Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En In Vitro -modell för att studera cellulära omvandling av Kaposis sarkom Herpesvirus

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Kaposis sarkom (KS) är en tumör som induceras av infektion med de onkogena virus människa herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). Endotelcell kultur modellen beskrivs här är unikt lämpade för att studera de mekanismer genom vilka KSHV förvandlar värdceller.

Abstract

Kaposis sarkom (KS) är en ovanlig tumör bestående av prolifererande spindel celler som initieras av infektion av endotelceller (EG) med KSHV, och utvecklar oftast i fastställandet av immunsuppression. Trots decennier av forskning, optimal behandling av KS fortfarande dåligt definierade och kliniska resultat är särskilt ogynnsamma i begränsade resurser inställningar. KS lesioner drivs av patologisk angiogenes, kronisk inflammation och Onkogenes, och olika in vitro- cell kultur modeller har utvecklats för att studera dessa processer. KS uppkommer KSHV-infekterade celler av endotel ursprung, så EG-lineage celler ger de mest lämpliga in vitro- ersättningar av spindeln cell föregångaren. Men eftersom EG har en begränsad i vitro livslängd, och som de onkogena mekanismer som anställd av KSHV är mindre effektiva än de andra tumörframkallande virus, det har varit svårt att utvärdera processerna för omvandling i primär eller telomeras-förevigade EC. Därför utvecklades en ny EG-baserade kultur modell som lätt stöder omvandling efter infektion med KSHV. Ektopisk uttryck av E6 och E7 generna av humant papillomvirus typ 16 möjliggör utökade kultur och passage-åldersmatchade mock - och KSHV-smittade EG och stöder utvecklingen av en verkligt transformerade (dvs tumörframkallande) fenotyp i infekterade cellkulturer . Denna eftertraktansvärda och mycket reproducerbara modell av KS har underlättat upptäckten av flera viktiga signalvägar med hög potential för översättning till kliniska inställningar.

Introduction

Kaposis sarkom (KS) är en multi fokala angioproliferative tumör som drabbar huden, slemhinnor och viscerala platser som utvecklar oftast i fastställandet av avancerade immunsystemet1. Fyra epidemiologiska former har beskrivits: classic, en indolent form som vanligtvis drabbar äldre människor i Medelhavsområdet och Mellanöstern arv. iatrogen, följd av behandling med Immunosuppressiva läkemedel efter organtransplantation; epidemi, en AIDS-relaterad cancer; och endemiska, en HIV-oberoende form vanligt hos barn i endemiska områden i Afrika. Med tillkomsten av effektiva kombinationsregimer antiretrovirala läkemedel för behandling av HIV diagnostiseras epidemisk KS mycket mindre vanligt i utvecklingsländerna. De kliniskt aggressiv endemiska och epidemiska formerna dock bland de vanligaste diagnosen cancer i många afrikanska länder2,3,4. Identifiering av effektiva patogenes-riktade läkemedel för behandling av KS är därför prioriteras forskning.

Histologiskt, kännetecknas KS lesioner av omfattande men onormal kärlnybildning whereby spindel celler av EG ursprung bilda diskontinuerligt vaskulär nätverk5. Dessa onormala fartyg (”vaskulär slitsar”) tillåta extravasation av erytrocyter, som ger lesioner deras karakteristiska färg. Dessutom innehålla lesioner talrika leukocyter som kännetecknar kronisk inflammation (dvs, lymfocyter, makrofager och plasmaceller). Regression av KS lesioner efter immun beredning har beskrivits, vilket tyder på att KS har drag av både en hyper-proliferativ lesion och en sann tumör6,7,8,9.

KS herpesvirus (KSHV), vilka smittämnen av KS, identifierades 199410. Sedan då många i vitro cellkultur modeller har utvecklats för att aktivera patogenes studier, inklusive celler explanterad från tumör biopsi material och primär eller telomeras-uttryckande EG angripits KSHV in vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen av de för närvarande tillgängliga modellerna helt recapitulates KS tumör mikromiljö, men alla har bidragit med värdefull kunskap till vår förståelse av patobiologi KSHV infektion. Till skillnad från de andra kända tumörframkallande människa herpesvirus Epstein - Barr virus (EBV), KSHV inte lätt förvandla celler i kultur efter de novo infektion19,20,21, 22. men denna begränsning har övervunnits av transducing primära mänskliga EG av antingen blandat mikrovaskulära eller lymfatiska ursprung med E6 och E7 gener från humant papillomvirus typ 16 före infektion med KSHV23,24 . Uttryck för dessa exogena onkogener ökar dramatiskt omvandlande potential KSHV in vitro- delvis genom att tillhandahålla ytterligare hämning av retinoblastom protein och p5323,24. Denna EG transduktion metod har tillåtit flera laboratorier att identifiera viktiga förändringar i mottagande cell genuttryck som induceras av KSHV infektion och som tycks underlätta KS cell överlevnad och spridning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de protokoll som beskrivs häri är okomplicerad och mycket reproducerbara, och kommer att resultera i generationen och passage-åldersmatchade KSHV-infekterade EG och mock-infekterade kontroller som kan vara odlade långt längre än primära celler och kommer Tillåt för utredning av onkogena mekanismer anställd av KSHV. Även om protokollet innehåller en metod för framställning av vildtyp KSHV från den primära utgjutning lymfom cellinje BCBL-1, E6/E7-förevigade EG också är mycket mottagliga för härrör infektion med rekombinant BACmid KSHV-BAC1630. Protokoll för beredning av BAC16 beskrivs någon annanstans33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll bör utföras under BSL-2 villkor.

1. KSHV lager förberedelse

  1. förbereda TNE buffert: lös 292.24 mg EDTA i ddH 2 O, föra till 225 mL och justera till pH 8. Lös 605.7 mg Tris i ddH 2 O, föra till 225 mL och justera till pH 8. Kombinera EDTA och Tris lösningar, tillsätt 4,38 g NaCl, anpassa den slutliga volymen till 500 mL, filtrera sterilisera och förvaras vid 4 ° C .
  2. Kultur de KSHV-positiv, EBV-negativ primära utgjutning lymfom cellinje BCBL-1 i en fuktad inkubator vid 37 ° C plus 5% CO 2 i RPMI kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) och antimikrobiella medel till ca 1 till 1,2 x 10 6 celler per mL.
  3. Att framkalla KSHV produktion, split kulturer 1:2 med färska medium och lägga Phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) till en slutlig koncentration på 20 ng/mL och inkubera kulturer i 5 dagar. Alternativt kan behandla celler med natrium butyrate (NaB; 0,1 mM) i 3 dagar för att inducera lytisk virusreplikation.
  4. För att skörda viruspartiklar, först Centrifugera supernatanten vid 300 x g i 5 min i rumstemperatur att pressa samman cellerna och överföra supernatanterna till färska rör kulturen.
  5. Att ytterligare klargöra supernatanten för att undvika överföring av cellulära skräp, Centrifugera vid 2500 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    Obs: som ett alternativ till hög hastighet centrifugering för förtydligande av cellkulturer, filtrering genom en steril 0,45 µm filter kan utföras. Vi har observerat en betydande nedgång i titer använda filtrering; därför vi rutinmässigt utför det andra centrifugeringssteget istället.
  6. Nästa, overlay 5 mL 25% sackaroslösning i TNE buffert med cirka 30 mL av supernatanten i 6 ultracentrifugen rör skirat kultur.
  7. Centrifug balanserad rör på 75 000 x g under 2 timmar vid 4 ° C under vakuum.
  8. Dekantera supernatanten kultur och blot kanten av varje tub att ta bort så mycket supernatanten och sackaros lösning som möjligt, sedan återsuspendera pelleten virus, som inte kanske syns, i 150 µL TNE buffert.
  9. Pool alla resuspended virus, blanda väl, och frysa 25 µL portioner vid -80 ° C .

2. Transduktion i EG med E6 och E7 Papillomavirus Genes

Obs: vi använder rutinmässigt standard vävnadsodling kolvar för växande primära EC. Dock om otillfredsställande tillväxt i EG erhålls då användning av kommersiell kultur kolvar övervägas.

  1. Kultur primära mänskliga dermal mikrovaskulära eller lymfatiska EG i en fuktad inkubator vid 37 ° C plus 5% CO 2 i EG odlingsmedium (EGM; innehåller EG basala medium [EBM] kompletteras med extra bolagsstämma-2 BulletKit [som innehåller FBS, hydrokortison, mänskliga fibroblast tillväxtfaktor-B, vaskulär EG tillväxtfaktor, insulin-liknande tillväxtfaktor-1, askorbinsyra, mänskliga epitelceller tillväxtfaktor, antibiotika och heparin]) i en T75 cell kultur kolv till ungefärligt 50% sammanflödet.
  2. För transduktion, kultur PA317 LXSN 16E6E7 celler 24 , 35 i en fuktad inkubator vid 37 ° C plus 5% CO 2 i DMEM kompletteras med 10% FBS och antimikrobiella medel i en T150 cell kultur kolven tills de är cirka 90% konfluenta. Sedan Inkubera över natten i 16 mL medium.
  3. Klargöra PA317 mediet genom centrifugering vid 300 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
  4. Ta bort den extra bolagsstämman från EG kultur och overlay cellerna med 12 mL av skirat PA317 medium och inkubera i 4 h.
    Obs: Centrifugering 16 mL luftkonditionerade medium vid 300 x g för 5 min resultat i en kompakt pellet som inte störs av det noga med efterföljande avlägsnandet av 12 mL skirat supernatant. Dock om överföring av PA317 LXSN 16E6E7 celler till primära EG kulturer är ett bekymmer (raden förpackning cell kommer snabbt växa ur EG), sedan filtrering av konditionerat supernatanten genom ett 0,45 µm filter innan överföringen kan utföras.
  5. Ersätt 6 mL av PA317 medium med färska extra bolagsstämma och inkubera över natten.
  6. Refeed EG med 12 mL färsk extra bolagsstämma och inkubera en ytterligare 48 h.
  7. Till sub kultur EG, ta bort medium och tvätta med 12 mL PBS utan kationer, och tillsätt 3 mL kommersiella enzymatisk dissociation (t.ex., TrypLE) av och inkubera vid 37 ° C i 3 min.
  8. Överföra cellsuspension till en 15 mL koniska rör och centrifugera 300 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Återsuspendera resulterande cellpelleten i färska extra bolagsstämma och dela jämnt i 3 x T75 kolvar med en slutlig volym av 12 mL extra bolagsstämma per kolv.
  9. Markera för EG sensorik med E6 och E7, lägga G418 till en slutlig koncentration på 200 µg/mL för två passager, varefter transduced EG kan vara klädd för infektion eller frysta i flytande kväve.

3. Infektion i sensorik EG med KSHV

  1. dagen före infektion skörda EG genom enzymatisk nedbrytning med kommersiella enzymatisk dissociation lösningen enligt beskrivningen ovan. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL extra bolagsstämma. Använd 5 µL av celler för att förbereda en 1/10 utspädning i Trypan blå. Räkna levande celler med hjälp av en hemocytometer och utsäde 2,5 x 10 5 levande celler i 2 mL extra bolagsstämma per brunn i 6 plattor.
  2. På dagen för infektion, ta bort extra bolagsstämma tvätta cellerna med 3 mL PBS med kalcium och magnesium per brunn och tillsätt därefter 2 mL EBM.
    Obs: Det är viktigt att använda EBM i stället för extra bolagsstämma under infektion, eftersom heparinet i extra bolagsstämma kommer att hämma bindningen av viruspartiklar att och efterföljande infektion i målet EC.
  3. Att infektera celler med KSHV, lägga till 5 till 20 µL virus lager i varje brunn och snurra plattan att blanda. För mock-infekterade celler lägga en lika stor volym av TNE buffert till varje brunn.
  4. Centrifugera plattor vid 400 x g i 30 min i rumstemperatur och sedan Inkubera plattorna vid 37 ° C i 90 min.
  5. Om syftet med studien är att undersöka tidiga händelser som kräver en synkron viral infektion, t.ex., tidiga händelser i de novo infektion, ta bort det virala inokulatet på denna punkt. Skölj och refeed cellerna med 2 mL färsk extra bolagsstämma. Annars, tillsätt 2 mL extra bolagsstämma och inkubera kulturer över natten.
  6. Refeed celler med 2 mL extra bolagsstämma dagen efter infektion och sedan varannan dag.
  7. När celler är ungefär 90% konfluenta, skörda genom enzymatisk nedbrytning med kommersiella enzymatisk dissociation lösning som beskrivits ovan, då pool cellerna från tre brunnar i en T75, konstaterar både antalet totala passage och passagen efter att datorn smittats.
  8. Expandera mock - och KSHV-infekterade EG med 1:3 splittringar för minst två fler passager då celler kan användas i experiment eller frysta i flytande kväve.
    Obs: Som med uppdelning av EG sensorik med E6 och E7, underhåll kulturer av mock - och KSHV-infekterade celler ska delas upp innan den når sammanflödet (~ 85 – 90%).

4. bekräftar infektion med KSHV genom immunofluorescens

Obs: detektion av KSHV latens-associerade nukleära antigener (LANA-1/ORF73) ger en tillförlitlig kvantitativa mått på infektion. Anti-LANA antikroppar är kommersiellt tillgängliga.

  1. Dagen innan färgning, plattan två brunnar varje med mock - eller KSHV-infekterade EG på en 24-well platta på 1 x 10 5 celler per väl i 1 mL extra bolagsstämma och inkubera över natten.
  2. Tvätta cellerna två gånger med 500 µL av PBS plus kalcium och magniseum. Tvätta i 30 s på en gungande plattform.
  3. i ett externt-ventillated spiskåpa, fixa celler med 500 µL av 4% PARAFORMALDEHYD i 15 min i rumstemperatur.
  4. Tvätta celler tre gånger med 500 µL tvättlösning (0,1% Triton x-100 plus 0,02% get serum i PBS plus katjoner).
  5. Blockera celler med 500 µL av 2% get serum i tvättbuffert i 30 min i rumstemperatur.
  6. Tvätta celler tre gånger med 500 µL tvättlösning.
  7. Etikett en brunn av mock - eller KSHV-infekterade EG med primär antikropp 200 µL spätt 1:100 i tvättbuffert i 30 min i rumstemperatur på en rocker. Inkubera återstående två brunnarna i 200 µL tvättlösning endast.
  8. Tvätta celler tre gånger med 500 µL tvättlösning.
  9. Märka alla fyra brunnar med 200 µL av sekundära antikroppar efter utspädning 1: 100 i tvättbuffert i 30 min i rumstemperatur på en rocker.
  10. Tvätta celler tre gånger med 500 µL tvättlösning.
  11. Till varje brunn Tillsätt 20 µL av montering medium innehållande DAPI och ett täckglas och utvärdera färgning med en inverterad fluorescerande Mikroskop.
  12. Avgör procent infektionen av KSHV-infekterade celler genom att räkna antalet LANA-positiva kärnor i minst 200 celler. Infektion med rekombinant KSHV-Bac16 kan också övervakas via observation av kulturer för uttryck för god Jordbrukarsed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologi av primära EG beskrivs klassiskt som ”kullersten”, och denna morfologi ändras inte av uttryck av papillomvirus E6 och E7 gener (figur 1A). Uttryck av E6 och E7 generna ensam inducerar inte en transformerade fenotyp; Således, celler är mottagliga för kontakta hämning och upphör att dela när den når sammanflödet i kultur. Cellerna kommer emellertid föröka och återföds till sammanflödet på trypsinization och replating på en lägre densitet, vilket möjliggör upprätthållande av och passage-åldersmatchade kulturer för användning som mock-infekterade kontroller.

Infektion av E6/E7-sensorik EG med KSHV orsakar dramatiska morfologiska förändringar i kultur som påminner om den ”spindel cell” fenotyp hos KS lesioner (figur 1B). En transformerade fenotyp är också induceras vid infektion med KSHV, vilket är manifest delvis av förlust av kontakt hämning när cellerna är odlade efter sammanflödet (figur 1 c) och anchorage-oberoende tillväxt i mjuk agar (figur 2). Förlust av både kontakt hämning och beroendet av extra-cellulära matrix interaktioner (anchorage) under Onkogenes är två av kännetecknen för cellulära omvandling36. Det är viktigt att notera att primära EG är också mottagliga för infektion med KSHV och primära EG system har varit ytterst värdefullt för att belysa olika aspekter av virus-host samspelet, och dess konsekvenser. Sådana studier är väl representerade i litteraturen och flera exempel nämns häri37,38,39,40,41,42,43 ,44.

Immunofluorescerande färgning visar att spindeln morfologi av KSHV-infekterade celler är associerade med uttryck av virala protein LANA-1/ORF73 (figur 3A och 3B, röd). Eftersom koncentrationen av virus i bestånden kommer att variera mellan preparat, volymen av virus tillsatts per brunn bör justeras så att KSHV-infekterade kulturer nå > 90% infektion inom ett eller två passager. Med seriella passage andelen infektion kommer att närma sig 100% och kommer att upprätthållas under hela kulturen (ca 20 stycken). Lägre mängder av virus kan användas om en studie av parakrin influenser är avsett eller om angränsande oinfekterade celler är önskvärt som kontroller (t.ex., för immunofluorescens studier med andra proteiner av intresse). Infekterade kulturer stöder också uttrycket av lytisk virala proteiner men som observeras i KS lesioner, bara en minoritet av celler i kultur spontant kommer att genomgå lytisk reaktivering (figur 3B, grön). Celler som smittats med KSHV-BAC16, som är märkta med GFP, också utveckla en spindel morfologi (figur 3 c och 3D). När KSHV-BAC16 används, kan viral titrar erhållas genom att infektera celler med ett seriellt utspädda koncentrerad virus lager och utvärdera celler för god Jordbrukarsed uttryck på 48 h post infektion använder flöde flödescytometri30.

För både rekombinant och WT-virus, kan virala genomer i lager preparat även mätas genom att rena DNA från infekterade celler följt av PCR kvantifiering av KSHV DNA nivåer; dock bör man inte anta att alla genomen är smittsamma45. Om studien av KSHV lytisk cykeln är avsedd, reaktivering av virus kan uppnås genom stimulerande EG med inducerande medel som beskrivs ovan för BCBL-1 celler, även om effektiviteten av reaktivering är lägre23. Lytisk cykeln kan också induceras av transduktion i EG med proteinet KSHV transactivator ORF5046. Överensstämmer med resultaten i andra cell kultur modeller av KS, både spontana uttryck och kemiska induktion av KSHV lytisk gener i E6/E7-uttryckande EG minskar över tid trots underhåll av en stabil latent infektion11,16 .

Figure 1
Figur 1: morfologi av mock- och KSHV infekterade EC. (A), Mock-infekterade EG enskiktslager utställning den klassiska cobble sten utseende av fas kontrast vitala mikroskopi. Utan åtgärder av KSHV gener kommer dessa celler inte omvandlas och därför upphöra att dividera och uppvisar kontakt hämning när det anländer till sammanflödet i kultur. (B) KSHV-infekterade celler, utvecklas däremot en långsträckt ”spindel” cellmorfologi som påminner om KS spindel celler. I denna panel visas morfologi av KSHV-infekterade celler på dag 5 PI när det anländer till sammanflödet. (C) i KSHV-infekterade celler, omfattande förändringar i genuttryck värd cell leda till cellulära omvandling, vilket blir uppenbart när KSHV-infekterade celler odlas utan passage. Under sådana förhållanden fortsätta KSHV-infekterade celler frodas även efter att nå sammanflödet som leder till utvecklingen av flerskikts foci av celler. I denna panel visas morfologi av KSHV-infekterade celler på dag 14 PI, odlade för 9 dagar efter sammanflödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Anchorage oberoende tillväxt. Ej omformad celler genomgår vanligtvis apoptotisk celldöd efter förlust av kontakt med ett substrat, en process som kallas anoikis. (A) när E6/E7-sensorik mock-infekterade EC, som inte omvandlas, är upphängd i mjuk agar och odlade i två veckor de inte utgör kolonier. (B) KSHV-infekterade EG, som är virus-omvandlad, är resistenta mot anoikis och kommer att bilda kolonier i mjuk agar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Demonstration av viral proteinuttryck. (A), spindel morfologi är uppenbart efter infektion med KSHV (40 X förstoring). (B) Immunofluorescerande färgning av samma fält visas i (A) visar att spindeln morfologi är associerade med uttryck av viral latens proteinet ORF73 (röd). Infekterade celler stödja lytisk virusreplikation samt, vilket framgår av en liten andel av celler som uttrycker den virala processivity faktor ORF59 (grön). (A och B modifierad från referens26.) Spindeln morfologi av celler som smittats med KSHV-BAC16 virus (C) är associerad med uttryck av god Jordbrukarsed (D) (20 X förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Onkogenes är en process som kringgår viktiga garantier inom en organism36. Som KS lesioner finns längs ett spektrum av kronisk inflammation till sann sarkom, kräver klargörande av vissa patofysiologiska processer som medieras av KSHV att vissa studier utföras i cell kultur-modeller som stöder omvandling9. Det bör noteras att förlust av kontakt hämning och anchorage-beroende tillväxt, fenotyper vägledande av cellulära omvandling, inte lätt utvecklas efter infektion av primära EG eller EG förevigat av exogena uttryck av telomeras. Därför, medan en in vitro- modell av KS beskrivs här inte sammanfatta alla aspekter av den KS tumör närmiljön eller beteende av explanterad KS celler, det är unikt lämpade för att studera förändringar i genuttryck för mottagande cell induceras av infektion med KSHV som bidrar till KS uppkomst.

Först rapporterade genuttryck profilering studie där kultur systemet beskrivs häri identifieras i receptorn tyrosin Kinas c-Kit som en bidragande orsak till den transformerade fenotypen KSHV-infekterade celler25. Riva av c-Kit-uttryck med siRNA eller hämning av c-Kit signalering med hjälp av en dominerande negativa konstruera eller tyrosin tyrosinkinashämmare STI 571 (Imatinib) stört KSHV manifest omvandla förmåga av förlust av foci bildandet efter långvarig kultur av infekterade celler. Efterföljande klinisk utvärdering av Imatinib har visat effekt av detta läkemedel hos patienter med epidemisk KS47,48,49. Andra potentiella behandling mål har också identifierats, inklusive heme cyklooxygenas-126,50, CXCR727och den beta adrenerga receptorer28, varav alla spela en roll i tillväxten eller omvandling av EG in vitro-. Bekräftelse av dessa gen uttrycksmönster i primära EG samt att KS biopsi vävnad bekräftar fysiologiska relevansen av detta system och understryker dess värde som preklinisk modell för KS therapeutics25,26, 51,52,53,54,55.

En annan styrka av E6/E7 transduktion systemet är att utökad livslängd förevigade jämfört med primära EG möjliggör det långsiktiga underhållet av ålder och passage-matchade mock-infekterade kontroll celler för jämförande utvärderingar av resultaten av KSHV infektion. Det är viktigt att notera att för att maximera antalet passager i EG sensorik med E6 och E7 är det viktigt att dela kulturer innan den når sammanflödet (~ 85 – 90%). Dessutom tål dessa celler serumfritt villkor för längre tidsperioder. Primära EG genomgår snabbt programmerad celldöd vid tillväxtfaktor uttag och därför inte odlade under långa perioder utan serum eller rekombinanta tillväxtfaktorer56,57. Detta beroende gör autokrin signalering vägar orsakas av infektion med KSHV svårt att identifiera och studera, som före fullständig omvandling KSHV-infekterade celler också genomgår programmerad celldöd vid tillväxtfaktor uttag (opublicerade anmärkning). Förekomsten av proteinerna E6 och E7 i denna modell, dock förhindra programmerad celldöd efter tillväxtfaktor återkallelse och möjliggör långvarig (t.ex., 48 h) kultur i låga serum eller serum fri medium25,26 , 28.

KS är en komplex och ovanlig sjukdom med drag av både cellulära omvandling och kronisk inflammation. Det kliniska behovet av nya terapeutiska strategier är stor och cell kultur modellen beskrivs häri har unika egenskaper som tillåter bedömning av kandidaten målmolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd av K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 och P51 OD011092 (AVM); och belöna 14PRE20320014 från Amerika hjärtat Association (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Cancerbiologi fråga 126 Kaposis sarkom primära utgjutning lymfom KSHV transformation Onkogenes endotelceller
En <em>In Vitro </em>-modell för att studera cellulära omvandling av Kaposis sarkom Herpesvirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter