Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En In Vitro -modellen for å undersøke mobilnettet transformasjon av Kaposis sarkom Herpesvirus

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Kaposis sarkom (KS) er en svulst forårsaket av infeksjon med kreftfremkallende viruset menneskelig herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). Endothelial celle kultur modellen beskrevet her er unikt tilpasset for å studere mekanismer som KSHV forvandler vertsceller.

Abstract

Kaposis sarkom (KS) er en uvanlig svulst består av voksende spindel celler som startes av infeksjon av endotelceller (EC) med KSHV, og utvikler oftest i innstillingen for immunsuppresjon. Til tross for tiår med forskning, optimal behandling for KS er dårlig definert og kliniske utfall er spesielt ugunstige i ressurs-begrenset innstillinger. KS lesjoner er drevet av patologisk angiogenese, kronisk betennelse og oncogenesis, og ulike i vitro celle kultur modeller er utviklet for å studere disse prosessene. KS oppstår fra KSHV-infiserte celler endothelial opprinnelse, slik EU-lineage celler gir de mest passende i vitro surrogater av spindel celle forløperen. Men fordi EU har en begrenset i vitro levetid, og som de kreftfremkallende mekanismene ansatt hos KSHV er mindre effektiv enn andre tumorigenic virus, har det vært vanskelig å vurdere prosessene av transformasjon i primære eller telomerase-udødeliggjort EC. Derfor ble en roman EC-baserte kultur-modellen utviklet som lett støtter transformasjon etter infeksjon med KSHV. Ektopisk uttrykk for E6 og E7 genene for humant papillomavirus type 16 gir utvidet kultur av alder - og passasje-matchet uekte - og KSHV-infiserte EC og støtter utviklingen av en virkelig transformert (dvs. tumorigenic) fenotypen i infiserte cellekulturer . Denne medgjørlig og svært reproduserbar modellen av KS har muliggjort oppdagelsen av flere viktige signalveier med stort potensial for oversettelse til kliniske innstillinger.

Introduction

Kaposis sarkom (KS) er en Multi-Focal angioproliferative svulst påvirker dermal, mucosal og visceral områder som utvikler vanligvis i innstillingen for avansert uimottakelig undertrykkelse1. Fire epidemiologisk skjemaer har blitt beskrevet: klassisk, en lat form som vanligvis påvirker eldre mennesker i middelhavs- og arv; iatrogenic, som følge av behandling med suppressive medikamenter etter organtransplantasjon; epidemien, en AIDS-definerende kreft; og endemisk, et uavhengig av HIV-skjema som er vanlig i barn i endemiske områder i Afrika. Med ankomsten av effektiv kombinasjon anti-retroviral narkotika regimer for behandling av HIV, er epidemi KS mye mindre vanlig diagnostisert i utviklingsland. Imidlertid fortsatt skjemaene for klinisk aggressiv endemisk og epidemien blant de vanligste diagnostisert kreft i mange afrikanske land2,3,4. Identifikasjon av effektiv patogenesen målrettede legemidler for behandling av KS er derfor forskning prioritet.

Histologisk, er KS lesjoner preget av omfattende men unormal neovascularization der spindelen cellene opprinnelsesland EC danner usammenhengende vaskulære nettverk5. Disse unormale fartøyene ("vaskulære slits") gjør bloduttredelse av erytrocytter, som gir lesjoner sine karakteristiske farger. I tillegg inneholder lesjoner mange leukocytter som karakteriserer kronisk betennelse (dvs. lymfocytter, makrofager og plasma celler). Regresjon av KS lesjoner etter immune rekonstituering har blitt beskrevet, antyder at KS har både en hyper-proliferativ leksjonen og sanne svulst6,7,8,9.

KS herpesvirus (KSHV), den utløsende agenten for KS, ble identifisert i 199410. Siden så mange i vitro cellekultur modeller er utviklet for å aktivere patogenesen studier, inkludert celler explanted fra svulst biopsi materiale og primær eller telomerase-uttrykke EC infisert med KSHV i vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen av de tilgjengelige modellene viser fullt KS svulst microenvironment, men alle har bidratt verdifull kunnskap til vår forståelse av pathobiology av KSHV. I motsetning til de andre kjente tumorigenic menneskelig herpesvirus Epstein - Barr virus (EBV), KSHV lett transformerer ikke celler i kultur etter de novo infeksjon19,20,21, 22. imidlertid denne begrensningen er løst med transducing primære menneskelige EC enten blandet mikrovaskulær eller lymfatisk opprinnelse med E6 og E7 gener fra humant papillomavirus type 16 før infeksjon med KSHV23,24 . Uttrykk for disse eksogene oncogenes øker dramatisk transformere potensialet i KSHV i vitro delvis ved å gi ytterligere hemming av retinoblastoma protein og p5323,24. Denne EC signaltransduksjon metoden har tillatt flere laboratorier for å identifisere viktige endringer i verten celle genuttrykk som er indusert av KSHV infeksjon, og som synes å lette KS celle overlevelse og spredning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. protokollene beskrevet her er enkel og svært reproduserbare og vil medføre generering av alder - og passasje-matchet KSHV-infiserte EC og uekte-infiserte kontroller som kan kultivert langt lenger enn primære celler og vil tillate etterforskningen av kreftfremkallende mekanismer ansatt hos KSHV. Selv om protokollen inneholder en metode for produksjon av vill-type KSHV fra primære effusjon lymfom cellen linje BCBL-1, E6/E7-udødeliggjort EC er også svært utsatt for avledet infeksjon med rekombinant BACmid KSHV-BAC1630. Protokoller for utarbeidelse av BAC16 er beskrevet andre steder33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: alle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen skal utføres under BSL-2 forhold.

1. KSHV lager forberedelse

  1. forberede TNE buffer: oppløse 292.24 mg EDTA i ddH 2 O bringe til 225 mL og justere pH 8. Oppløse 605.7 mg Tris i ddH 2 O, bringe til 225 mL og justere pH 8. Kombinere EDTA og Tris løsninger, legge 4,38 g NaCl, justere endelige volumet til 500 mL, filtrere sterilisere, og lagre på 4 ° C .
  2. Kultur KSHV-positive, EBV-negativ primær effusjon lymfom cellen linje BCBL-1 i en fuktet inkubator på 37 ° C pluss 5% CO 2 i RPMI med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) og poesi aksent til ca 1 til 1.2 x 10 6 celler per mL.
  3. å indusere KSHV produksjon, delt kulturer 1:2 med fersk medium og legge Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) til en siste konsentrasjon på 20 ng/mL og ruge kulturer i 5 dager. Som et alternativ, behandle celler med natrium butyrate (NaB, 0,1 mM) for 3 dager å indusere lytisk viral replikasjon.
  4. For å høste virus partikler, først sentrifuge kulturen supernatant på 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur pellets cellene og overføre supernatants til frisk rør.
  5. For videre avklare nedbryting for å unngå overføring av mobilnettet rusk, sentrifuge 2500 x g i 10 min 4 ° C.
    Merk: som et alternativ til høyhastighets sentrifugering for avklaring av kultur supernatants, filtrering gjennom et sterilt 0.45 µm filteret kan utføres. Vi har observert en betydelig nedgang i titer bruke filtrering; Derfor vi rutinemessig utføre andre sentrifugering trinn i stedet.
  6. Deretter overlay 5 mL av 25% sucrose løsning TNE buffer med ca 30 mL av avklart kulturen supernatant i 6 ultracentrifuge rør.
  7. Sentrifuge balansert rør på 75 000 x g for 2t 4 ° c under vakuum.
  8. Dekanter kultur supernatant blot kanten av hver rør fjerne så mye nedbryting og sukrose løsningen som mulig, og resuspend virus pellets, som ikke kanskje er synlig, 150 µL TNE bufferen.
  9. Bassenget alle resuspended virus, bland godt, og fryse 25 µL dele ved-80 ° C .

2. Albin på EC med E6 og E7 Papillomavirus Genes

Merk: vi rutinemessig Bruk standard vev kultur flasker for voksende primære EC. Men hvis utilfredsstillende veksten av EC hentes deretter Bruk av kommersielle kultur kolber anses som.

  1. Kultur primære menneskelige dermal mikrovaskulær eller lymphatic EC i en fuktet inkubator på 37 ° C pluss 5% CO 2 i EC vekst medium (EGF; inneholder EC basale medium [EBM] med EGF-2 BulletKit [inneholder FBS, Hydrocortisone, menneskelige fibroblast vekst faktor-B, vaskulære EC vekstfaktor, insulin-lignende vekstfaktor-1, askorbinsyre, menneskelige epithelial vekstfaktor, antibiotika og heparin]) i en MT75 celle kultur kolbe til ca 50% samløpet.
  2. For transduction, kultur PA317 LXSN 16E6E7 celler 24 , 35 i en fuktet inkubator på 37 ° C pluss 5% CO 2 i DMEM med 10% FBS og poesi aksent i en T150 celle kultur kolbe før de er ca 90% confluent. Deretter ruge over natten i 16 mL av medium.
  3. Avklare PA317 medium ved sentrifugering 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Fjerne EGM fra EF kultur og overlegg cellene med 12 mL avklart PA317 mediet og Inkuber for 4 h.
    Merk: Sentrifugering 16 mL betinget medium på 300 x g for 5 min resultater i en kompakt pellet som ikke forstyrres av forsiktig påfølgende fjerning av 12 mL avklart nedbryting. Men hvis overføring av PA317 LXSN 16E6E7 celler til primære EC kulturer er et problem (emballasje celle linjen vil raskt vokser EC), deretter filtrering betinget nedbryting gjennom filtere 0,45 µm før overføring av utføres.
  5. Erstatte 6 mL av PA317 medium med fersk EGM og ruge over natten.
  6. Refeed EU med 12 mL frisk EGM og Inkuber en ytterligere 48 h.
  7. Å sub kultur EF, fjerne medium og vask med 12 mL PBS uten kationer, og legge 3 mL kommersielle enzymatisk dissosiasjon løsning (f.eks TrypLE) av og ruge ved 37 ° C i 3 min.
  8. Overføre celle suspensjon slik 15 mL koniske og sentrifuge 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspend den resulterende celle pellet i frisk EGM og deler jevnt i 3 x T75 flasker med siste volum på 12 mL EGM per kolbe.
  9. For å velge for Egenkapitalbevis transduced med E6 og E7, Legg G418 til en siste konsentrasjon av 200 µg/mL for to passasjer, etter som kan transduced EF belagt infisert eller frosset i flytende nitrogen.

3. Infeksjon av Transduced EC med KSHV

  1. dagen før infeksjon høste EF av enzymatisk fordøyelse bruke kommersielle enzymatisk dissosiasjon løsningen som beskrevet ovenfor. Resuspend celle pellet i 1 mL av EGM. Bruk 5 µL av celler til å forberede en 1/10 fortynning i Trypan blå. Telle levende celler ved hjelp av en hemocytometer og frø 2.5 x 10 5 levende celler i 2 mL EGM per brønn i 6 bra plater.
  2. Ved infeksjon, fjerne EGM og vaske celler med 3 mL PBS med kalsium og magnesium per brønn og legger 2 mL EBM.
    Merk: Det er viktig å bruke EBM i stedet for EGM under infeksjon, som heparin i EGM vil hemme binding av virus partikler til og påfølgende infeksjon i målet EC.
  3. å infisere celler med KSHV, Legg til 5 til 20 µL virus lager hver brønn og snurr å blande. For uekte-infiserte celler legge en lik mengde TNE buffer i hver brønn.
  4. Sentrifuge plater på 400 x g i 30 min ved romtemperatur og deretter Inkuber platene på 37 ° C i 90 min.
  5. Hvis målet av studien er å undersøke tidlige hendelser som krever en synkron virusinfeksjon, f.eks tidlig hendelser i de novo infeksjon, fjerne viral inoculum på dette punktet. Skyll og refeed cellene med 2 mL frisk EGM. Ellers legge 2 mL EGM og ruge kulturer over natten.
  6. Refeed celler med 2 mL EGM dagen etter infeksjon og deretter annenhver dag.
  7. Når celler er ca 90% confluent, høste av enzymatisk fordøyelse bruke kommersielle enzymatisk dissosiasjon løsning som beskrevet ovenfor, så basseng cellene fra tre brønner i en MT75, bemerker både hvor totale passasje og passering etter infeksjon.
  8. Utvide uekte - og KSHV-infisert EC med 1:3 deler for minst to mer passasjer da kan celler brukes i eksperimenter eller frosset i flytende nitrogen.
    Merk: Som med deling av EC transduced med E6 og E7,-vedlikehold kulturer av uekte - og KSHV-infiserte celler, skal deles før samløpet (~ 85-90%).

4. bekrefter infeksjon med KSHV av Immunofluorescence

Merk: gjenkjenning av KSHV ventetid-assosiert kjernefysiske antigen (LANA-1/ORF73) gir pålitelig kvantitativt mål på infeksjon. Anti-LANA antistoffer er kommersielt tilgjengelig.

  1. Dagen før flekker, plate to brønner hver med uekte - eller KSHV-infiserte EC på en 24-vel plate på 1 x 10 5 celler per bra i 1 mL EGM og ruge over natten.
  2. Vask celler to ganger med 500 µL PBS pluss kalsium og magniseum. Vask for 30 s på en rocking plattform.
  3. i et eksternt ventillated avtrekksvifte, fikse celler med 500 µL av 4% paraformaldehyde i 15 min ved romtemperatur.
  4. Vask celler tre ganger med 500 µL av vaskebuffer (0,1% Triton X-100 pluss 0.02% geit serum i PBS pluss kasjoner).
  5. Blokkere celler med 500 µL av 2% geit serum i vaskebuffer i 30 min ved romtemperatur.
  6. Vask celler tre ganger med 500 µL av vaskebuffer.
  7. Merke en brønn av uekte - eller KSHV-infiserte EC med 200 µL primære antistoff utvannet 1:100 i vaskebuffer i 30 min ved romtemperatur på en rocker. Inkuber de resterende to brønnene i 200 µL av vaskebuffer bare.
  8. Vask celler tre ganger med 500 µL av vaskebuffer.
  9. Merke alle fire brønner med 200 µL av sekundær antistoff utvannet 1: 100 i vaskebuffer i 30 min ved romtemperatur på en rocker.
  10. Vask celler tre ganger med 500 µL av vaskebuffer.
  11. i hver brønn bruke 20 µL av montering medium som inneholder DAPI og en dekkglassvæske og evaluere flekker med en invertert fluorescerende mikroskopet.
  12. Bestemme prosent infeksjon av KSHV-infiserte celler ved å telle antall LANA-positive kjerner i minst 200 celler. Infeksjon med rekombinant KSHV-Bac16 kanne likeledes være kontrollert via observasjon av kulturer for uttrykk for GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologi av primære EC er klassisk beskrevet som "brolegge-stein", og denne morfologi endres ikke av uttrykk papillomavirus E6 og E7 gener (figur 1A). Uttrykk for E6 og E7 genene alene få ikke en transformert fenotypen; dermed celler er utsatt for kontakt hemming og vil slutte å dele på å nå samløpet i kultur. Cellene vil imidlertid sprer og regrow til elvene trypsinization og replating på lavere tetthet, slik at vedlikehold av alder - og passasje-matchet kulturer for bruk som uekte-infiserte kontroller.

Infeksjon av E6/E7-transduced EC med KSHV fører til dramatiske morfologiske endringer i kultur som minner om "spindel celle" fenotypen observert i KS lesjoner (figur 1B). En transformert fenotypen er også indusert på infeksjon med KSHV, som er åpenbart delvis av tap av kontakt hemming når cellene er kultivert etter samløpet (figur 1 c) og anchorage uavhengig vekst i myk agar (figur 2). Tap av både kontakt hemming og avhengigheten av ekstra-mobile matrix samhandlinger (anchorage) under oncogenesis er to av kjennetegnene på mobilnettet transformasjon36. Det er viktig å merke seg at primære EC er også utsatt for infeksjon med KSHV og primære EC systemer har vært svært verdifull for Klargjørende ulike aspekter av virus-vert samspillet og dens konsekvenser. Slike studier er godt representert i litteratur og flere eksempler er sitert her37,38,39,40,41,42,43 ,44.

Immunofluorescent flekker viser at spindelen morfologi av KSHV-infiserte celler er forbundet med uttrykk for viral protein LANA-1/ORF73 (figur 3A og 3B, rød). Som konsentrasjonen av virus i aksjer vil variere mellom forberedelser, volumet av virus lagt per brønn skal justeres slik at KSHV-infiserte kulturer nå > 90% infeksjon innen ett eller to avsnitt. Med serielle passasje prosentandelen av infeksjon nærmer 100% og opprettholdes for varigheten av kultur (ca 20 passasjer). Lavere mengder virus kan brukes hvis en studie av paracrine påvirkninger er beregnet, eller hvis infisert naboceller er ønskelig som kontroller (f.eksfor immunofluorescence studier som involverer andre proteiner av interesse). Infiserte kulturer støtter også uttrykk for lytisk virale proteiner, men som er observert i KS lesjoner, bare et mindretall av celler i kultur gjennomgå spontant lytisk aktivering (figur 3B, grønn). Celler som er infisert med KSHV-BAC16, som er merket med GFP, også utvikle en spindel morfologi (Figur 3 c og 3D). Når KSHV-BAC16, kan viral titers fås ved å infisere celler med et serielt utvannet konsentrert virus lager og evaluere celler for GFP uttrykk på 48t innlegget infeksjon med flyt cytometri30.

For både rekombinant og WT virus, kan viral genomer i lager preparater også måles ved rensing av DNA fra infiserte celler etterfulgt av PCR kvantifisering av KSHV DNA nivåer; Imidlertid bør man ikke anta at alle genomer er smittsomme45. Hvis studiet av KSHV lytisk syklus er ment, virus reaktivering kan oppnås ved å stimulere EC med inducing agenter som beskrevet ovenfor for BCBL-1 celler, selv om effektiviteten av aktivering er lavere23. Lytisk syklus kan også være forårsaket av Albin på EC med KSHV transactivator protein ORF5046. Samsvar med funnene i andre celle kultur modeller for KS, både spontan uttrykk og kjemiske induksjon av KSHV lytisk gener i E6/E7-uttrykke EC reduseres over tid til tross for vedlikehold av en stabil latente infeksjon11,16 .

Figure 1
Figur 1: morfologi av uekte- og KSHV infisert EC. (A) Mock-infiserte EC monolayers utstillingen den klassiske brolegge stein opptreden av fase kontrast viktig mikroskopi. Uten handlingene til KSHV gener vil disse cellene er ikke forvandlet og derfor opphøre dele og vise kontakt hemming ved å nå samløpet i kultur. (B) KSHV-infiserte celler, i kontrast, utvikle en langstrakt "spindel celle" morfologi minner om KS spindel celler. Dette panelet viser morfologi av KSHV-infiserte celler på dag 5 PI på å nå samløpet. (C) i KSHV-infiserte celler, omfattende endringer i verten celle genuttrykk føre til mobilnettet transformasjon, som blir tydelig når KSHV-infiserte celler er kultivert uten passasje. Under slike forhold fortsatt KSHV-infiserte celler voksende aften etter rekkevidde samløpet fører til utvikling av flerlags foci av celler. Dette panelet viser morfologi av KSHV-infiserte celler på dag 14 PI, kultivert for 9 dager etter samløpet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Anchorage uavhengig vekst. Transformeringsinstruksjonene celler gjennomgå vanligvis apoptotisk celledød etter tap av kontakt med et substrat, en prosess som kalles anoikis. (A) når E6/E7-transduced mock-infiserte EF, og som ikke endres, er suspendert i myk agar og kultivert i to uker de ikke utgjør kolonier. (B) KSHV-infiserte Egenkapitalbevis, som virus-forvandlet, er motstandsdyktig mot anoikis og vil danne kolonier i myk agar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: demonstrasjon av viral protein uttrykk. (A) spindel morfologi er tydelig etter infeksjon med KSHV (40 X forstørrelse). (B) Immunofluorescent flekker i feltet vises i (A) viser at spindelen morfologi er forbundet med uttrykk for viral ventetid protein ORF73 (rød). Infiserte celler støtte lytisk viral replikasjon også, som demonstrert av en liten prosentandel av celler som uttrykker viral processivity faktor ORF59 (grønn). (A og B endret referanse26.) Spindel morfologi av celler som er infisert med KSHV-BAC16 virus (C) er knyttet til uttrykk for GFP (D) (20 X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oncogenesis er en må prosess som omgår viktig beskyttelse i en organisme36. Som KS lesjoner finnes langs et spekter av kronisk betennelse til sann sarkomer, krever utviklingen av visse patofysiologiske prosesser formidlet av KSHV at noen studier gjennomføres i celle kultur modeller som støtter transformasjon9. Det bør bemerkes at kontakt hemming og anchorage-avhengige vekst, fenotyper indikativ av mobilnettet transformasjon, ikke lett utvikle etter smitte av primære EC eller EC udødeliggjort av ytre uttrykk for telomerase. Derfor, mens i vitro modell av KS beskrevet her ikke er recapitulate alle aspekter av KS svulst microenvironment eller virkemåten for explanted KS celler, er det perfekt for studere endringer i verten celle genuttrykk forårsaket av infeksjon med KSHV som bidrar til KS tumorigenesis.

Først rapporterte gene expression profilering studie med kultur systemet beskrevet heri identifisert receptor tyrosine kinase c-settet som en bidragsyter til transformert fenotypen av KSHV-infiserte celler25. Slå ned c-Kit uttrykk bruker siRNA eller hemming av c-Kit signalnettverk bruker en dominerende negative konstruksjon eller tyrosin kinase inhibitor STI 571 (Imatinib) forstyrret transformere evne til KSHV manifest av tap av foci formasjon etter en lengre periode kultur av infiserte celler. Etterfølgende klinisk evaluering Imatinib har vist effekt av dette stoffet i pasienter med epidemien KS47,48,49. Andre potensielle behandling mål har også blitt identifisert, inkludert måltema oxygenase-126,50, CXCR727og den beta adrenerge reseptorer28, som spiller en rolle i vekst eller endring av EC i vitro. Bekreftelse av disse gene expression mønstre i primære EU så vel som KS biopsi vev bekrefter fysiologiske relevansen av dette systemet og understreker verdien som pre-klinisk modell for KS therapeutics25,26, 51,52,53,54,55.

En annen styrke E6/E7 signaltransduksjon systemet er at utvidet levetid av udødeliggjort i forhold til primære EC gjør langsiktig vedlikehold og passasje-matchet uekte-infiserte kontroll celler for sammenlignende evaluering av resultatene av KSHV infeksjon. Det er viktig å merke seg at for å maksimere antall passeringer av EU transduced med E6 og E7 er det avgjørende å dele kulturer før samløpet (~ 85-90%). Videre tolerere disse cellene serum-free betingelser for lengre perioder. Viktigste EC gjennomgå raskt programmert celledød ved vekstfaktor tilbaketrekning, og derfor være ikke kulturperler lange perioder uten serum- eller rekombinante vekstfaktorer56,57. Denne avhengigheten gjør autocrine signalnettverk trasé forårsaket av infeksjon med KSHV vanskelig å identifisere og studere, som før full transformasjon KSHV-infiserte celler vil også gjennomgå programmert celledød ved vekstfaktor uttak (upublisert observasjon). Tilstedeværelsen av E6 og E7 proteinene i denne modellen, men forhindre programmert celledød etter vekstfaktor uttak og tillater lengre (f.eks48t) kultur i lav serum eller serum gratis Middels25,26 , 28.

KS er en kompleks og uvanlig sykdom med både kronisk betennelse og mobilnettet transformasjon. Klinisk behovet for romanen strategier er stor, og celle kultur modellen beskrevet her har unike egenskaper som tillater vurdering av kandidaten narkotika mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 og P51 OD011092 (AVM); og tildele 14PRE20320014 fra Amerika Heart Association (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Kreft biologi problemet 126 Kaposis sarkom primære effusjon lymfom KSHV transformasjon oncogenesis endothelial celle
En <em>In Vitro </em>-modellen for å undersøke mobilnettet transformasjon av Kaposis sarkom Herpesvirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter