Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

ساركوما كابوزي (KS) ورم الناجمة عن العدوى بالفيروس النمطان الإنسان هربس-8/KS هربس (هف-8/كشف). نموذج الثقافة غشائي خلية الموصوفة هنا مناسبة فريدة لدراسة الآليات التي تحول كشف الخلايا المضيفة.

Abstract

ساركوما كابوزي (KS) هو ورم غير عادية تتألف من تكاثر المغزل الخلايا التي يتم تهيئتها بواسطة عدوى خلايا بطانية (EC) مع كشف، ويطور في أغلب الأحيان في الإعداد للكبت المناعي. على الرغم من عقود من البحث، لا يزال العلاج الأمثل من كانساس غير المحددة بوضوح والنتائج السريرية غير مواتية وبخاصة في الأماكن المحدودة الموارد. الآفات KS تحركها تولد الأوعية المرضية، والتهاب مزمن، وأونكوجينيسيس، وقد وضعت في المختبر خلية ثقافة نماذج مختلفة لدراسة هذه العمليات. KS ينشأ من الخلايا المصابة بكشف أصل غشائي، حيث توفر خلايا الجماعة الأوروبية-النسب في المختبر أنسب البدائل للسلائف الخلية المغزل. ومع ذلك، نظراً لأن الجماعة الأوروبية لها عمر محدود في المختبر ، واليات النمطان تستخدمهم كشف أقل كفاءة من تلك الفيروسات الورمية الأخرى، لقد كان من الصعب تقييم عمليات التحول في التعليم الابتدائي أو خلد تيلوميراسي ec. ولذلك، وضع نموذج رواية ثقافة تستند إلى المفوضية الأوروبية بسهولة يدعم التحول بعد الإصابة مع كشف. التعبير حمل خارج الرحم من جينات فيروس الورم الحليمي البشري النوع 16 E6 و E7 يسمح للثقافة الموسعة لمطابقة العمر ومرور وهمية وكشف-المصابين بالمفوضية الأوروبية ويدعم تطوير حقاً تحولت (أي، ورمي) النمط الظاهري في الثقافات الخلية المصابة . وسهلت هذا النموذج أصعب واستنساخه بدرجة عالية من كانساس اكتشاف عدة مسارات إشارات أساسية ذات الإمكانات العالية للترجمة إلى إعدادات السريرية.

Introduction

ساركوما كابوزي (KS) هو ورم أنجيوبروليفيراتيفي تنسيق المتعددة التي تؤثر على المواقع عن طريق الجلد والأغشية المخاطية الحشوي أن يطور الأكثر شيوعاً في الإعداد لقمع المناعة المتقدم1. وقد وصف النماذج الوبائية الأربعة: الكلاسيكية، وشكل من أشكال كسول عادة ما تؤثر على كبار السن من تراث البحر الأبيض المتوسط والشرق الأوسط؛ علاجية المنشأ، الناجمة عن المعالجة بالأدوية المثبطة للمناعة بعد زرع الأعضاء؛ هذا الوباء، تعريف الإيدز مرض سرطان؛ والمتوطنة، شكلاً مستقلاً عن فيروس نقص المناعة البشرية مشتركة في الأطفال في المناطق الموبوءة في أفريقيا. ومع ظهور أنظمة العقاقير المضادة للفيروسات الرجعية تركيبة فعالة لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية، أقل بكثير عادة يتم تشخيص KS الوباء في البلدان النامية. ومع ذلك، تظل النماذج العدوانية سريرياً المتوطنة والوبائية بين الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان في العديد من البلدان الأفريقية2،،من34. ولذلك، يعتبر تحديد أدوية فعالة تستهدف المرضية لعلاج كانساس أولوية بحثية.

الأشيع، تتميز الآفات KS neovascularization واسعة النطاق ولكن غير طبيعية حيث تشكل المغزل خلايا المنشأ الأوروبية شبكات الأوعية الدموية متقطع5. تسمح هذه السفن غير طبيعي ("الشقوق الأوعية الدموية") التسرب من الكريات الحمراء، التي تعطي الآفات لون مميز. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن الآفات الكريات البيضاء العديدة التي تميز الالتهاب المزمن (أي الخلايا الليمفاوية والضامة وخلايا البلازما). لقد وصف انحدار آفات كانساس بعد إعادة تشكيل المناعة، مما يوحي بأن سمات KS آفة فرط التكاثري وورم حقيقي6،،من78،9.

KS هربس (كشف)، المسبّب كانساس، حددت في عام 199410. منذ آنذاك كثيرة في المختبر خلية الثقافة-تم تطوير نماذج لتمكين الدراسات المرضية، بما في ذلك الخلايا اكسبلانتيد من المواد خزعة الورم والابتدائية أو المفوضية الأوروبية تعرب عن تيلوميراسي المصابين بكشف في المختبر11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18-أي من النماذج المتاحة حاليا ويجمل كانساس وورم المكروية تماما، ولكن جميعا أسهمت بمعرفة قيمة لفهم بل لكشف العدوى. خلافا الأخرى المعروفة ورمي الإنسان هربس فيروس ابشتاين-بار (EBV)، كشف عدم سهولة تحويل الخلايا في الثقافة عقب حيثياته العدوى19،،من2021، 22. ومع ذلك، تم التغلب على هذا القيد من ترانسدوسينج EC البشرية الأولية أما مختلطة الأصل ميكروفاسكولار أو اللمفاوية مع E6 واكتب E7 جينات من فيروس الورم الحليمي البشري 16 قبل الإصابة بكشف23،24 . التعبير عن هذه المسرطنة خارجية يزيد بشكل كبير احتمال تحويل لكشف في المختبر جزئيا بإتاحة المزيد من تثبيط الشبكية البروتين و p5323،24. أتاح هذا الأسلوب توصيل المفوضية الأوروبية مختبرات متعددة لتحديد التعديلات الرئيسية في المضيف التعبير الجيني في الخلايا التي هي الناجمة عن كشف العدوى والتي تظهر لتسهيل KS خلية البقاء على قيد الحياة وانتشار25،26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32-البروتوكولات المبينة في هذا التقرير مباشرة واستنساخه بدرجة عالية، وسوف تسفر عن توليد العمر ومرور مطابقة المفوضية الأوروبية كشف المصابين والمصابات موك عناصر التحكم التي يمكن أن يكون مثقف لأطول بكثير من الخلايا الأولية وسوف السماح بالتحقيق في آليات النمطان تستخدمهم كشف. على الرغم من أن البروتوكول يتضمن أسلوباً لإنتاج نوع المتوحش كشف من انصباب الابتدائي سرطان الغدد الليمفاوية الخلية خط BCBL-1، E6/E7-خلد الجماعة الأوروبية أيضا عرضه للعدوى مع باكميد المؤتلف المستمدة كشف BAC1630. يتم وصف بروتوكولات من أجل إعداد BAC16 في أماكن أخرى33،34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول في ظروف BSL-2-

1-"إعداد الأوراق المالية كشف"

  1. TNE إعداد المخزن المؤقت: حل ملغ 292.24 يدتا في ddH 2 س وتقديمهم إلى 225 مل، وضبط لدرجة الحموضة 8. حل ملغ 605.7 تريس في ddH 2 س وتقديمهم إلى 225 مل، وضبط لدرجة الحموضة 8. الجمع بين الحلول يدتا وتريس، إضافة ز 4.38 كلوريد الصوديوم، ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل، وتصفية تعقيم، وتخزينها في 4 درجات مئوية .
  2. الثقافة كشف الإيجابية، السلبية EBV انصباب الابتدائي سرطان الغدد الليمفاوية الخلية خط BCBL-1 في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5% CO 2 في ربمي تستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) ومضادات الميكروبات إلى حوالي 1 1.2 × 10 6 خلايا كل مل.
  3. للحث على كشف الإنتاج، تقسيم الثقافات 1:2 مع متوسطة جديدة وإضافة Phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) بتركيز نهائي من 20 نانوغرام/مليلتر واحتضان الثقافات لمدة 5 أيام. وكبديل لذلك، يعامل الخلايا مع بوتيرات الصوديوم (قبض؛ 0.1 ملم) لمدة 3 أيام للحث على النسخ المتماثل الفيروسية الحال.
  4. حصاد الجسيمات الفيروسية، الطرد المركزي أولاً ثقافة طافية على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه الخلايا ونقل سوبيرناتانتس إلى أنابيب جديدة.
  5. لزيادة توضيح المادة طافية لتجنب نقل الحطام الخلوية، الطرد المركزي في 2,500 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
    ملاحظة: كبديل للطرد المركزي عالية السرعة توضيحاً لثقافة سوبيرناتانتس، الترشيح عن طريق 0.45 عقيمة يمكن إجراء تصفية ميكرومتر. وقد لاحظنا انخفاض ملحوظ في عيار استخدام الترشيح؛ ولذلك، نقوم بشكل روتيني الطرد المركزي والخطوة الثانية بدلاً من ذلك.
  6. المقبل، تراكب 5 مل محلول السكروز 25% في المخزن المؤقت TNE مع حوالي 30 مل ثقافة أوضح طافية في أنابيب أولتراسينتريفوجي 6-
  7. الطرد المركزي موازنة الأنابيب في 75,000 س ز 2 ح في 4 درجات مئوية تحت الفراغ.
  8. صب الثقافة طافية ولطخة حافة كل أنبوبة لإزالة قدر حل المادة طافية والسكروز قدر الإمكان، ثم ريسوسبيند بيليه الفيروسات، التي قد لا تكون مرئية في 150 ميليلتر من المخزن المؤقت TNE.
  9. تجمع كل حراكه الفيروس، يخلط جيدا، وتجميد 25 ميليلتر مختبرين في-80 درجة مئوية .

2. توصيل من المفوضية الأوروبية مع E6 و E7 جينات فيروس الورم الحليمي

ملاحظة: نستخدم قوارير زراعة الأنسجة القياسية بشكل روتيني لزراعة الأولية الجماعة الأوروبية. ومع ذلك، إذا كان يتم الحصول على النمو غير مرضية من المفوضية الأوروبية ثم استخدام قوارير الثقافة التجارية ينبغي النظر.

  1. الثقافة الأولية البشرية عن طريق الجلد microvascular أو اللمفاوية المفوضية الأوروبية في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5% CO 2 في الجماعة الأوروبية النمو المتوسطة (EGM؛ يحتوي على المفوضية الأوروبية المتوسطة القاعدية [EBM] تستكمل مع "بوليتكيت" EGM-2 [تحتوي على FBS، الهيدروكورتيزون وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية البشرية-ب وعامل نمو الأوعية الدموية في المفوضية الأوروبية، مثل الأنسولين عامل النمو-1، حمض الأسكوربيك، البشرية عامل النمو الظهارية، والمضادات الحيوية والهيبارين]) في قارورة ثقافة خلية T75 إلى ما يقرب من 50% التقاء.
  2. لتوصيل، خلايا الثقافة لكسسن PA317 16E6E7 24 ، 35 في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5% CO 2 في دميم وتستكمل مع 10% FBS ومضادات الميكروبات في T150 خلية ثقافة قارورة حتى هم روافد 90% تقريبا. ثم احتضانها بين عشية وضحاها في 16 مل متوسطة.
  3. توضيح المتوسطة PA317 من سينتريفوجينج على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
  4. إزالة اجتماع فريق الخبراء من الخلايا الثقافة وتراكب المفوضية الأوروبية مع 12 مل الوسط PA317 أوضح واحتضانها ل 4 h.
    ملاحظة: سينتريفوجينج 16 مل متوسطة مكيفة على 300 غرام x لنتائج دقيقة 5 في بيليه مدمجة التي لا تشعر بالقلق إزاء إزالة اللاحقة حذراً من 12 مل لتوضيح المادة طافية. ومع ذلك، إذا نقل الخلايا 16E6E7 لكسسن PA317 إلى الابتدائي EC الثقافات مصدر قلق (خط خلية التعبئة والتغليف وسوف تتفوق بسرعة المفوضية الأوروبية)، ثم الترشيح من المادة طافية مكيفة من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر قبل نقل يمكن تنفيذ-
  5. استبدال 6 مل الوسط PA317 EGM الطازجة واحتضان بين عشية وضحاها.
  6. "ريفيد المفوضية الأوروبية" مع 12 مل EGM الطازجة واحتضان h. 48 مزيد من
  7. بدون ثقافة الجماعة الأوروبية، إزالة المتوسطة ويغسل مع 12 مل من برنامج تلفزيوني دون الكاتيونات، وأضف 3 مل حل الانفصال الانزيمية التجارية (مثلاً، تريبل) واحتضانها في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3
    8. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل
  8. والطرد المركزي في ز 300 x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند بيليه الخلية الناتجة في EGM الطازجة وتقسم بالتساوي إلى 3 قوارير x T75 مع وحدة تخزين نهائي لمل 12 اجتماع فريق الخبراء في قارورة.
  9. لتحديد للجماعة الأوروبية ترانسدوسيد مع E6 و E7، إضافة G418 إلى تركيز نهائي 200 ميكروغرام/مل للممرات اثنين، يمكن بعدها مطلي للإصابة أو تجميدها في نيتروجين سائل الجماعة الأوروبية ترانسدوسيد-

3. العدوى "الجماعة الأوروبية ترانسدوسيد" بكشف

  1. في اليوم الذي يسبق الإصابة بحصاد المفوضية الأوروبية بالهضم الأنزيمي باستخدام الحل الانفصال الانزيمية التجارية كما هو موضح أعلاه. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من اجتماع فريق الخبراء. استخدام 5 ميليلتر من الخلايا لتحضير 1/10 إضعاف في تريبان الأزرق. عد الخلايا الحية باستخدام هيموسيتوميتير والبذور 2.5 × 10 5 خلايا حية في 2 مل من اجتماع فريق الخبراء في بئر في 6 لوحات جيدا.
  2. اليوم من العدوى، إزالة EGM وتغسل الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم في البئر، وثم إضافة 2 مل EBM.
    ملاحظة: من الضروري استخدام EBM بدلاً من اجتماع فريق الخبراء خلال العدوى، كما سوف تمنع الهيبارين في EGM ملزمة جسيمات الفيروسية والإصابة اللاحقة بهدف الجماعة الأوروبية.
    3. إضافة الأسهم فيروس ميليلتر 5 إلى 20 لكل بئر
  3. لتصيب الخلايا مع كشف، ودوامه لوح لمزج. لإضافة الخلايا المصابة وهمية بحجم المخزن المؤقت TNE متساوية لكل بئر.
  4. الطرد المركزي لوحات في 400 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واحتضان ثم اللوحات في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 90
  5. إذا كان الهدف من هذه الدراسة التحقيق في الأحداث المبكرة التي تتطلب متزامن التهاب فيروسي، مثلاً، الأحداث المبكرة في حيثياته العدوى، إزالة العدوى الفيروسية عند هذه النقطة. شطف وريفيد الخلايا مع 2 مل EGM الطازجة. وبخلاف ذلك، إضافة 2 مل EGM واحتضان الثقافات بين عشية وضحاها.
  6. ريفيد الخلايا مع 2 مل EGM اليوم بعد الإصابة وبعد ذلك مرة كل يومين-
  7. عندما تكون الخلايا حوالي 90% روافد، حصادها بالهضم الأنزيمي باستخدام الحل الانفصال الانزيمية التجارية كما هو موضح أعلاه، ثم تجمع الخلايا من ثلاثة آبار في T75، مشيراً إلى عدد إجمالي المرور ومرور ما بعد الإصابة.
    8. قم بتوسيع
  8. وهمية وكشف-المصابين بالمفوضية الأوروبية مع تقسيمات 1:3 للممرات أكثر اثنين على الأقل في الوقت الذي يمكن استخدامه في تجارب الخلايا أو تجميدها في نيتروجين سائل.
    ملاحظة: كما هو الحال مع تقسيم للجماعة الأوروبية ترانسدوسيد مع E6 و E7، صون الثقافات من الخلايا المصابة وهمية وكشف يجب تقسيمها قبل التوصل إلى التقاء (~ 85 إلى 90%).

4. "تأكيد الإصابة" بكشف طريق الفلورة

ملاحظة: الكشف كشف الكمون المرتبطة النووية مستضد (LANA-1/ORF73) يوفر مقياس كمي موثوق للعدوى. الأجسام المضادة-LANA متوفرة تجارياً.

  1. في اليوم السابق لتلطيخ، آبار لوحة اثنين كل منهما مع موك-كشف-إصابة أو الجماعة الأوروبية على لوحة 24-جيدا في 1 × 10 5 خلايا كل جيدا في 1 مل EGM واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. الخلايا يغسل مرتين مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم وماجنيسيوم. أغسل لمدة 30 ثانية على منصة هزاز.
  3. في غطاء دخان خارجياً-فينتيلاتيد، إصلاح الخلايا مع 500 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  4. يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (0.1% X-100 تريتون زائد مصل الماعز 0.02 في المائة في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الاتصالات)-
  5. كتلة الخلايا مع 500 ميليلتر من مصل الماعز 2% في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  6. يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-
  7. تسمية بئر واحدة من موك-كشف-إصابة أو تضعف الجماعة الأوروبية مع 200 ميليلتر من جسم الابتدائي 01:100 في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك. احتضان بئرين المتبقية في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل فقط.
  8. يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-
  9. تسمية جميع الآبار الأربعة مع 200 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف 1: 100 في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك.
  10. يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-
  11. لكل بئر تطبيق 20 ميليلتر من تصاعد DAPI تحتوي على المتوسط وساترة وتقييم التلوين باستخدام مجهر فلوري مقلوب.
  12. تحديد نسبة العدوى من الخلايا المصابة بكشف عن طريق العد عدد الأنوية LANA إيجابية في الخلايا على الأقل 200. العدوى مع المؤتلف يمكن أيضا رصد كشف Bac16 عن طريق مراقبة ثقافات للتعبير عن التجارة والنقل-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مورفولوجية EC الابتدائي الكلاسيكي توصف بأنها "حجر cobble"، ولا يتم تبديل هذا التشكل بالتعبير عن فيروس الورم الحليمي E6 و E7 الجينات (الشكل 1A). تعبير الجينات E6 و E7 وحدها لا الحث النمط الظاهري تحول؛ وهكذا، الخلايا عرضه للاتصال بتثبيط ويتوقف بتقسيم عند التوصل إلى التقاء في الثقافة. لكن سوف الخلايا تتكاثر وتنمو لالتقاء تريبسينيزيشن وريبلاتينج في أقل كثافة، مما يسمح للحفاظ على الثقافات العمر ومرور مطابقة لاستخدامها كعناصر تحكم إصابة صورية.

تسبب العدوى للجماعة الأوروبية E6/E7-ترانسدوسيد مع كشف التغييرات الشكلية المثيرة في الثقافة التي تذكرنا بالنمط الظاهري "خلية المغزل" لاحظ في كانساس الآفات (الشكل 1B). كما فعل النمط الظاهري تحولت عند الإصابة بكشف، الذي يتجلى في جزء منه بفقدان تثبيط الاتصال عندما تكون الخلايا المستزرعة بعد التقاء (الشكل 1) والنمو المستقل مرسى في أجار الناعمة (الشكل 2). فقدان تثبيط الاتصال والاعتماد على التفاعلات الخلوية خارج المصفوفة (مرسى) أثناء أونكوجينيسيس وهما من السمات المميزة للتحول الخلوي36. من المهم أن نلاحظ أن الجماعة الأوروبية الرئيسية أيضا عرضه للإصابة بكشف ونظم الجماعة الأوروبية الأولية كانت قيمة للغاية لتوضيح الجوانب المتنوعة للتفاعل الفيروس--المضيف، وعواقبه. هذه الدراسات ممثلة جيدا في الأدب والعديد من الأمثلة المذكورة في هذا البرنامج37،،من3839،،من4041،42،43 ،44.

تلطيخ إيمونوفلوريسسينت يوضح أن مورفولوجية المغزل الخلايا المصابة بكشف يرتبط بالتعبير عن البروتين الفيروسي LANA-1/ORF73 (الشكل 3A و 3 باء، الأحمر). كما سوف تختلف تركيز الفيروس في الأرصدة بين الأعمال التحضيرية، ينبغي تعديل حجم الفيروس وأضاف كل بئر تصل إلى الثقافات المصابة بكشف > العدوى 90% داخل الممرات واحد أو اثنين. مع مرور المسلسل ستتصل 100% النسبة المئوية للإصابة وسيستمر لمدة الثقافة (حوالي 20 الممرات). يمكن استخدام كميات أقل من الفيروسات إذا كان الهدف هو دراسة التأثيرات paracrine، أو إذا كانت الخلايا مصابة المتاخمة مرغوب فيه كعناصر تحكم (مثل، الفلورة الدراسات التي تنطوي على البروتينات الأخرى ذات الأهمية). دعم الثقافات المصابة أيضا التعبير عن الحال البروتينات الفيروسية ولكن، كما يلاحظ في كانساس الآفات، أقلية فقط من الخلايا في ثقافة سيخضع تلقائياً تنشيط الحال (الشكل 3B، الأخضر). كما وضع الخلايا المصابة مع كشف-BAC16، الذي هو معلم مع التجارة والنقل، مورفولوجيا مغزل (الشكل 3 و 3D). عندما يتم استخدام كشف BAC16، يمكن الحصول على التتر الفيروسية بإصابة الخلايا بمخزون فيروس تتركز تضعف على نحو متسلسل، وتقييم الخلايا لتعبير بروتينات فلورية خضراء في 48 ساعة بعد الإصابة استخدام التدفق الخلوي30.

المؤتلف ووزن الفيروس، يمكن أن تقاس الجينوم الفيروسي في الأعمال التحضيرية للأسهم بتنقية الحمض النووي من الخلايا المصابة التي تليها PCR الكمي لمستويات "كشف الحمض النووي"؛ ومع ذلك، واحدة ينبغي أن لا تفترض أن جينومات جميع المعدية45. إذا كان القصد من الدراسة دورة كشف الحال، إعادة تنشيط الفيروس يمكن أن يتحقق بحفز الجماعة الأوروبية مع حفز عوامل كما هو موضح أعلاه للخلايا BCBL-1، على الرغم من أن كفاءة إعادة التنشيط هو انخفاض23. دورة الحال أيضا يمكن أن تكون الناجم عن توصيل للمفوضية الأوروبية مع البروتين ترانساكتيفاتور كشف ORF5046. يتفق مع النتائج التي توصل إليها في نماذج الثقافة خلية أخرى من كانساس، التعبير العفوي والحث الكيميائي لكشف الجينات الحال في E6/E7-الإعراب عن المفوضية الأوروبية يتناقص مع مرور الوقت على الرغم من المحافظة على العدوى الكامنة مستقرة11،16 .

Figure 1
رقم 1: مورفولوجية موك-وكشف المصابين ec. (أ) المفوضية الأوروبية المصابة موك مونولاييرس المعرض cobble الكلاسيكية ظهور الحجر الطوري الحيوية. دون إجراءات كشف جينات هذه الخلايا لا تتحول وعليه الكف عن تقسيم ويحمل إعاقة الاتصال عند التوصل إلى التقاء في الثقافة. وفي المقابل، وضع الخلايا المصابة بكشف (ب)، مورفولوجيا ممدود "المغزل في خلية" تذكرنا KS المغزل خلايا. يظهر هذا الفريق مورفولوجيا الخلايا المصابة بكشف في اليوم 5 بي عند التوصل إلى التقاء. (ج) الخلايا المصابة "في كشف"، تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني في الخلايا المضيفة يؤدي إلى التحول الخلوي، الذي يصبح واضحا عندما يتم استزراع الخلايا المصابة بكشف دون المرور. في ظل هذه الظروف، تستمر الخلايا المصابة بكشف تنتشر حتى بعد التوصل إلى التقاء المؤدية إلى تطوير بؤر متعددة الطبقات من الخلايا. يظهر هذا الفريق مورفولوجيا الخلايا المصابة بكشف في يوم 14 PI، مثقف لالتقاء ما بعد 9 أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: النمو المستقل انكوراج. عادة الخلايا تناظري الخضوع لموت الخلايا أبوبتوتيك بعد فقدان الاتصال مع الركازة، عملية تسمى anoikis. (أ) ترانسدوسيد E6/E7 عند إصابة صورية الجماعة الأوروبية، التي لا تحول، وعلقت في أجار لينة ومثقف لمدة أسبوعين وهي لا تشكل مستعمرات. (ب) المصابة بكشف المفوضية الأوروبية، وتحول الفيروس، تقاوم anoikis وسوف تشكل مستعمرات في أجار الناعمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مظاهرة لتعبير البروتينات الفيروسية. (أ) مورفولوجية المغزل يتضح أثر الإصابة بكشف (40 X التكبير). تلطيخ إيمونوفلوريسسينت من نفس الحقل المبينة في () (ب) يوضح أن مورفولوجية المغزل يرتبط بالتعبير عن البروتين الفيروسي الكمون ORF73 (أحمر). الخلايا المصابة دعم النسخ المتماثل الفيروسية الحال كذلك، كما يتضح من نسبة مئوية صغيرة من الخلايا معربا عن برو الفيروسيةعامل سيسيفيتي ORF59 (أخضر). (أ وب تعديل من مرجع26). مورفولوجية المغزل خلايا المصابين بالفيروس كشف-BAC16 (ج) يرتبط بالتعبير "التجارة والنقل" (د) (20 X التكبير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أونكوجينيسيس هو عملية متعددة الخطوات التي تلتف ضمانات هامة داخل الكائن حي36. نظراً لعدم وجود آفات KS على طول طائفة التهاب مزمن الطويلا صحيح، يتطلب توضيح بعض العمليات الفيزيولوجية المرضية بكشف وساطة إجراء بعض الدراسات في نماذج الثقافة الخلية التي تدعم التحول9. تجدر الإشارة إلى أن فقدان الاتصال تثبيط ومرسى-تعتمد على النمو، تعمل يدل على التحول الخلوي، لا تتطور سهولة عقب العدوى الأولية الجماعة الأوروبية أو EC خلد خارجية التعبير عن تيلوميراسي. ولذلك، بينما لا الخص النموذجية في المختبر من كانساس الموصوفة هنا جميع جوانب كانساس وورم المكروية أو السلوك اكسبلانتيد KS الخلايا، أنها مناسبة فريدة لدراسة التغيرات في التعبير الجيني الخلية المضيفة الناجم عن الإصابة كشف أن يسهم في كانساس tumorigenesis.

ذكرت الأول التعبير الجيني التنميط دراسة استخدام نظام الثقافة ووصف هذه الوثيقة تحديد مستقبلات التيروزين كيناز ج-الطقم كمساهم في النمط الظاهري تحول الخلايا المصابة بكشف25. نهدم ج-طقم التعبير استخدام siRNA أو تثبيط ج-مجموعة إشارات مهيمنة سلبية بناء أو تيروزين كيناز مثبط STI 571 (Imatinib) باستخدام تداخلها مع إمكانية تحويل بيان كشف خسارة لتشكيل بؤر بعد فترة طويلة ثقافة خلايا المصابة. تقييم Imatinib السريرية اللاحقة أثبتت فعالية هذا الدواء في المرضى الذين يعانون من وباء KS47،،من4849. تم أيضا تحديد أهداف محتملة أخرى في المعاملة، بما في ذلك،أوكسيجيناسي-126الهيم50، CXCR727، وبيتا مستقبلات ادريناليه28، التي تلعب دوراً في النمو أو التحول من المفوضية الأوروبية في المختبر. تأكيدا لهذه الأنماط التعبير الجيني في المفوضية الأوروبية الأساسية، فضلا عن الأنسجة خزعة KS يؤكد أهمية هذا النظام الفسيولوجي ويؤكد قيمته كنموذج ما قبل سريرية كانساس المداواة25،26، 51،52،53،،من5455.

قوة نظام توصيل E6/E7 آخر أن تمديد العمر الافتراضي لتخليد مقارنة بالابتدائي بتمكين المفوضية الأوروبية الصيانة الطويلة الأجل للعمر والخلايا المطابقة مرور التحكم إصابة صورية للتقييم المقارن لنتائج كشف العدوى. من المهم أن نلاحظ أنه من أجل تحقيق أقصى عدد الممرات للجماعة الأوروبية ترانسدوسيد مع E6 و E7 من الأهمية بمكان لتقسيم الثقافات قبل التوصل إلى التقاء (~ 85 إلى 90 في المائة). وعلاوة على ذلك، هذه الخلايا تحمل ظروف خالية من المصل لفترات طويلة من الزمن. المفوضية الأوروبية الأولية سرعة الخضوع لموت الخلايا المبرمج عند انسحاب عامل النمو، وبالتالي لا يمكن مثقف لفترات طويلة دون المصل أو عوامل النمو الماشوب56،57. يجعل هذا الاعتماد autocrine مما يشير إلى مسارات الناجم عن الإصابة بصعوبة في تحديد ودراسة وكشف ما قبل التحول الكامل سيخضع الخلايا المصابة بكشف أيضا إلى موت الخلايا المبرمج عند انسحاب عامل النمو (غير منشورة المراقبة). وجود البروتينات E6 و E7 في هذا النموذج، ومع ذلك، منع موت الخلايا المبرمج في أعقاب انسحاب عامل النمو والسماح لفترة طويلة (مثلاً، 48 ساعة) الثقافة في المصل منخفضة أو متوسطة مجاناً25،المصل26 , 28.

كانساس مرض معقد وغير عادية مع ميزات كل من التهاب مزمن والتحول الخلوي. الحاجة السريرية للاستراتيجيات العلاجية رواية عظيمة، ونموذج الثقافة الخلية الموضحة هنا الخصائص الفريدة التي تسمح بتقييم المرشح أهداف المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل قبل HD068322 K12 (SCM)؛ R01 CA179921 و P51 OD011092 للمركبات؛ وجائزة 14PRE20320014 من جمعية القلب الأمريكية (س. ب).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

بيولوجيا السرطان، مسألة 126، ساركوما كابوزي، انصباب الابتدائي الأورام اللمفاوية، كشف، التحول، أونكوجينيسيس، والخلايا البطانية
نموذج <em>في المختبر </em>لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter