  5. Bloque de células con 500 μl de suero de cabra 2% en tampón de lavado durante 30 min a temperatura ambiente.
  6. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado.
  7. Etiqueta bien de mofa o KSHV infectadas - CE con 200 μL de anticuerpo primario diluido 1:100 en tampón de lavado durante 30 min a temperatura ambiente en un eje de balancín. Incubar los dos pozos restantes en 200 μL de tampón de lavado solo.
  8. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado.
  9. Etiqueta todos los cuatro pozos con 200 μL del anticuerpo secundario diluido 1: 100 en tampón de lavado durante 30 min a temperatura ambiente en un eje de balancín de.
  10. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado.
  11. a cada pocillo aplicar 20 μl de DAPI que contiene medio y un cubreobjetos de montaje y evaluar coloración usando un microscopio fluorescente invertido.
  12. Determinar la infección por ciento de las células infectadas de KSHV contando el número de núcleos de LANA-positivo en por lo menos 200 células. Infección con recombinante KSHV-Bac16 también puede ser monitoreados a través de la observación de las culturas de expresión de GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La morfología de la primaria CE se describe clásicamente como "piedra del adoquín", y esta morfología no se altera con expresión de los papillomavirus E6 y E7 genes (figura 1A). Expresión de los genes E6 y E7 solo no induce un fenotipo transformado; así, las células son susceptibles a la inhibición de contacto y dejan de dividir al llegar a la confluencia en la cultura. Las células sin embargo proliferar y crecer hasta confluencia tripsinización y replating en una densidad más baja, permitiendo el mantenimiento de cultivos pareados por edad y paso para uso como controles infectados mock.

Infección de E6/E7-transduced CE KSHV provoca cambios morfológicos drásticos en la cultura del "la célula del huso" fenotipo observado en lesiones de KS (figura 1B). Un fenotipo transformado también es inducido por infección con KSHV, que es manifiesto en parte por la pérdida de la inhibición de contacto cuando las células son cultivada confluencia posterior (Figura 1) y crecimiento independiente de anclaje en agar suave (figura 2). Pérdida de la inhibición de contacto y la dependencia de las interacciones de la matriz extracelular (anclaje) en oncogénesis son dos de las características de transformación celular36. Es importante señalar que CE primaria también son susceptibles a la infección con KSHV y sistemas CE primaria han sido extremadamente valiosos para dilucidar diversos aspectos de la interacción virus-huésped y sus consecuencias. Estos estudios están bien representados en la literatura y varios ejemplos se citan en el presente37,38,39,40,41,42,43 ,44.

Tinción inmunofluorescente demuestra que la morfología del huso de las células infectadas de KSHV se asocia con expresión de la proteína viral LANA-1/ORF73 (Figura 3A y 3B, rojo). Como la concentración del virus en las poblaciones varían entre preparativos, el volumen de virus agregado por pozo debe ajustarse para que lleguen cultivos infectados de KSHV > 90% de infección en uno o dos pasos. Con serial paso el porcentaje de infección acercará a 100% y se mantendrá durante la duración de la cultura (pasajes aproximadamente 20). Cantidades menores de virus se pueden utilizar si se pretende un estudio de influencias paracrina, o si las células no infectadas adyacentes son deseables como controles (por ejemplo, para estudios de inmunofluorescencia con otras proteínas de interés). Cultivos infectados también apoyan la expresión de proteínas virales líticas, sin embargo, como se observa en lesiones de KS, sólo una minoría de células en cultivo espontáneamente se someten a reactivación lítica (figura 3B, verde). Células infectadas con KSHV-BAC16, que es etiquetado con GFP, también desarrollan una morfología del huso (figura 3 y 3D). Cuando se utiliza BAC16 de KSHV, títulos virales pueden obtenerse por infectar las células con un stock de virus concentrados diluidos en serie y la evaluación de las células por la expresión de GFP en infección de post 48 h mediante citometría de flujo30.

Para recombinante y virus de la WT, genomas virales en stock preparados también pueden ser medidas por purificar el ADN de las células infectadas seguido por cuantificación de PCR de los niveles de ADN de KSHV; sin embargo, uno no debe asumir que los genomas son infecciosas45. Si se pretende el estudio del ciclo lítico de KSHV, reactivación del virus puede conseguirse estimulando CE con inducción de agentes como se describió anteriormente para las células BCBL-1, aunque la eficacia de la reactivación es baja23. El ciclo lítico también puede ser inducido por transducción de la CE con la proteína del transactivator KSHV ORF5046. Consistente con hallazgos en otros modelos de la cultura de célula de KS, expresión espontánea y la inducción química de KSHV lytic genes E6/E7-expresión CE disminuye con el tiempo a pesar del mantenimiento de una infección latente estable11,16 .

Figure 1
Figura 1: morfología de mock y KSHV infectaron EC (A) CE infectados Mock monocapas muestra el clásico adoquín de aspecto piedra por microscopía de contraste de fase vital. Sin las acciones de los genes KSHV estas células no se transforman por lo tanto dejan de dividirse y exhiben inhibición de contacto al llegar a la confluencia en la cultura. Las células infectadas de KSHV (B), por el contrario, desarrollan una morfología alargada "célula del huso" de las células del huso de KS. Este panel muestra la morfología de las células infectadas de KSHV en día 5 PI al llegar a la confluencia. (C) las células infectadas en KSHV, grandes cambios en la expresión génica de anfitrión de la célula conducen a transformación celular, que se hace evidente cuando se cultivan células infectadas KSHV sin pasaje. Bajo tales condiciones, las células infectadas de KSHV siguen proliferando incluso después de llegar a confluencia hacia el desarrollo de focos varias capas de células. Este panel muestra la morfología de las células infectadas de KSHV en día 14 PI, cultivada por confluencia después de 9 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: crecimiento independiente de anclaje. Las células transformadas generalmente se someten a la muerte por apoptosis de la célula después de la pérdida de contacto con un sustrato, un proceso denominado anoikis. (A) cuando E6/E7-transduced infectados mock CE, que no se transforman, son suspendidos en agar suave y cultivadas durante dos semanas no forman colonias. (B) infectados de KSHV CE, que son transformados por el virus, son resistentes a la anoikis y formará colonias en agar suave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: demostración de la expresión de la proteína viral. (A) la morfología del huso es evidente después de la infección con KSHV (40 aumentos). (B) coloración inmunofluorescente del mismo campo que se muestra en (A) demuestra que la morfología del huso se asocia con expresión de la latencia viral proteína ORF73 (rojo). Las células infectadas soporte replicación viral lítica así, según lo demostrado por un pequeño porcentaje de células que expresan la pro viralcessivity factor ORF59 (verde). (A y B modificados de la referencia26). La morfología del huso de células infectadas con virus KSHV-BAC16 (C) se asocia con expresión de GFP (D) (20 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oncogénesis es un proceso multietapa que eluda la seguridad dentro de un organismo36. Como lesiones KS existen a lo largo de un espectro de inflamación crónica a los verdaderos sarcomas, la aclaración de ciertos procesos fisiopatológicos mediados por KSHV requiere algunos estudios en modelos de cultivo celular que apoyan transformación9. Cabe señalar que no fácilmente se desarrollan pérdida de la inhibición de contacto y crecimiento dependiente de anclaje, fenotipos indicativos de transformación celular, después de la infección primaria CE o EC inmortalizado por expresión exógena de telomerasa. Por lo tanto, mientras que el modelo de vitro de KS se describe aquí no recapitular todos los aspectos del microambiente tumoral de KS o comportamiento de las células explanted de KS, está especialmente preparado para estudiar los cambios en los genes de la célula anfitrión inducida por la infección con KSHV que contribuyen a la tumorigénesis KS.

El primer divulgó expresión génica perfiles de estudio utilizando el sistema de cultivo que se describe en este documento identificó el receptor tirosina quinasa c-Kit como colaborador el fenotipo transformado de las células infectadas de KSHV25. Derribar de la expresión de c-Kit usando siRNA o inhibición de c-Kit de señalización con un dominante negativo construcción tirosina quinasa inhibidor o STI 571 (Imatinib) interfiere con la capacidad transformadora de manifiesto KSHV por pérdida de la formación de focos después de prolongada cultura de las células infectadas. Posterior evaluación clínica de Imatinib ha demostrado la eficacia de este fármaco en pacientes con KS epidémicas47,de48,49. Otros posibles objetivos de tratamiento también han sido identificados, incluyendo la hemo oxigenasa-126,50, CXCR727y beta receptores adrenérgicos28, todos los cuales desempeñan un papel en el crecimiento o transformación de CE in vitro. Confirmación de estos patrones de expresión génica en primaria CE así como tejido de la biopsia de KS confirma la relevancia fisiológica de este sistema y pone de relieve su valor como un modelo preclínico de KS terapéutica25,26, 51,52,53,54,55.

Otro punto fuerte del sistema de transducción de E6/E7 es que la vida útil extendida de inmortalizado en comparación con la primaria CE permite el mantenimiento a largo plazo de células paso comparable mock-infectados del control para la evaluación comparativa de los resultados de KSHV y edad infección. Es fundamental tener en cuenta que con el fin de maximizar el número de pasajes de la CE transduced con E6 y E7 es fundamental dividir las culturas antes de llegar a confluencia (~ 85 a 90%). Además, estas células toleran condiciones libre de suero para largos períodos de tiempo. Primaria CE rápidamente sufren muerte celular programada sobre el retiro del factor de crecimiento y por lo tanto no pueden ser cultivado durante largos períodos sin suero o factores de crecimiento recombinantes56,57. Esta dependencia hace rutas inducidas por la infección con KSHV difícil de identificar y estudiar, como antes de la completa transformación células infectadas KSHV también serán sometido a la muerte celular programada sobre el retiro del factor del crecimiento (inédito de señalización autocrina observación). La presencia de las proteínas E6 y E7 en este modelo, sin embargo, prevenir la muerte celular programada después del retiro del factor de crecimiento y permiten prolongados (p. ej., 48 h) cultura en bajo del suero o sérica libre medio25,26 , 28.

KS es una enfermedad compleja e inusual con las características de la inflamación crónica y transformación celular. La necesidad clínica de nuevas estrategias terapéuticas es grande, y el modelo de cultivo celular descrito tiene propiedades únicas que permiten la evaluación del candidato dianas farmacológicas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el HD068322 K12 (SCM); CA179921 r01 y P51 OD011092 (AVM); y 14PRE20320014 de la Asociación America del corazón (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Biología del cáncer número 126 sarcoma de Kaposi linfoma primario de la efusión KSHV transformación oncogénesis célula endotelial
Un modelo <em>In Vitro </em>para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter