Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon oncogenic virüs insan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) ile indüklenen bir tümördür. Burada açıklanan endotel hücre kültür model benzersiz olarak hangi konak hücreleri KSHV dönüşümleri mekanizmaları eğitim için uygundur.

Abstract

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon KSHV ile endotel hücrelerinin (EC) tarafından başlatılan ve en sık immünosupresyon ayarında geliştirir Proliferasyona iğ hücreleri oluşur alışılmadık bir tümör var. Onlarca yıllık araştırma rağmen KS en uygun tedavi kötü tanımlanmış kalır ve klinik sonuçlar kaynak sınırlı ayarları özellikle olumsuz. KS lezyonlar patolojik anjiogenezi, kronik inflamasyon ve oncogenesis tarafından tahrik edilmektedir ve bu süreçlerin çalışmaya çeşitli vitro hücre kültür modelleri geliştirilmiştir. EC-lineage hücreleri Spindl Hücre habercisi en uygun vitro vekilleri sağlamak böylece KS endotel kökenli KSHV enfekte hücrelerden doğar. Ancak, AK bir sınırlı vitro ömrü olduğundan ve KSHV tarafından istihdam oncogenic mekanizmaları daha az bu tumorigenic diğer virüsler daha verimli olduğu gibi bu ilkokulda dönüştürme işlemleri değerlendirmek zor olmuştur ya da Revers ölümsüzleştirilmiş EC Bu nedenle, bir roman kültür EC tabanlı model kolayca KSHV mantar enfeksiyonu takip dönüşümü destekleyen geliştirilmiştir. HPV tip 16 E6 ve E7 genlerinin Ektopik ifade genişletilmiş kültür, yaş ve geçiş Bahisler sahte ve KSHV-enfekte EC için izin verir ve gerçekten dönüştürülmüş gelişimini destekleyen (yani tumorigenic) enfekte hücre kültürlerinde fenotip . KS bu uysal ve son derece tekrarlanabilir model klinik ayarları içine çeviri için yüksek potansiyele sahip birkaç temel sinyal yolları keşfi kolaylaştırdı.

Introduction

Kaposi sarkomu (KS) en çok geliştiren gelişmiş bağışıklık suppression1ayarı dermal, Mukozal ve visseral sitelerini etkileyen bir multifokal angioproliferative tümördür. Dört epidemiyolojik formu tarif edilmiştir: Klasik, genellikle Akdeniz ve Orta Doğu mirası; büyük insanı etkileyen bir tembel formu iyatrojenik, organ nakli takip immünsupresif ilaçlar ile tedavi sonucunda; salgın, bir AIDS tanımlama kanser; ve endemik, Afrika endemik bölgelerde çocuklarda yaygın bir HIV bağımsız formu. HIV tedavisinde etkili kombinasyonu anti-retroviral uyuşturucu rejimleri gelişiyle, salgın KS gelişmekte olan ülkelerde daha az yaygın olarak teşhis edilir. Ancak, klinik olarak agresif endemik ve salgın formları arasında en sık tanı kanser birçok Afrika ülkeleri2,3,4kalır. Bu nedenle, kimlik KS tedavisi için Patogenez hedefli etkili ilaçların bir araştırma önceliktir.

Histolojik olarak, KS lezyonlar geniş ama anormal neovaskülarizasyon sayede iğ hücreleri EC kökenli kesintili damar ağları5formu karakterizedir. Bu anormal gemiler ("vasküler yırtmaçlı") lezyonlar onların karakteristik renk ver eritrositler ekstravazasyonu izin. Ayrıca, lezyonlar kronik inflamasyon (yani, lenfosit, makrofaj ve plazma hücreleri) karakterize çok sayıda lökosit içerir. KS proliferatif hiper lezyon ve bir gerçek tümör6,7,8,9özelliklere sahiptir düşündüren regresyon bağışıklık sulandırma takip KS lezyonların tanımlanmıştır.

KS herpesvirus (KSHV), KS, hastalığının 199410dakika sonra tespit edilmiştir. Modeller geliştirilmiştir sonra birçok vitro hücre kültürü beri Patogenez çalışmalar etkinleştirmek için hücreleri de dahil olmak üzere tümör biyopsi malzeme ve ilköğretim explanted veya EC Revers ifade KSHV vitro11 ile enfekte , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. mevcut modelleri hiçbiri tam olarak KS tümör microenvironment tablodur, ama tüm değerli bilgi KSHV enfeksiyon pathobiology anlayışımız için bulunmuştur. Diğer bilinen tumorigenic insan herpesvirus Epstein - Barr virüsü (EBV), KSHV kolayca hücre kültüründe de novo enfeksiyon19,20,21, takip dönüştürmek değil 22. ancak, bu sınırlama birincil insan EC ya mikrovasküler veya lenfatik kökenli E6 ile karışık transducing tarafından üstesinden ve HPV E7 genler 16 KSHV23,24 mantar enfeksiyonu önce yazın . Bu eksojen oncogenes ifade önemli ölçüde KSHV vitro dönüşüm potansiyelini kısmen daha fazla Retinoblastom protein ve p5323,24inhibisyonu sağlayarak artırır. Bu EC iletim yöntemi ev sahibi anahtar değişiklikleri tanımlamak için birden çok laboratuvarlar bu KSHV enfeksiyon tarafından indüklenir ve KS hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı25,26 kolaylaştırmak için görünen hücre gen ekspresyonu izin verdi , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. burada açıklanan protokoller basit ve son derece tekrarlanabilir ve üretimi Primer hücre daha çok uzun süre kültürlü ve sahte enfekte kontrol eder ve yaş ve geçiş Bahisler KSHV enfekte EC neden olur oncogenic mekanizmaları KSHV tarafından istihdam incelenmesi için izin verir. Protokol vahşi KSHV satırından birincil efüzyon Lenfoma hücre BCBL-1, E6/E7-ölümsüzleştirilmiş EC de son derece duyarlı türü üretim için bir yöntem bulunmasına karşın rekombinant BACmid ile enfeksiyon KSHV-BAC1630türetilmiş. İletişim kuralları BAC16 hazırlanması için başka bir yerde açıklanan33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bu protokol için açıklanan tüm yordamları BSL-2 koşullar altında gerçekleştirilmelidir.

1. KSHV hisse senedi hazırlık

  1. hazırlamak TNE arabellek: 292.24 mg EDTA GKD 2 O dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. GKD 2 O 605.7 mg Tris dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. EDTA ve Tris çözümleri birleştirmek, 4,38 g NaCl ekleyin, 500 ml nihai ses düzeyini ayarlama, filtre sterilize ve mağaza 4 ° C'de .
  2. Kültür KSHV pozitif, 37 ° C artı % 5 CO %2 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS) ve yaklaşık 1 antimicrobials ile takıma RPMI oksijen bir kuluçka EBV negatif birincil efüzyon Lenfoma hücre kültürünü BCBL-1 1.2 mL başına 10 6 hücre x için.
    3. KSHV üretim, ikna etmek için
  3. kültürler 1:2 taze orta ile bölünmüş ve 20 ng/mL nihai bir konsantrasyon Phorbol 12-Myristate 13-asetat (PMA) ekleyin ve kültürler için 5 gün kuluçkaya. Alternatif olarak, sodyum bütrat (NaB; 0,1 mM) litik viral çoğaltma ikna etmek 3 gündür hücrelerle tedavi.
  4. İlk viral parçacıkların hasat için 300 x g hücreleri cips ve supernatants taze tüpler aktarmak için oda sıcaklığında 5 min için de süpernatant kültür santrifüj kapasitesi..
  5. Daha da böylece hücresel enkaz, transferini önlemek için süpernatant netleştirmek için santrifüj kapasitesi 2500 x g 10 min için de 4'te ° C.
    Not: Alternatif olarak yüksek hızlı Santrifüjü için açıklama kültür supernatants, filtrasyon yoluyla bir steril 0.45 µm filtre gerçekleştirilebilir. Filtrasyon kullanarak titresi önemli bir düşüş gözlemledik; Bu nedenle, biz düzenli olarak ikinci Santrifüjü yerine adımıysa.
  6. Sonra 5 mL % 25 Sükroz çözeltisi TNE arabelleği ile yaklaşık 30 mL 6 ultracentrifuge tüplerde süpernatant açıklık kültürünün yerleşimi.
  7. Santrifüj tüpleri 75.000 x g vakum altında 4 ° C'de 2 h için de dengeli.
  8. Kültür süpernatant dikkatle boşaltmak ve mümkün olduğu kadar süpernatant ve sukroz çözümü kaldırmak için her tüpün kenarında leke, sonra TNE arabellek 150 µL içinde görünür olmayabilir virüs Pelet resuspend.
  9. Resuspended havuzu tüm virüs, karıştırın ve 25 µL aliquots .-80 ° C'de dondurmak

2. EC E6 ve E7 Papilloma virüsü genler ile iletim

Not: Biz düzenli olarak birincil EC büyüyen için standart doku kültürü şişeler kullanın Ancak, EC yetersiz büyüme aldıysanız o zaman ticari kültür şişeler kullanımı düşünülmelidir.

  1. Kültür birincil insan dermal mikrovasküler veya lenfatik EC 37 ° C artı %5 oksijen bir kuluçka CO 2 EC büyüme orta (EGM; EC Bazal orta EGM-2 [içeren FBS, BulletKit ile birlikte [EBM] içerir hidrokortizon, insan fibroblast büyüme faktörü-B, vasküler EC büyüme faktörü, insülin benzeri büyüme faktörü-1, askorbik asit, insan epitelyal büyüme faktörü, antibiyotik ve heparin]) içinde bir T75 hücre kültür şişesi için yaklaşık % 50 izdiham.
  2. İletim için kültür PA317 LXSN 16E6E7 24 , 35 37 ° C de oksijen bir kuluçka artı % 5 CO 2 ile %10 FBS ve içinde antimicrobials takıma DMEM hücreleri bir Yaklaşık % 90 birleşmesi onlar kadar T150 hücre kültür cep şişesi. Sonra bir gecede kuluçkaya orta 16 mL.
  3. 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging tarafından PA317 orta netleştirmek.
  4. Açıklık PA317 Orta 12 mL EC kültür ve yerleşimi hücrelerle EGM kaldırmak ve 4 h için kuluçkaya
    Not: 300 x g eritilmiş süpernatant 12 mL dikkatli sonraki kaldırma tarafından rahatsız değil kompakt bir Pelet sonuçlarında 5 min için de şartına orta 16 mL Centrifuging. Ancak, birincil EC kültür PA317 LXSN 16E6E7 hücrelerinin transferi (ambalaj hücre kültürünü EC hızla büyümek) bir endişe ise, o zaman filtrasyon şartına süpernatant transferi önce 0,45 µm filtre aracılığıyla gerçekleştirilebilir.
  5. PA317 orta 6 mL taze EGM ile değiştirip gecede kuluçkaya.
  6. Refeed EC ile 12 mL taze EGM ve bir daha da 48 h. kuluçkaya
  7. EC alt kültür için orta kaldırın ve PBS katyonlar, olmadan 12 mL yıkayın ve ticari enzimatik ayrılma çözüm (örneğin, TrypLE) tarafından 3 mL ekleyin ve 3 dk. 37 ° C'de kuluçkaya
  8. Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak ve 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Elde edilen hücre Pelet taze EGM resuspend ve 3 x T75 şişe şişe başına 12 mL EGM son hacmi ile eşit bölün.
  9. E6 ve E7 ile transduced EC için seçmek için G418 200 µg/mL sonra transduced EC olması enfeksiyon için kaplama veya sıvı azot içinde donmuş iki pasajlar için son bir konsantrasyon ekleyin.

3. Enfeksiyon Transduced EC KSHV ile

  1. gün önce enfeksiyon EC yukarıda açıklandığı gibi ticari enzimatik ayrılma çözüm kullanarak tekrar tekrar Enzimatik sindirim tarafından hasat. Hücre Pelet EGM 1 mL resuspend. Trypan mavi bir 1/10 seyreltme hazırlamak için 5 µL hücre kullanın. Saymak bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri ve 2. 5 x 10 5 canlı hücrelerde EGM 2 mL 6 iyi plakaları bir kuyu başına tohum.
  2. Enfeksiyon gününde, EGM kaldırmak ve iyi yıkama PBS 3 mL kalsiyum ve magnezyum içeren hücreleri ve 2 mL EBM ekleyin.
    Not: EGM heparin bağlama için viral parçacıkların ve hedef EC sonraki enfeksiyon yapılmasını engeller EGM yerine EBM enfeksiyon sırasında kullanmak için gerekli gibi
  3. KSHV, hücrelerle bulaştırmak için her şey için 5 ila 20 µL virüs stok ekleyin ve karıştırmak için plaka girdap. Sahte enfekte hücreleri TNE arabelleği eşit bir birim için her şey eklemek için.
  4. Plakalar, 400 x g için oda sıcaklığında 30 dk santrifüj kapasitesi ve sonra 90 dk. 37 ° C'de plakaları kuluçkaya
    5. Çalışmanın amacı bir zaman uyumlu viral enfeksiyon, örneğin, erken de novo enfeksiyon, olaylarda gerektiren erken olayları araştırmak için ise
  5. Bu noktada viral inoculum kaldırın. Durulama ve 2 mL hücrelerle refeed taze EGM. Aksi takdirde, 2 mL EGM ekleyin ve kültürler gecede kuluçkaya.
  6. 2 mL EGM hücrelerle gün enfeksiyon ve sonra her gün sonra refeed.
    7. Hücreleri yaklaşık % 90 birleşmesi, ne zaman
  7. yukarıda açıklandığı gibi ticari enzimatik ayrılma çözüm kullanarak tekrar tekrar Enzimatik sindirim tarafından hasat, daha sonra toplam geçiş sayısı ve geçit belirterek hücreleri bir T75 içine üç kuyulardan havuz sonrası enfeksiyon.
  8. Genişletmek sahte ve KSHV-enfekte EC 1:3 bölmeleri için hangi zamanda hücreleri olabilir deneylerde kullanılan veya sıvı azot içinde donmuş en az iki daha fazla geçişleri ile.
    Not: EC E6 ve E7 ile transduced gibi bölme ile sahte ve KSHV enfekte hücreleri kültürleri bakım izdiham (~ 85-%90) ulaşmadan önce bölünmesi.

4. teyit enfeksiyon KSHV ayirt tarafından ile

Not: KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA-1/ORF73) olarak algılanmasını sağlar enfeksiyonu güvenilir niceliksel ölçüsüdür. Anti-LANA antikorlar piyasada.

  1. Boyama, önceki gün her ile sahte veya KSHV-enfekte EC 1 x 10 5 24-şey tabakta hücreleri başı plaka iki kuyu iyi 1 mL EGM ve gecede kuluçkaya.
  2. Yıkama hücreleri iki kez 500 µL PBS artı kalsiyum ve magniseum. Yıkama 30 s sallanan bir platformda.
  3. Bir harici ventillated duman başlık, 500 µL % 4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 15 dakika ile hücreleri saptamak.
  4. Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği (%0.1 Triton X-100 artı %0.02 keçi serum PBS artı Özellikler) 500 µL.
  5. Blok 500 µL % 2 keçi serum, oda sıcaklığında 30 dakika yıkama arabellekte hücrelerle.
  6. Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.
  7. Bir şey, sahte veya KSHV-1:10 EC 200 µL birincil antikor ile seyreltilmiş enfekte etiketbir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dk için yıkama arabellek 0. Yıkama arabellek yalnızca 200 µL içinde kalan iki wells kuluçkaya.
  8. Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.
  9. Tüm dört wells 200 µL ikincil antikor seyreltilmiş 1: 100 yıkama arabellekte bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika ile etiketleyin.
  10. Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.
  11. Her şey için orta içeren DAPI ve bir coverslip montaj 20 µL uygulamak ve ters bir floresan mikroskop kullanarak boyama değerlendirmek.
  12. KSHV enfekte hücreleri yüzde enfeksiyon LANA-pozitif çekirdek en az 200 hücrelerdeki sayısını sayarak belirler. Rekombinant KSHV-Bac16 da izlenen GFP ifade kültürlerin gözlem yoluyla ile enfeksiyon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Birincil EC morfolojisi klasik "Arnavut kaldırımı taşı" olarak tanımlanır ve bu Morfoloji Papilloma virüsü E6 ve E7 genlerinin (şekil 1A) ifade tarafından değiştirilmez. İfade yalnız E6 ve E7 genlerinin dönüştürülmüş bir fenotip neden değil; Böylece, hücreleri inhibisyon temas duyarlı ve izdiham kültür ulaşan üzerine bölen sona erecek. Hücreler ancak çoğalırlar ve trypsinization ve kültürlerin yaş ve geçiş Bahisler kullanmak için sahte enfekte denetimleri olarak bakım için izin veren bir daha düşük yoğunluk, replating üzerine izdiham regrow.

E6/E7-transduced EC KSHV ile enfeksiyon KS lezyonlar (şekil 1B) gözlenen "Spindl Hücre" fenotip anımsatan kültür dramatik morfolojik değişiklikler neden olur. Dönüştürülmüş bir fenotip Ayrıca KSHV, mantar enfeksiyonu üzerine hücreler kültürlü sonrası izdiham (Şekil 1 c) anchorage bağımsız büyüme yumuşak agar (Şekil 2) ne zaman ve hangi bildirimi kısmen temas inhibisyonu tarafından kayıptır indüklenen. Temas inhibisyonu ve ekstra hücresel matris etkileşimleri (ankraj) bağımlılığını oncogenesis sırasında kaybı hücresel dönüştürme36işaretlerinden ikisidir. Birincil EC de KSHV enfeksiyona duyarlı ve birincil EC sistemleri virüs ana bilgisayar etkileşimi ve sonuçları çeşitli yönlerini elucidating için son derece değerli olmuştur unutmamak gerekir. Bu tür çalışmalar literatürde temsil ve çeşitli örnekler burada işaret vardır37,38,39,40,41,42,43 ,44.

İmmünfloresan boyama KSHV enfekte hücreleri iğ morfolojisi viral protein LANA-1/ORF73 (şekil 3A ve 3B, kırmızı) ifadesi ile ilişkili olduğunu gösterir. Gibi virüs stokları konsantrasyonu hazırlıkları arasında değişir, böylece KSHV enfekte kültürler ulaşmak iyi eklendi virüs hacmi ayarlanması gereken > % 90 enfeksiyon bir ya da iki pasajlar içinde. Seri geçiş ile enfeksiyon yüzdesi % 100 yaklaşım olacaktır ve kültür (yaklaşık 20 pasajlar) süresince muhafaza edilecektir. Virüs daha düşük miktarlarda parakrin etkiler incelenmesi amaçlanmıştır yoksa bitişik etkilenmemiş hücreleri arzu denetimler (örneğin, diğer proteinler ilgi içeren ayirt Etütleri) olarak kullanılabilir. Virüslü kültürler de ifade litik viral proteinlerin destekler ancak KS lezyonlarının gözlemlediği gibi sadece bir azınlık hücre kültüründe kendiliğinden litik yeniden etkinleştirme (şekil 3B, yeşil) geçirecek. KSHV-hangi GFP ile etiketlenir, BAC16 ile enfekte hücreleri de bir Milli Morfoloji (şekil 3 c ve 3D) geliştirmek. KSHV-BAC16 kullanıldığında, viral titreleri konsantre virüs seri olarak seyreltilmiş hisse senedi içeren hücreleri bulaşmasını ve hücreleri kullanarak Akış Sitometresi3048 saat sonrası enfeksiyon, GFP ifade değerlendirme tarafından elde edilebilir.

Rekombinant ve WT virüs için hisse senedi müstahzarları viral genomları da enfekte hücreleri KSHV DNA düzeyleri PCR miktar tarafından takip DNA'dan arındırıcı tarafından ölçülebilir; Ancak, bir bütün genleri bulaşıcı45olduğunu varsayalım değil. KSHV litik döngüsü çalışması isteniyorsa, virüs yeniden etkinleştirme elde edilebilir EC reaktivasyonu verimliliğini alt23olmasına rağmen ajanlar BCBL-1 hücreler için yukarıda açıklandığı gibi inducing ile uyarıcı. Litik döngüsü de EC iletim KSHV transactivator protein ORF5046tarafından bağlı olmak. Diğer hücre kültür modellerinin KS, spontan ifade hem de bir istikrarlı latent enfeksiyon11,16 bakım rağmen zaman içinde E6/E7-ifade EC azalır KSHV litik genlerin kimyasal indüksiyon bulguları ile uyumlu .

Figure 1
Şekil 1: sahte - morfoloji ve KSHV enfekte EC (A) sahte enfekte EC monolayers sergi klasik Arnavut kaldırımı faz kontrast hayati mikroskobu tarafından taş görünümü. KSHV genler eylemleri olmadan bu hücreleri değil dönüştürülür bu nedenle bölen ateşkes ve kişi izdiham kültür ulaşan üzerine inhibisyon sergilemek. (B) KSHV enfekte hücreleri, buna ek olarak, bir uzun "Spindl Hücre" Morfoloji KS iğ hücrelerinin anımsatan geliştirmek. Bu panel KSHV enfekte hücre morfolojisi gün 5 gösterir PI kesiştiği yerde ulaşan üzerine. (C) içinde KSHV enfekte hücreleri, hangi belli olur KSHV enfekte hücreleri geçiş kültürlü zaman hücresel dönüşüm, konak hücre gen ifadesinde kapsamlı değişiklikler neden. Bu koşullar altında bile çok katmanlı foci Hücre gelişimine lider izdiham ulaştıktan sonra Proliferasyona KSHV enfekte hücreleri devam. Bu panel KSHV enfekte hücre morfolojisi gün 14 saat gösterir PI, 9 gün sonrası izdiham için kültürlü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Anchorage bağımsız büyüme. Dönüştürülmemiş hücrelere genellikle bir substrat, anoikis adı verilen bir işlem ile temas kaybı takip apoptotik hücre ölümü tabi. Değil dönüştürülür, yumuşak agar askıya ve iki hafta boyunca onlar koloniler oluşturmaz kültürlü(a)ne zaman E6/E7 transduced sahte enfekte EC. Virüs dönüştürülmüş olan (B) KSHV enfekte EC ve anoikis için dayanıklı yumuşak agar kolonilerde oluşturacak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: viral protein ifade gösteri. (A) Milli Morfoloji, KSHV ile enfeksiyon sonrasında belirgindir (40 X büyütme). (B), (A) gösterilen aynı alanın immünfloresan boyama iğ Morfoloji viral gecikme süresi protein ORF73 ifade (kırmızı) ile ilişkili olduğunu gösterir. Enfekte hücreleri de, viral pro ifade hücreleri küçük bir yüzdesi oranında gösterildiği litik viral çoğaltma desteğicessivity faktörü ORF59 (yeşil). (A ve B başvuru26değiştirilme.) İğ Morfoloji KSHV-BAC16 virüsü (C) hücre ifade GFP (D) ile ilişkilidir (20 X büyütme). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oncogenesis bir organizma36içinde önemli güvenlik önlemlerinin circumvents multistep bir süreçtir. KS lezyonlar kronik inflamasyon gerçek eklem dokusu Uru için bir spektrum boyunca var gibi aydınlatma KSHV tarafından aracılı belirli patofizyolojik süreçlerin bazı çalışmalar dönüşümü9çekmek için hücre kültür modellerinde yürütülmelidir gerektirir. Bu kaybı temas inhibisyonu ve anchorage bağlı büyüme, fenotipleri hücresel dönüşümü, gösterge kolayca geliştirmek mi unutulmamalıdır birincil EC veya EC Revers eksojen ifade tarafından ölümsüzleştirilmiş enfeksiyonu takip. Burada açıklanan KS vitro modelinin explanted KS hücreleri davranışını veya KS tümör microenvironment tüm yönleriyle özetlemek değil iken, bu nedenle, bu konak hücre gen ekspresyonu ile enfeksiyon tarafından indüklenen değişimler eğitimi için benzersiz olarak uygundur KS tumorigenesis için katkıda KSHV.

İlk burada açıklanan kültür sistemi kullanarak çalışma profil oluşturma gen ekspresyonu KSHV enfekte hücreleri25dönüştürülmüş fenotip katkıda bir reseptör tirozin kinaz c-Kit tanımlanan bildirdi. C-Kit ifade siRNA veya inhibisyon bir baskın olumsuz yapı veya tirozin kinaz inhibitörü STI 571 (Imatinib) KSHV bildirimi dönüştürme yeteneği ile uzun süredir devam eden sonra foci oluşumu kaybı tarafından müdahale c-Kit sinyal kullanarak kullanarak yıkmak enfekte hücreleri kültür. Imatinib sonraki klinik değerlendirilmesi bu ilaç salgın KS47,48,49olan hastalarda etkinliğini göstermiştir. Diğer olası tedavi hedefleri de, hem Siklooksijenaz-126,50, CXCR727ve beta adrenergic reseptörleri28tüm bunların büyüme ya da dönüştürme bir rol oynamaktadır, dahil olmak üzere tespit edilmiştir EC tüp bebek. Onay birincil EC KS biyopsi doku bu sistem fizyolojik uygunluğunu onaylıyor ve KS therapeutics25,26için önceden klinik bir model olarak değerini vurgular yanı sıra bu gen ifade kalıplarının 51,52,53,54,55.

Uzun ömrü ile karşılaştırıldığında birincil EC sağlar yaş ve sahte enfekte denetim geçiş eşlemeli hücreleri KSHV sonucu karşılaştırmalı değerlendirme için uzun vadeli bakım ölümsüzleştirilmiş E6/E7 iletim sisteminin başka bir güç olduğunu enfeksiyon. E6 ve E7 kültürlerin kesiştiği yerde (~ 85-%90) ulaşmadan önce bölmek için önemlidir transduced EC geçişleri sayısını en üst düzeye çıkarmak için unutmamak önemlidir. Ayrıca, bu hücreleri uzun bir süre için serum-Alerjik koşullar tahammül. Birincil EC hızla büyüme faktörü çekilmesi üzerine programlanmış hücre ölümü geçmesi ve bu nedenle serum veya rekombinant büyüme faktörleri56,57olmadan uzun süre kültürlü olamaz. Önce tam dönüşüm KSHV enfekte hücreleri de programlı hücre ölümü (yayınlanmamış büyüme faktörü çekilmesi üzerine geçirecek gibi enfeksiyon KSHV belirlemek ve çalışma, zor ile indüklenen yolları sinyal otokrin bu bağımlılık yapar gözlem). Bu modelde, ancak, E6 ve E7 proteinleri varlığı büyüme faktörü çekilme takip programlı hücre ölümü önlemek ve uzun süreli (örneğiniçin 48 h) izin kültür düşük serum veya serum ücretsiz orta25,26 , 28.

KS kronik inflamasyon ve hücresel dönüştürme özellikleri ile karmaşık ve sıradışı bir hastalıktır. Büyük roman tedavi stratejileri için klinik ihtiyacıdır ve burada açıklanan hücre kültür model aday değerlendirilmesi uyuşturucu hedefler izin vermesi eşsiz özellikleri vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri.

Acknowledgments

Bu eser K12 HD068322 (SCM) tarafından desteklenen; R01 CA179921 ve P51 OD011092 (AVM); ve 14PRE20320014 Amerika Kalp Derneği (SB) Ödülü.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Kanser biyoloji sayı: 126 Kaposi sarkomu birincil efüzyon lenfoma KSHV dönüşüm oncogenesis endotel hücre
Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir <em>Vitro </em>modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter