Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Een In Vitro Model voor het bestuderen van cellulaire transformatie door Kaposi sarcoom Herpesvirus

doi: 10.3791/54828 Published: August 25, 2017

Summary

Kaposi sarcoom (KS) is een tumor die is veroorzaakt door infectie met de oncogene virus Humaan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). De endothelial cell cultuur model hier beschreven is uniek geschikt voor de studie van de mechanismen waarmee KSHV gastheer cellen transformeert.

Abstract

Kaposi sarcoom (KS) is een ongewone tumor bestaat uit delende cellen van de spindel dat is geïnitieerd door infectie van endotheliale cellen (EG) met KSHV, en meestal ontwikkelt in de instelling bij immuunsuppressie. Ondanks decennia van onderzoek, optimale behandeling van KS blijft slecht gedefinieerde en klinische resultaten zijn vooral ongunstige in resource-beperkte instellingen. KS laesies worden gedreven door pathologische angiogenese, chronische ontsteking en oncogenese en verschillende in vitro cel cultuur modellen zijn ontwikkeld om deze processen te bestuderen. KS vloeit voort uit KSHV-geïnfecteerde cellen van de oorsprong van het endotheel, dus EG-afstamming-cellen zorgen voor de meest geschikte in vitro surrogaten van de voorloper van de spindel cel. Echter, omdat EG hebben een levensduur beperkt in vitro , en zoals de oncogene mechanismen werkzaam bij KSHV zijn minder efficiënt zijn dan die van andere tumorigene virussen, is moeilijk te beoordelen van de processen van transformatie in primaire of telomerase-vereeuwigd EC. Daarom werd een nieuwe EG gebaseerde cultuur model ontwikkeld dat ondersteunt transformatie na infectie met KSHV. Ectopische uitdrukking van de genen van de E6 en E7 van humaan papillomavirus type 16 zorgt voor uitgebreide cultuur van leeftijd - en passage-matched mock - en KSHV-besmette EG en ondersteunt de ontwikkeling van een echt getransformeerd (dat wil zeggen, tumorigene) fenotype in geïnfecteerde celculturen . Dit hanteerbare en zeer reproduceerbaar model van KS heeft de ontdekking van verschillende essentiële signaalroutes met een hoog potentieel voor vertaling in klinische instellingen vergemakkelijkt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kaposi sarcoom (KS) is een multi focale angioproliferative tumor beïnvloeden dermale, cutane en viscerale sites die meestal in het kader van geavanceerde immuun onderdrukking1 ontwikkelt. Vier epidemiologische vormen zijn beschreven: classic, een vadsig formulier buikvliesontsteking meestal oudere mensen van mediterrane en Midden-Oosten erfgoed; iatrogene, als gevolg van behandeling met Immunosuppressieve medicijnen na orgaantransplantatie; epidemie, een AIDS-definiëren kanker; en endemisch, een HIV-zelfstandige vorm vaak voor bij kinderen in endemische gebieden in Afrika. Met de komst van effectieve combinatie regimes van de anti-retrovirale geneesmiddelen voor de behandeling van HIV, is epidemische KS veel minder vaak gediagnosticeerd in ontwikkelingslanden. De klinisch agressieve endemische en epidemische vormen blijven echter onder het meest gediagnosticeerde kankers in vele Afrikaanse landen2,-3,4. Daarom is de identificatie van effectieve pathogenese-gerichte medicijnen voor behandeling van KS een onderzoeksprioriteit.

Histologisch, worden KS laesies gekenmerkt door uitgebreide maar abnormale neovascularization waarbij spindel cellen van EG oorsprong discontinue vasculaire netwerken5vormen. Deze abnormale schepen ("vasculaire spleten") toestaan extravasation van erytrocyten, waardoor laesies hun karakteristieke kleur. Daarnaast bevatten laesies talrijke leukocyten, die kenmerkend zijn voor chronische ontsteking (dat wil zeggen, lymfocyten, macrofagen en plasmacellen). Regressie van KS letsels na immuunsysteem reconstitutie werd genoemd, wat suggereert dat KS kenmerken van zowel een hyper-proliferatieve laesie en een ware tumor6,7,8,9 heeft.

KS herpesvirus (KSHV), de verwekker van KS, werd in 199410geïdentificeerd. Sinds dan veel in vitro cultuur van de cel modellen zijn ontwikkeld zodat de pathogenese studies, met inbegrip van cellen transplanteren van tumor biopsie materiaal en primaire of uiting van telomerase EG geïnfecteerd met KSHV in vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. geen van de momenteel beschikbare modellen volledig recapituleert de KS tumor communicatie, maar alle waardevolle kennis aan ons begrip van de pathobiology van KSHV infectie hebben bijgedragen. In tegenstelling tot de andere bekende tumorigene Humaan herpesvirus Epstein - Barr virus (EBV), wordt het KSHV niet gemakkelijk transformeren bij cellen in cultuur na DOVO infectie19,20,21, 22. echter deze beperking heeft overwonnen door transducing primaire menselijke EG van hetzij microvasculaire of lymfatische oorsprong gemengd met de E6 en E7 genen van humaan papillomavirus typen 16 voorafgaand aan infectie met KSHV23,24 . Uitdrukking van deze exogene oncogenen verhoogt drastisch het transformerende potentieel van KSHV in vitro gedeeltelijk door de toekenning van aanvullende remming van de Retinoblastoom eiwitten en p5323,24. Deze EG transductie methode heeft toegestaan meerdere laboratoria vast te stellen van belangrijke wijzigingen in ontvangende cel de expressie van genen die worden veroorzaakt door infectie van de KSHV en die lijken te vergemakkelijken van KS cel overleving en proliferatie25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de hierin beschreven protocollen zijn eenvoudig en zeer reproduceerbaar, en zal resulteren in het genereren van leeftijd - en passage-matched KSHV-geïnfecteerde EG en mock-geïnfecteerde besturingselementen die kunnen worden gekweekt voor veel langer dan primaire cellen en zal zorgen voor het onderzoek van oncogene mechanismen werkzaam bij KSHV. Hoewel het protocol bevat een methode voor de productie van wild type KSHV uit de primaire effusie lymfoom cellijn BCBL-1, E6/E7-vereeuwigd EG zijn ook zeer gevoelig voor infectie met recombinant BACmid afgeleid KSHV-BAC1630. Protocollen voor bereiding van BAC16 worden elders beschreven33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: alle procedures die worden beschreven in dit protocol moeten worden uitgevoerd onder BSL-2 voorwaarden.

1. KSHV voorraad voorbereiding

  1. bereiden TNE buffer: Los 292.24 mg EDTA in ddH 2 O, 225 mL brengen en aan te passen aan pH 8. Los 605.7 mg Tris in ddH 2 O, breng aan 225 mL, en aan te passen aan pH 8. EDTA en Tris oplossingen combineren, Voeg 4.38 g NaCl, aanpassen eindvolume tot 500 mL, filteren steriliseren en bewaren bij 4 ° C .
  2. De KSHV-positieve, EBV-negatieve primaire effusie lymfoom cellijn BCBL-1 in een bevochtigde incubator bij 37 ° C plus 5% CO 2 in RPMI aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en antimicrobiële stoffen ongeveer 1 cultuur naar 1.2 x 10 6 cellen per mL.
  3. Voor het opwekken van KSHV productie, splitsen culturen 1:2 met verse medium en Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) toevoegen om een eindconcentratie van 20 ng/mL en culturen Incubeer gedurende 5 dagen. Als alternatief, het behandelen van cellen met natrium butyraat (NaB; 0.1 mM) voor 3 dagen voor het opwekken van lytische virale replicatie.
  4. Verkrijgen virale deeltjes, centrifugeer eerst het supernatant bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur pellet van de cellen en overbrengen van supernatant naar verse buizen cultuur.
  5. Te verduidelijken het supernatant teneinde de overdracht van cellulaire puin, centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    Opmerking: als alternatief voor hoge snelheid centrifugeren voor verduidelijking van supernatant van cultuur, filtratie via een steriele 0,45 µm filter kan worden uitgevoerd. We hebben gezien een significante daling van de titer gebruiken filtratie; Daarom we routinematig uitvoeren de tweede stap van het centrifugeren in plaats daarvan.
  6. Vervolgens overlay 5 mL 25% sacharoseoplossing in TNE buffer met ongeveer 30 mL van de geklaarde cultuur supernatant in 6 buizen van de ultracentrifuge.
  7. Centrifuge buizen bij 75.000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C onder vacuüm evenwichtige.
  8. Cultuur supernatant decanteren en wissen van de rand van elke buis om zoveel supernatant en sacharose oplossing mogelijk, dan resuspendeer de pellet virus, die zijn niet altijd zichtbaar, in 150 µL van TNE buffer.
  9. Zwembad alle geresuspendeerde virus, meng goed, en het bevriezen van 25 µL aliquots bij -80 ° C .

2. Transductie van de EG met de E6 en E7 Papillomavirus Genes

Opmerking: We gebruiken routinematig standaard weefselkweek kolven voor groeiende primaire EC. Echter als onvoldoende groei van de EG worden verkregen dan het gebruik van commerciële cultuur kolven moet worden beschouwd.

  1. Cultuur primaire menselijke dermale microvasculaire of lymfatische EG in een bevochtigde incubator bij 37 ° C vermeerderd met 5% CO 2 in EG groeimedium (BAVA; bevat EG Basaal medium [EBM] aangevuld met BAVA-2 BulletKit [met FBS, hydrocortison, menselijke fibroblast groeifactor-B, vasculaire EG groeifactor, insuline-achtige groeifactor-1, ascorbinezuur, menselijke epitheliale groeifactor, antibiotica en heparine]) in een maatkolf van T75 cel cultuur tot ongeveer 50% samenkomst.
  2. Voor signaaltransductie, cellen cultuur PA317 LXSN 16E6E7 24 ,, 35 in een bevochtigde incubator bij 37 ° C plus 5% CO 2 in DMEM aangevuld met 10% FBS en antimicrobiële stoffen in een T150 cel cultuur kolf totdat ze ongeveer 90% heuvels. Vervolgens na een nacht bebroeden in 16 mL voedingsbodem.
  3. Het PA317 medium door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur verduidelijken.
  4. Verwijderen van de BAVA van de EG cultuur en overlay cellen met 12 mL van het geklaarde PA317 medium en incubeer gedurende 4 h.
    Opmerking: Centrifugeren 16 mL van geconditioneerde medium bij 300 x g gedurende 5 min resultaten in een compacte pellet die niet wordt verstoord door de zorgvuldige latere verwijdering van 12 mL van het supernatans dat verduidelijkt. Echter, als de overdracht van PA317 LXSN 16E6E7 cellen aan primaire EG culturen is een bron van zorg (de verpakkingslijn voor de cel zal snel ontgroeien EG), vervolgens filtratie van het geconditioneerde supernatant door een 0,45 µm filter voor overdracht kan worden uitgevoerd.
  5. 6 mL van het PA317 medium vervangen door verse BAVA en na een nacht bebroeden.
  6. EG bijvoeding met 12 mL verse BAVA en incubeer een verdere 48 h.
  7. Tot sub cultuur de EG, verwijderen van middellange en wassen met PBS zonder kationen, 12 mL en voeg 3 mL van de oplossing van de commerciële enzymatische dissociatie (bv TrypLE) door en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten
  8. Overbrengen in een conische tube van 15 mL celsuspensie samen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet van de resulterende cel in verse BAVA en verdeel gelijkmatig in 3 x T75 kolven met een eindvolume van 12 mL BAVA per kolf.
  9. Als wilt selecteren voor EG getransduceerde met E6 en E7, G418 toevoegen om een eindconcentratie van 200 µg/mL voor twee passages, waarna de getransduceerde EG kan worden bekleed voor infectie of ingevroren in vloeibare stikstof.

3. Infectie van getransduceerde EG met KSHV

  1. op de dag voorafgaand aan de infectie oogst EG door enzymatische spijsvertering met behulp van de commerciële enzymatische dissociatie oplossing zoals hierboven beschreven. Resuspendeer cel pellet in 1 mL BAVA. Gebruik 5 µL van cellen te bereiden een verdunning van 1/10 in Trypan blauw. Tellen van levende cellen met behulp van een hemocytometer en zaad van 2.5 x 10 5 levende cellen in 2 mL zuiver BAVA per putje in 6 goed platen.
  2. Op de dag van de infectie, verwijderen van BAVA wassen van cellen met 3 mL PBS met calcium en magnesium per putje en voeg vervolgens 2 mL EBM.
    Opmerking: Het is essentieel om te gebruiken van EBM in plaats van BAVA tijdens de infectie, zoals de heparine in BAVA binding van virale deeltjes en latere infectie van target EC. remmen zal
  3. Te infecteren cellen met KSHV, voeg van 5 tot 20 µL virus voorraad aan elk putje en swirl plaat te mengen. Mock-geïnfecteerde cellen Voeg een gelijk volume TNE buffer aan elk putje.
  4. Centrifugeer platen bij 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 90 minuten
  5. Als het doel van de studie is het onderzoeken van de vroege gebeurtenissen vereisen een synchrone virale infectie, bijvoorbeeld, vroege gebeurtenissen in DOVO infectie, verwijder de virale entmateriaal op dit punt. Spoel en bijvoeding de cellen met 2 mL verse BAVA. Anders, voeg toe 2 mL BAVA en na een nacht bebroeden culturen.
  6. Cellen met 2 mL BAVA bijvoeding de dag na infectie en dan elke andere dag.
  7. Wanneer cellen ongeveer 90% heuvels, oogsten door enzymatische spijsvertering met behulp van commerciële enzymatische dissociatie oplossing zoals hierboven beschreven, dan bundelen de cellen uit drie putten in een T75, vaststellend van zowel de totale passage-nummer en de passage na infectie.
  8. Uit te breiden mock - en KSHV-besmet EG met 1:3 splitst voor ten minste twee meer passages waarna cellen kunnen worden gebruikt in experimenten of in vloeibare stikstof bevroren.
    Opmerking: Net als bij het splitsen van EG getransduceerde met E6 en E7, onderhoud culturen van mock - en KSHV-geïnfecteerde cellen moeten worden opgesplitst alvorens samenvloeiing (~ 85 tot 90%).

4. bevestiging van de besmetting met KSHV door immunofluorescentie

Opmerking: detectie van de KSHV latency-associated nucleair antigeen (LANA-1/ORF73) biedt een betrouwbare kwantitatieve meting van infectie. Anti-LANA antilichamen zijn verkrijgbare.

  1. De dag vóór de kleuring, putjes van de plaat twee elk met mock - of KSHV-besmet EG op een 24-well plaat op 1 x 10 5 per cellen goed in 1 mL BAVA en na een nacht bebroeden.
  2. Wassen cellen tweemaal met 500 µL van PBS plus calcium en magniseum. Wassen voor 30 s op een rockende platform.
  3. In een zuurkast extern-ventillated, herstellen van cellen met 500 µL van 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Wassen van cellen drie keer met 500 µL van was buffer (0,1% Triton X-100 plus 0,02% geit serum in PBS plus caties).
  5. Cellen met 500 µL van 2% geit serum in was buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur blokkeren.
  6. Wassen van cellen drie keer met 500 µL van was buffer.
  7. Label een goed van mock - of KSHV-besmet EG met 200 µL van primair antilichaam verdund 1:100 in was buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker. Incubeer de resterende twee putten in 200 µL van was buffer alleen.
  8. Wassen van cellen drie keer met 500 µL van was buffer.
  9. Label alle vier putjes met 200 µL van secundair antilichaam verdund 1:100 in was buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker.
  10. Wassen van cellen drie keer met 500 µL van was buffer.
  11. Aan elk putje Breng 20 µL middellange met DAPI en een dekglaasje aan te monteren en te evalueren kleuring met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop.
  12. Bepalen het percentage infecties van KSHV-geïnfecteerde cellen door het aantal LANA-positieve kernen in minstens 200 cellen te tellen. Infectie met recombinant KSHV-Bac16 kan ook worden gevolgd via observatie van culturen voor expressie van GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De morfologie van primaire EG klassiek wordt beschreven als "kasseistrook stone", en deze morfologie is niet gewijzigd door de uitdrukking van het papillomavirus E6 en E7 genen (figuur 1A). Expressie van de E6 en E7 genen alleen er niet toe brengt een getransformeerde fenotype; Dus, cellen zijn gevoelig voor remming contact en zal ophouden verdelen bij het bereiken van de samenvloeiing in cultuur. De cellen zal echter vermenigvuldigen en regrow tot samenkomst op trypsinebehandeling en replating op een lagere dichtheid, waardoor voor het onderhoud van leeftijd - en passage-matched culturen voor gebruik als besturingselementen mock-besmet.

Infectie van E6/E7-getransduceerde EG met KSHV veroorzaakt dramatische morfologische veranderingen in cultuur die doen denken aan het fenotype van de "spindle cel" waargenomen in KS laesies (figuur 1B). Een getransformeerde fenotype wordt ook veroorzaakt na infectie met KSHV, die is manifest gedeeltelijk door verlies van contact remming wanneer cellen gekweekte na samenvloeiing (figuur 1 c) en anchorage-onafhankelijke groei in zachte agar (Figuur 2). Verlies van zowel contact inhibitie en de afhankelijkheid van de extra-cellulaire matrix interacties (ankerplaats) tijdens oncogenese zijn twee van de kenmerken van cellulaire transformatie36. Het is belangrijk op te merken dat primaire EG zijn ook gevoelig voor infectie met KSHV en primaire EG-systemen uiterst waardevol zijn voor het ophelderen van de diverse aspecten van de virus-gastheer interactie, en de gevolgen daarvan. Dergelijke studies zijn goed vertegenwoordigd in de literatuur en diverse voorbeelden worden aangehaald hierin37,38,39,40,41,42,43 ,44.

Immunefluorescentie kleuring toont aan dat de morfologie van de spindel van KSHV-geïnfecteerde cellen geassocieerd met de expressie van de virale eiwitten LANA-1/ORF73 (figuur 3A en 3B, rood wordt). Als de concentratie van virus in voorraden tussen de voorbereidingen variëren zal, de hoeveelheid virus per putje toegevoegd moet worden aangepast, zodat KSHV-besmette culturen bereiken > 90% infectie binnen één of twee passages. Met seriële passage het percentage van de infectie zal benaderen 100% en zal worden gehandhaafd voor de duur van de cultuur (ongeveer 20 passages). Lagere hoeveelheid virus kunnen worden gebruikt als een studie van paracrine invloeden is bestemd of als aangrenzende niet-geïnfecteerde cellen zijn wenselijk als besturingselementen (bijvoorbeeldvoor immunofluorescentie studies waarbij andere proteïnen van belang). Besmette culturen ondersteunen ook uitdrukking van lytische virale eiwitten, maar zoals wordt waargenomen in KS laesies, slechts een minderheid van cellen in cultuur lytische reactivering (figuur 3B, groen) spontaan zal ondergaan. Cellen geïnfecteerd met KSHV-BAC16, die is gecodeerd met GFP, ontwikkelen ook de morfologie van een spindel (Figuur 3 c en 3D). Wanneer KSHV-BAC16 wordt gebruikt, kunnen de virale titers worden verkregen door infecteren van cellen met een geconcentreerde virus serieel verdunde voorraad en het evalueren van cellen voor GFP uitdrukking bij 48 h post-infectie met behulp van stroom cytometry30.

Voor zowel recombinant en WT virus, kunnen virale genoom in voorraad preparaten ook worden gemeten door het zuiveren van DNA van geïnfecteerde cellen gevolgd door PCR kwantificering van KSHV DNA niveaus; Men moet echter niet aannemen dat alle genomen besmettelijke45 zijn. Als de studie van de KSHV lytische cyclus is bedoeld, reactivering van virus kan worden bereikt door stimulering van de EG met inducerende agenten zoals hierboven beschreven voor BCBL-1 cellen, hoewel de efficiëntie van reactivering lagere23 is. De lytische cyclus kan ook worden veroorzaakt door transductie van de EG met de KSHV transactivator proteïne ORF5046. Overeenstemming met bevindingen in andere cel cultuur modellen van KS, spontane expressie zowel chemische inductie van KSHV lytische genen in E6/E7-uiten EG vermindert na verloop van tijd ondanks onderhoud van een stabiele latente infectie11,16 .

Figure 1
Figuur 1: morfologie van mock- en KSHV besmet EC. (A) Mock-geïnfecteerde EG monolayers vertonen de klassieke kasseistrook stenen verschijning door fase contrast vitale microscopie. Zonder het optreden van KSHV genen zal deze cellen worden niet omgezet en daarom niet langer verdelen en vertonen contact remming bij het bereiken van de samenvloeiing in cultuur. (B) KSHV-geïnfecteerde cellen, in tegenstelling, ontwikkelen een langwerpige "spindle cel" morfologie denken aan KS spindel cellen. Dit paneel toont de morfologie van KSHV-geïnfecteerde cellen op dag 5 PI bij het bereiken van de samenvloeiing. (C) In KSHV-geïnfecteerde cellen, uitgebreide veranderingen in host cel genexpressie leiden tot cellulaire transformatie, dat duidelijk wordt wanneer KSHV-geïnfecteerde cellen worden gekweekt zonder passage. Onder dergelijke omstandigheden blijven KSHV-geïnfecteerde cellen prolifererende zelfs na het bereiken van de samenvloeiing leidt tot de ontwikkeling van multi-gelaagde foci van cellen. Dit paneel toont de morfologie van KSHV-geïnfecteerde cellen op dag 14 PI, gekweekt voor 9 dagen na samenkomst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: autonome groei van Anchorage. Niet-getransformeerde cellen ondergaan meestal apoptotic celdood na verlies van contact met een substraat, een proces genaamd anoikis. (A) wanneer E6/E7-getransduceerde mock-geïnfecteerde EG, die niet worden omgezet, zijn geschorst in zachte agar en gekweekte voor twee weken, die ze geen koloniën vormen. (B) KSHV-geïnfecteerde EG, die zijn virus-getransformeerd, resistent zijn tegen anoikis en kolonies in zachte agar zal vormen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: demonstratie van virale eiwituitdrukking. (A) de spindel morfologie blijkt na infectie met KSHV (40 X vergroting). (B) immunefluorescentie kleuring van hetzelfde veld weergegeven in (A) toont aan dat de morfologie van de spindel geassocieerd met expressie van het virale latency-eiwit ORF73 (rood wordt). Geïnfecteerde cellen ondersteuning lytische virale replicatie zo goed, zoals blijkt uit een klein percentage van de cellen, uiting geven aan de virale processivity factor ORF59 (groen). (A en B aangepast ten opzichte van de referentie26.) De spindel morfologie van cellen besmet met KSHV-BAC16-virus (C) is gekoppeld aan de expressie van GFP (D) (20 X vergroting). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Oncogenese is een meerstaps proces dat belangrijke waarborgen binnen een organisme36omzeilt. Zoals KS laesies bestaan langs een spectrum van chronische ontsteking aan ware sarcomen, vereist opheldering van bepaalde pathofysiologische processen gemedieerd door KSHV dat sommige studies worden uitgevoerd in cel cultuur modellen die ondersteuning bieden voor transformatie9. Opgemerkt moet worden dat verlies van contact inhibitie en anchorage-afhankelijke groei, fenotypes indicatieve van cellulaire transformatie, niet gemakkelijk ontwikkelen na de infectie of primaire EG EG vereeuwigd door exogene expressie van telomerase. Daarom, terwijl het in vitro model van KS hier beschreven niet alle aspecten van de communicatie van de tumor KS of gedrag van transplanteren KS cellen recapituleren doet, is het uniek geschikt voor de studie van veranderingen in de expressie van de genen van het host-cel veroorzaakt door infectie met KSHV die bijdragen aan KS tumorvorming.

De eerste gemeld genexpressie profilering studie met behulp van het systeem van de cultuur beschreven hierin de receptor tyrosine kinase c-Kit geïdentificeerd als een bijdrage aan het getransformeerde fenotype van KSHV-geïnfecteerde cellen25. Neerhalen van c-Kit expressie met behulp van siRNA of remming van het c-Kit met signalering een dominante negatieve construct of tyrosine kinase inhibitor STI 571 (Imatinib) bemoeid met het transformerende vermogen van manifest van de KSHV door verlies van foci vorming na langdurig gebruik cultuur van geïnfecteerde cellen. Latere klinische evaluatie van Imatinib heeft aangetoond dat de werkzaamheid van dit medicijn in patiënten met epidemische KS47,-48,49. Andere potentiële doelen van de behandeling ook geconstateerd, met inbegrip van heem oxygenase-126,50, CXCR727, en het beta adrenergic receptoren28, die allemaal een rol in de groei of transformatie van spelen EG in vitro. Bevestiging van deze gene-expressiepatronen in primaire EG, alsmede KS biopsie weefsel bevestigt de fysiologische relevantie van dit systeem en de waarde ervan onderstreept als een pre-klinische model voor KS therapeutics25,26, 51,52,53,,54,55.

Een ander sterk punt van de E6/E7 transductie systeem is dat de uitgebreide levensduur van vereeuwigd in vergelijking met primaire EG maakt het onderhoud op lange termijn van de leeftijd en de passage-matched mock-geïnfecteerde cellen voor vergelijkende evaluatie van de resultaten van KSHV infectie. Het is van cruciaal belang om op te merken dat om te maximaliseren van het aantal passages van EG getransduceerde met E6 en E7 is het essentieel om te splitsen van de culturen vóór het bereiken van de samenvloeiing (~ 85 tot 90%). Bovendien, deze cellen tolereren serumvrij voorwaarden voor langere tijd. Primaire EG snel geprogrammeerde celdood bij groeifactor geldopname ondergaan en daarom niet kunnen worden gekweekt voor lange perioden zonder serum of recombinante groeifactoren56,57. Deze afhankelijkheid maakt autocrine signalering trajecten geïnduceerd door infectie met KSHV moeilijk te identificeren en te bestuderen, zoals vóór volledige transformatie KSHV-geïnfecteerde cellen zal ook ondergaan geprogrammeerde celdood bij groeifactor geldopname (ongepubliceerd Opmerking). De aanwezigheid van de E6 en E7 eiwitten in dit model, echter verhinderen geprogrammeerde celdood na groeifactor terugtrekking en voor langdurige (bijvoorbeeld48 h) cultuur in lage serum of serum gratis middellange25,26 , 28.

KS is een complex en ongebruikelijk ziekte met kenmerken van zowel chronische ontsteking en cellulaire transformatie. De klinische behoefte aan nieuwe therapeutische strategieën is geweldig, en de cel cultuur model hierin beschreven heeft unieke eigenschappen waardoor beoordeling van kandidaat drug targets.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de HD068322 van de K12 (SCM); R01 CA179921 en P51 OD011092 (AVM); en 14PRE20320014 van de Amerika hart Association (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42, (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28, (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5, (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35, (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95, (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1, (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312, (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76, (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78, (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80, (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174, (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375, (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305, (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122, (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74, (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394, (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73, (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65, (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76, (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103, (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65, (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89, (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81, (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6, (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108, (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82, (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86, (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174, (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26, (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95, (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9, (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8, (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1, (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7, (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118, (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179, (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76, (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6, (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78, (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32, (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23, (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22, (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6, (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13, (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76, (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7, (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25, (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273, (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25, (Suppl 2), S149-S157 (2002).
Een <em>In Vitro </em>Model voor het bestuderen van cellulaire transformatie door Kaposi sarcoom Herpesvirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter