Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול הנגרמת על ידי זיהום עם oncogenic וירוס ההרפס-8/KS ההרפס האנושי (HHV-8/KSHV). המודל התרבות תאי אנדותל המתואר כאן הוא לצורכיכם לימוד המנגנון שבאמצעותו KSHV המרות התאים המארחים.

Abstract

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול יוצא דופן המורכבת מתרבים פלך בתאים, הוא שיזם זיהום של תאי אנדותל (EC) עם KSHV, והוא מתפתח לרוב בסביבה של החיסוני. למרות עשורים של מחקר, הטיפול האופטימלי של KS נשאר גרוע מוגדרים, התוצאות הקליניות שלילי במיוחד הגדרות משאב מוגבל. נגעים KS מונעים על ידי אנגיוגנזה פתולוגי, דלקת כרונית, oncogenesis, במבחנה תא תרבות מודלים שונים פותחו כדי לחקור תהליכים אלו. KS נובע תאים הנגועים KSHV ממוצא אנדותל, כך EC-שושלת התאים מספקים המתאים ביותר במבחנה המחליפים למבשר התא כישור. עם זאת, כי EC יש תוחלת חיים מוגבלת במבחנה , כמו המנגנונים oncogenic מועסק על ידי KSHV יעילה פחות מאלה של וירוסים אחרים, tumorigenic, מתקשים להעריך תהליכי טרנספורמציה של ראשי או לכלכלת מונצחים טלומראז לכן, מודל תרבות המבוססת על EC הרומן פותחה שתומך ברצון מטרנספורמציה בעקבות זיהום עם KSHV. חוץ רחמי הביטוי של הגנים E6, E7 מסוג וירוס הפפילומה האנושי 16 מאפשר לתרבות מורחבת של מתאימים לגיל המעבר ואימץ ו- KSHV-נגוע EC ותומך הפיתוח של טרנספורמציה באמת (כלומר tumorigenic) פנוטיפ של תרביות תאים נגועים . מודל זה צייתן ולא מאוד לשחזור של KS הנחתה את הגילוי של כמה חיוני איתות המסלולים עם פוטנציאל גבוה לתרגום לתוך הגדרות קליניים.

Introduction

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול רב נקודתית angioproliferative להשפיע על עורי, הרירית, אתרי הקרביים שמתפתח הנפוץ ביותר בסביבה של דיכוי המערכת החיסונית מתקדמים1. 4 טפסים אפידמיולוגיים תוארו: קלאסי, טופס indolent בדרך כלל משפיע על אנשים מבוגרים של הים התיכון והמזרח התיכון מורשת; iatrogenic, הנובע טיפול עם תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת איברים; מגיפה, סרטן איידס, הגדרת; מהם ייחודיים, טופס שאינו תלוי-HIV נפוץ אצל ילדים באזורים אנדמיים באפריקה. עם כניסתו של משטרי סמים אנטי-retroviral שילוב יעיל לטיפול ב- HIV, KS מגיפה מאובחנת הרבה פחות נפוץ במדינות מתפתחות. עם זאת, טפסים אנדמיים, מגיפה קלינית אגרסיבי נשארים בין הנפוץ ביותר סרטן שאובחנו רבים במדינות אפריקה2,3,4. לכן, זיהוי של תרופות ממוקדות פתוגנזה יעילות לטיפול KS היא עדיפות למחקר.

בהיסטולוגיה, KS נגעים מאופיינים כורוידאלית הנרחבים אך חריג לפיו פלך בתאים ממוצא EC בצורת רשתות כלי דם רציף5. אלה כלי נורמלי ("חרכי כלי הדם") לאפשר extravasation של אריתרוציטים, אשר נותנות נגעים הצבע האופייני שלהם. בנוסף, נגעים לכלול לויקוציטים רבות המאפיינות דלקת כרונית (קרי, לימפוציטים מקרופאגים, תאי פלזמה). רגרסיה של נגעים KS ביצוע שיחזור המערכת החיסונית שתיארנו, רומז כי KS יש תכונות של שניהם hyper-ציבוריות ו סרטניים נכון6,7,8,9.

KS ההרפס (KSHV), סוכן סיבתי של KS, זוהתה בשנת 199410. מאז ואז רבים במבחנה תרבית תאים פותחו מודלים כדי לאפשר פתוגנזה מחקרים, כולל תאים explanted מן הגידול ביופסיה חומר ראשוני או לבטא טלומראז EC נגוע KSHV במבחנה11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. אף אחד הדגמים זמין כעת באופן מלא recapitulates microenvironment הגידול של KS, אבל כולם תרמו ידע בעל ערך להבנתנו pathobiology של KSHV זיהום. שלא כמו אחרים הידועים tumorigenic ההרפס האנושי וירוס אפשטיין בר (EBV), KSHV לא בקלות להפוך תאים בתרבות בעקבות דה נובו זיהום19,20,21, 22. עם זאת, יש כבר להתגבר על מגבלה זו על-ידי transducing הראשית EC אנושי גם מעורב מוצא microvascular או הלימפה E6 ו- E7 גנים של וירוס הפפילומה האנושי 16 לפני זיהום עם KSHV23,24 . הביטוי של אלה oncogenes אקסוגני מגדיל באופן דרמטי את הפוטנציאל להפוך של KSHV במבחנה באופן חלקי על-ידי מתן עוד עיכוב של רטינובלסטומה חלבון ו- p5323,24. שיטה זו של התמרה חושית EC אפשרה מעבדות מרובים כדי לזהות שינויים מרכזיים של המארח ביטוי גנים תא זה הם המושרה על-ידי זיהום KSHV, המופיעים כדי להקל על KS תא הישרדות והתפשטות25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. הפרוטוקולים המפורטים להלן הן פשוטות וברורות מאוד לשחזור, יביא הדור של מתאימים לגיל המעבר EC הנגועים KSHV ופקדים הנגועים ואימץ יכול להיות תרבותי עבור הרבה יותר זמן ראשי תאים והאם לאפשר החקירה של מנגנונים oncogenic מועסק על ידי KSHV. למרות הפרוטוקול כולל שיטה לייצור פראי סוג KSHV מהקו הראשי תפליט לימפומה תא BCBL-1, EC E6/E7-מונצח גם הם רגישים מאוד זיהום עם BACmid רקומביננטי נגזר KSHV-BAC1630. פרוטוקולים עבור הכנת BAC16 מתוארים במקומות אחרים33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל ההליכים המתוארים פרוטוקול זה צריך להתבצע בתנאים BSL-2-

1-KSHV מניות הכנה

  1. TNE להכין מאגר: להמיס מ"ג 292.24 EDTA ddH 2 O להביא עד 225 מ"ל, להתאים את ה-pH 8. להמיס 605.7 מ"ג טריס ddH 2 O, להביא עד 225 מ"ל, להתאים את ה-pH 8. שילוב פתרונות EDTA, טריס, להוסיף 4.38 g NaCl, להתאים את עוצמת הקול הסופי עד 500 מ"ל, לסנן לחטא, ולאחסן ב 4 ° C .
  2. תרבות את KSHV-חיובית, EBV-שלילי תפליט העיקרי לימפומה תא קו BCBL-1 בחממה humidified 37 ° C בתוספת 5% CO 2 ב- RPMI בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- antimicrobials 1 ל 1.2 x 10 6 תאים לכל mL-
  3. כדי לעודד ייצור KSHV, לפצל את תרבויות 1:2 בינונית טרייה להוסיף Phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ריכוז סופי של 20 ng/mL, דגירה תרבויות במשך 5 ימים. כחלופה, יטפל בתאים עם butyrate נתרן (NaB; 0.1 מ מ) במשך 3 ימים לזירוז lytic שכפול ויראלי.
  4. הקציר נגיפים, תחילה centrifuge התרבות supernatant-300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר הצניפה התאים ולהעביר supernatants ל צינורות טריים.
    5. צנטריפוגה
  5. להבהיר עוד יותר את תגובת שיקוע כדי למנוע העברה של פסולת הסלולר, ב 2,500 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
    הערה: כחלופה במהירות גבוהה צנטריפוגה הבהרה של התרבות supernatants, סינון דרך 0.45 סטרילי מיקרומטר מסנן יכול להתבצע. הבחנו ירידה משמעותית כייל נוגדנים באמצעות סינון; לכן, אנחנו באופן שגרתי ביצוע השלב השני צנטריפוגה במקום.
  6. הבא, כיסוי 5 מ של 25% סוכרוז פתרון מאגר TNE עם 30 מ של התרבות מובהר supernatant 6 צינורות ultracentrifuge.
  7. צנטריפוגה מאוזנת צינורות ב 75,000 g x עבור 2 h ב 4 ° C תחת ואקום.
  8. Decant התרבות supernatant, כתם בקצה כל שפופרת להסיר כמה שיותר פתרון תגובת שיקוע וסוכרוז ככל האפשר ולאחר מכן resuspend בגדר וירוס, אשר עשוי לא להיות גלויות, ב- µL 150 מאגר TNE.
  9. בריכה כל resuspended וירוס, מערבבים היטב, ומקפיאים aliquots 25 µL ב-80 מעלות צלזיוס .

2. התמרה חושית של EC E6, E7 וירוס הפפילומה גנים

הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי תרביות רקמה סטנדרטי מבחנות לגידול העיקרי לכלכלת עם זאת, אם צמיחה משביעת רצון של EC מתקבלים ואז השימוש של תרבות מסחרית מבחנות לשקול.

  1. תרבות ראשי האדם עורי microvascular או הלימפה EC ב חממה humidified 37 ° C בתוספת 5% CO 2 ב- EC מדיום הגידול (EGM; מכיל EC הבזליים בינוני [EBM] בתוספת BulletKit EGM-2 [המכיל FBS, הידרוקורטיזון האנושי פיברובלסט גורם גדילה-B, כלי הדם גורם הגדילה EC, פקטורי גדילה דמויי אינסולין-1, חומצה אסקורבית, גורם הגדילה האפיתל אנוש, אנטיביוטיקה, הפארין]) בבקבוקון תרבות תא T75 עד כ 50% הנהרות.
  2. עבור התמרה חושית, תרבות PA317 LXSN 16E6E7 תאים 24 , 35 חממה humidified על 37 ° C פלוס 5% CO 2 ב- DMEM בתוספת 10% FBS ו antimicrobials ב T150 הבקבוק של התרבות התא עד כ- 90% confluent. ואז דגירה בין לילה ב- mL 16 בינוני.
  3. להבהיר את המדיום PA317 על ידי צריך שתוציאו על 300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את EGM EC התרבות התאים וכיסוי 12 מ של המדיום PA317 שקופה ולאחר תקופת דגירה של 4 h.
    הערה: צריך שתוציאו 16 מ"ל של מדיום ממוזגים ב g x 300 לתוצאות 5 דקות בגלולה קומפקטי זה לא מופרעת על ידי הסרת עוקבות זהיר 12 מ של תגובת שיקוע שקופה. עם זאת, אם העברת תאי 16E6E7 PA317 LXSN לתרבויות EC הראשי דאגה (הקו תא אריזה במהירות נגמלים EC), ואז סינון של תגובת שיקוע ממוזגים דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לפני העברת יכול להתבצע.
  5. להחליף 6 מ של המדיום PA317 EGM טריים, דגירה בין לילה.
  6. Refeed EC 12 מ ל EGM טריים דגירה של ה 48 נוסף
  7. תת תרבות EC, הסר בינוני, לשטוף עם 12 מ של PBS ללא קטיונים, ולא להוסיף 3 מיליליטר דיסוציאציה אנזימטי מסחרי פתרון (למשל, TrypLE) מאת ולהעביר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות
  8. תא ההשעיה להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה-g 300 x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend בגדר התא שנוצר ב- EGM טריים, לחלק באופן שווה 3 מבחנות x T75 עם נפח סופי של 12 מ ל EGM לכל הבקבוקון.
  9. כדי לבחור עבור EC transduced עם E6, E7, להוסיף G418 ריכוז הסופי של µg/mL 200 עבור שני קטעים, אחרי אשר transduced EC יכול להיות מצופה זיהום או קפוא חנקן נוזלי.

3. זיהום של Transduced EC עם KSHV

  1. ביום לפני זיהום הקציר EC על ידי עיכול אנזימטי באמצעות הפתרון דיסוציאציה אנזימטי מסחרי כפי שתואר לעיל. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של EGM. השתמש µL 5 תאים כדי להכין לדילול 1/10 ב- Trypan blue. לספור תאים חיים באמצעות hemocytometer ואת הזרעים 2.5 x 10 תאים חיים 5 ב- 2 מ של EGM לכל טוב ב 6 צלחות טוב.
  2. ביום של זיהום, להסיר EGM, לשטוף תאים עם 3 מ"ל של PBS עם סידן ומגנזיום לכל טוב, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל EBM.
    הערה: זה חיוני כדי להשתמש EBM ולא EGM במהלך זיהום, כמו ההפרין ב EGM ימנע קשירה של חלקיקי נגיפי ולדלקת עוקבות של יעד לכלכלת
  3. להדביק תאים עם KSHV, להוסיף 5 עד 20 µL וירוס מלאי כל טוב ו מערבולת הצלחת לערבב. עבור תאים הנגועים ואימץ להוסיף אמצעי שווה מאגר TNE כל טוב.
  4. צנטריפוגה צלחות ב g x 400 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות
  5. אם המטרה של המחקר היא לחקור בתחילת האירועים הדורשים סינכרונית זיהום נגיפי, למשל, בתחילת האירועים דה נובו זיהום, להסיר את inoculum ויראלי בשלב זה. . שטפי וחזרי refeed התאים עם 2 מ"ל EGM טריים. אחרת, להוסיף 2 מ"ל EGM, דגירה תרבויות בין לילה.
  6. Refeed תאים עם 2 מ"ל EGM היום לאחר זיהום, אז בכל יום אחר.
  7. כאשר התאים נמצאים כ 90% confluent, הקציר על ידי עיכול אנזימטי באמצעות פתרון מסחרי דיסוציאציה אנזימטי כמתואר לעיל, ולאחר מכן בריכה התאים משלוש בארות לתוך T75, וציין את המספר הכולל מעבר והן את המעבר לאחר הפגיעה-
  8. הרחב מוק - ו KSHV-נגוע EC פיצולים 1:3 לפחות שני מעברים יותר ובו בזמן תאים שניתן להשתמש בניסויים או קפוא חנקן נוזלי.
    הערה: כמו עם פיצול של EC transduced עם E6, E7, תחזוקה תרבויות ואימץ ו- KSHV-תאים הנגועים צריכים להתחלק לפני שהגיע למפגש (~ 85 עד 90%).

4. זיהום המאשר עם KSHV מאת Immunofluorescence

הערה: זיהוי KSHV השהיה-הקשורים גרעיני אנטיגן (לאנה-1/ORF73) מספק מדד כמותי אמין של זיהום. נוגדנים אנטי-לאנה זמינים מסחרית.

  1. ביום שלפני מכתים, הצלחת שתי בארות אחד עם מעושה או KSHV-נגוע EC על צלחת 24-ובכן-עונה 1 פרק 10 5 תאים לכל טוב ב- 1 מ ל EGM ואני דגירה בין לילה.
    2. µL
  2. תאים לשטוף פעמיים עם 500 של PBS בתוספת סידן, magniseum. כביסה ב-30 s על פלטפורמה נדנדה.
  3. בשכונה fume מבחוץ-ventillated ', לתקן תאים עם 500 µL של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף (0.1% טריטון X-100 בתוספת 0.02% סרום עז PBS בתוספת קטיונים).
  5. לחסום תאים עם 500 µL של 2% נסיוב עז במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.
  7. תווית באר אחת של מעושה או KSHV-נגוע EC עם 200 µL של נוגדן ראשוני מדולל 1:100 במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה. דגירה שתי הבארות הנותרים ב 200 µL מאגר לשטוף רק.
  8. לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.
  9. תווית כל ארבע בארות עם 200 µL נוגדנים משניים מדולל בטחונות במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה.
  10. לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.
  11. אל כל טוב החל µL 20 הגוברת דאפי המכילות בינוני ו- coverslip ולהעריך את מכתים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
  12. לקבוע את הזיהום אחוז של תאים הנגועים KSHV על ידי ספירת מספר גרעינים לאנה-חיוביות בתאים לפחות 200. זיהום עם רקומביננטי KSHV-Bac16 ניתן לנטר גם דרך התבוננות של תרבויות להבעה של GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המורפולוגיה של EC העיקרי מתואר בסגנון קלאסי "חלוק אבן", מורפולוגיה זו אינה משתנה על ידי ביטוי של וירוס הפפילומה E6, E7 גנים (איור 1 א'). הביטוי של הגנים E6, E7 לבד לא לגרום הפנוטיפ טרנספורמציה; לפיכך, התאים רגישים ליצור קשר עם עיכוב, תחדל חלוקת בהגיעם הנהרות בתרבות. התאים אולם להתרבות, ולצמיחה מחודשת אל הנהרות על trypsinization ועל replating על צפיפות נמוכה יותר, המאפשר קיום מתאימים לגיל המעבר תרבויות לשימוש כפקדי הנגועים מעושה.

זיהום של EC E6/E7-transduced עם KSHV גורם שינויים מורפולוגיים דרמטי בתרבות המזכירים פנוטיפ "פלך תא" הנהוגות KS נגעים (איור 1B). הפנוטיפ טרנספורמציה מושרה גם על זיהום עם KSHV, אשר באה לידי ביטוי בין השאר על ידי שיחרור קשר כאשר התאים נמצאים הנהרות שלאחר בתרבית (איור 1C) וצמיחה anchorage תלויית אגר רך (איור 2). אובדן של סימן דיכוי והן את התלות אינטראקציות מטריקס הסלולר במיוחד (מעגן) במהלך oncogenesis הם שני גולת הכותרת של טרנספורמציה הסלולר36. חשוב לשים לב כי EC הראשי גם רגישים לזיהומים עם KSHV, מערכות ראשיות EC היה מאוד יקר עבור שחקרתי מגוון תחומי האינטראקציה וירוס-מארח, ותוצאותיה. מחקרים כאלה הם מייצגים היטב בספרות, מספר דוגמאות מצוטטים בזאת37,38,39,40,41,42,43 ,44.

צביעת immunofluorescent מדגים כי המורפולוגיה פלך של תאים הנגועים KSHV קשורה לביטוי של החלבון הנגיפי לאנה-1/ORF73 (איור 3A ו- 3B, אדום). כמו הריכוז של וירוס במניות משתנים בין ההכנות, צריך ניתן להתאים את עוצמת הקול של וירוס נוסף לכל טוב כך תרבויות הנגועים KSHV להגיע > 90% הזיהום קטעים אחד או שניים. עם המעבר טורי האחוז של זיהום ייגש 100%, יישמר למשך של התרבות (כ 20 מעברי). כמויות נמוכות של וירוס יכול לשמש אם מחקר השפעות paracrine מיועד, או אם תאים סמוכים נגוע הם רצויים כפקדי (למשל, עבור immunofluorescence מחקרים שכללו לחלבונים אחרים עניין). תרבויות נגוע תומכים גם ביטוי של חלבונים נגיפיים lytic, אבל, כפי נצפית בנגעים KS, רק מיעוט של תאים בתרבות יעבור באופן ספונטני lytic הפעלה מחדש (איור 3B, ירוק). תאים נגועים KSHV-BAC16, אשר מתויג עם GFP, גם לפתח מורפולוגיה פלך (3C איור ותלת מימד). כאשר נעשה שימוש KSHV-BAC16, titers ויראלי ניתן להשיג על ידי הדבקת תאים עם מלאי מדולל באופן סדרתי וירוס מרוכז והערכת תאים עבור ביטוי GFP זיהום פוסט 48 שעות באמצעות cytometry זרימה30.

רקומביננטי וגם WT וירוס, הגנום הנגיפי בהכנות מניות גם נמדד על ידי טיהור ה-DNA של תאים נגועים ואחריו PCR כימות של רמות ה-DNA KSHV; עם זאת, אחד אין להניח כי כל הגנום הן זיהומיות45. אם המחקר של מחזור lytic KSHV מיועד, וירוס הפעלה מחדש יכולה להיות מושגת על ידי עירור EC עם גרימת סוכנים כפי שמתואר לעיל עבור תאים BCBL-1, למרות היעילות של הפעלה מחדש הוא נמוך23. מחזור lytic יכולה להיגרם גם על ידי התמרה חושית של הנציבות האירופית עם החלבון transactivator KSHV ORF5046. בקנה אחד עם הממצאים במודלים תרבות אחרים תא של KS, ביטוי ספונטני והן אינדוקציה כימי של KSHV גנים lytic ב- EC E6/E7-הבעת ' ירידות לאורך זמן למרות תחזוקה דלקת סמויה יציב11,16 .

Figure 1
איור 1: מורפולוגיה של מוק - ו -KSHV נגוע לכלכלת (א) בנספח monolayers EC הנגועים ואימץ חלוק קלאסי מראה האבן על-ידי שלב ניגודיות מיקרוסקופ חיוני. ללא הפעולות של KSHV גנים תאים אלה הופכים לא לכן חדל חלוקת, מוצג סימן דיכוי בהגיעם הנהרות בתרבות. תאים הנגועים KSHV (B), לעומת זאת, לפתח מורפולוגיה מוארך "פלך תא" מזכיר KS פלך בתאים. לוח זה מראה את המורפולוגיה של תאים הנגועים KSHV ביום 5 PI בהגיעם הנהרות. תאים הנגועים ב KSHV (C), מקיף שינויים בביטוי הגנים התא המארח להוביל טרנספורמציה הסלולר, אשר הופך בולט כאשר תאים הנגועים KSHV מתורבתים ללא מעבר. בתנאים כאלה, תאים הנגועים KSHV המשך מתרבים אפילו לאחר שהגיע למפגש המובילים להתפתחות של מוקדים מרובת שכבות של תאים. לוח זה מראה את המורפולוגיה של תאים הנגועים KSHV ביום 14 PI, תרבותי עבור זרימה לאחר 9 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: גידול עצמאי Anchorage. תאים untransformed עוברים בדרך כלל מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע בעקבות אובדן קשר עם מצע, תהליך הנקרא anoikis. (א) transduced-E6/E7 כאשר הנגועים ואימץ EC, אשר לא הופכים, הושעו באגר רך, תרבותי במשך שבועיים שהם לא יוצרים מושבות. (B) נגוע KSHV EC, אשר הפך וירוס, הם עמידים בפני anoikis, יהוו מושבות אגר רך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הפגנה של ביטוי חלבון נגיפי. (א) המורפולוגיה פלך ניכרת בעקבות זיהום עם KSHV (40 X הגדלה). צביעת Immunofluorescent (B), של אותו שדה המוצג ב () מדגים כי המורפולוגיה פלך קשורה לביטוי של החלבון השהיה נגיפי ORF73 (אדום). גם, כפי שמתואר על ידי אחוז קטן של תאים המבטאים את pro ויראלי תאים נגועים תמיכה lytic שכפול ויראליcessivity פקטור ORF59 (ירוק). (A ו- B שונה מהפניה26.) המורפולוגיה פלך של תאים נגועים בווירוס KSHV-BAC16 (ג) מזוהה עם ביטוי של GFP (D) (20 X הגדלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oncogenesis הוא תהליך רב שלבי העוקפות אמצעי חשוב בתוך האורגניזם36. כפי KS נגעים קיימים לאורך קשת של דלקת כרונית כדי סרקומות נכון, הבהרה של תהליכים מסוימים הקשורים pathophysiological מתווכת על-ידי KSHV דורש כי מחקרים להתנהל במודלים התרבות תאים התומכים טרנספורמציה9. יצוין כי אובדן קשר עיכוב וצמיחה תלויי-anchorage, פנוטיפים מעידה על שינוי הסלולר, אינם מפתחים בקלות בעקבות זיהום של ראשי EC או EC מונצחים על ידי ביטוי אקסוגני של טלומראז. לכן, בעוד המודל במבחנה של KS המתוארים כאן לא מסכם את הדברים בכל ההיבטים של microenvironment הגידול KS או ההתנהגות של תאים KS explanted, זה לצורכיכם ללמוד לשינויים ביטוי גנים של התא המארח הנגרמת על ידי זיהום עם KSHV שתורמים KS tumorigenesis.

הראשון דיווחו על ביטוי גנים פרופילים המחקר באמצעות מערכת תרבות המתוארים במסמך זה מזוהה קולטן טירוזין קינאז c-Kit בתור כותב פנוטיפ טרנספורמציה של תאים הנגועים KSHV25. להפיל את הביטוי c-Kit באמצעות siRNA או עיכוב של c-Kit איתות באמצעות דומיננטי שלילי לבנות או טירוזין קינאז מעכב STI 571 (Imatinib) הפריע היכולת להפוך של מניפסט KSHV על ידי אובדן של היווצרות foci לאחר שהוארך התרבות של תאים נגועים. הערכה קלינית עוקבות של Imatinib הוכיחה יעילות של תרופה זו בחולים עם מגיפת KS47,48,49. מטרות טיפול אפשריות אחרות גם זוהו, לרבות heme oxygenase-126,50, CXCR727את בטא קולטנים adrenergic28, אשר ממלאים תפקיד צמיחה או טרנספורמציה של EC במבחנה. אישור על דפוסים אלה ביטוי גנים וכן KS ביופסיה רקמות מאשרת את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של מערכת זו, מדגיש את הערך שלו כמודל קליניים עבור KS הרפוי25,26, ראשי EC 51,52,53,54,55.

כוח נוסף של מערכת התמרה חושית E6/E7 הוא אורך החיים מורחב של מונצחים לעומת ראשי EC מאפשרת קיום ארוכת טווח תאים מתאימים מעבר שליטה הנגועים ואימץ להערכה השוואתית של התוצאות של KSHV וגיל זיהום. חשוב לציין כי על מנת למקסם את מספר קטעים של EC transduced עם E6, E7 זה קריטי לפצל תרבויות לפני שהגיע למפגש (~ 85 עד 90%). יתר על כן, תאים אלה לסבול סרום ללא תנאי לתקופות ממושכות של זמן. EC ראשי במהירות עוברים מוות תאי מתוכנת על נסיגה פקטורי גדילה, ולכן לא ניתן בתרבית במשך פרקי זמן ארוכים ללא סרום או גורמי גדילה רקומביננטי56,57. תלות זו גורם autocrine איתות המסלולים הנגרמת על ידי זיהום עם KSHV קשה לזהות וללמוד, כמו לפני שינוי מלא תאים הנגועים KSHV גם עוברות מוות תאי מתוכנת על נסיגה פקטורי גדילה (לא פורסם התצפית). הנוכחות של החלבונים E6, E7 במודל זה, עם זאת, למנוע מוות תאי מתוכנת בעקבות הנסיגה פקטורי גדילה ולאפשר ממושך (למשל, 48 שעות) תרבות נמוכה בסרום או סרום חינם בינונית25,26 , 28.

KS היא מחלה מורכבת ובלתי רגיל עם תכונות של דלקת כרונית וטרנספורמציה הסלולר. הצורך קליני של אסטרטגיות טיפוליות הרומן הגדול, המודל התרבות התא המתוארים בזאת יש מאפיינים ייחודיים לאפשר הערכה של המועמד סמים מטרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. לא-

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921, P51 OD011092 (AVM); פרס 14PRE20320014 של איגוד הלב אמריקה (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

סרטן ביולוגיה גיליון 126 סרקומה קפוסי תפליט העיקרי לימפומה KSHV טרנספורמציה oncogenesis תאי אנדותל
מודל <em>במבחנה </em>עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter