Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kaposi सार्कोमा gerpevirusnoy द्वारा सेलुलर परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Kaposi सार्कोमा (ks) oncogenic वायरस मानव gerpevirusnoy-8/KS gerpevirusnoy (HHV-8/KSHV) के साथ संक्रमण से प्रेरित ट्यूमर है । endothelial सेल संस्कृति मॉडल यहां वर्णित विशिष्ट तंत्र है जिसके द्वारा KSHV मेजबान कोशिकाओं को बदल अध्ययन के लिए अनुकूल है ।

Abstract

Kaposi सार्कोमा (एस) एक असामांय proliferating धुरी कोशिकाओं है कि KSHV के साथ endothelial कोशिकाओं (ईसी) के संक्रमण द्वारा शुरू की है से बना ट्यूमर है, और प्रतिरक्षादमन की स्थापना में सबसे अधिक बार विकसित करता है । अनुसंधान के दशकों के बावजूद, KS के इष्टतम उपचार खराब परिभाषित किया गया है और नैदानिक परिणाम संसाधन सीमित सेटिंग्स में विशेष रूप से प्रतिकूल हैं । KS घावों रोग angiogenesis, जीर्ण सूजन, और oncogenesis द्वारा संचालित कर रहे हैं, और विभिंन इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । KS KSHV से उठता है-endothelial मूल के संक्रमित कोशिकाओं, तो चुनाव आयोग-वंश कोशिकाओं धुरी कोशिका अग्रदूत के इन विट्रो किराए में सबसे उपयुक्त प्रदान करते हैं । हालांकि, क्योंकि चुनाव आयोग एक सीमित इन विट्रो उंर है, और के रूप में oncogenic KSHV द्वारा नियोजित तंत्र अंय tumorigenic वायरस की तुलना में कम कुशल हैं, यह गया है कि प्राथमिक या में परिवर्तन की प्रक्रियाओं का आकलन मुश्किल है टेलोमिरेज-अमर ईसी. इसलिए, एक उपंयास ईसी आधारित संस्कृति मॉडल है कि आसानी से KSHV के साथ संक्रमण के बाद परिवर्तन का समर्थन करता है विकसित किया गया । E6 और मानव papillomavirus प्रकार 16 के E7 जीन की अस्थानिक अभिव्यक्ति आयु की विस्तारित संस्कृति के लिए अनुमति देता है और मार्ग-मिलान नकली और KSHV-संक्रमित चुनाव आयोग और एक सही मायने में तब्दील (यानी, tumorigenic) संक्रमित कोशिका संस्कृतियों में phenotype के विकास का समर्थन करता है . KS के इस परित्याग और अत्यधिक प्रतिलिपि मॉडल नैदानिक सेटिंग्स में अनुवाद के लिए उच्च क्षमता के साथ कई आवश्यक संकेतन रास्ते की खोज में मदद की है ।

Introduction

Kaposi सार्कोमा (एस) एक मल्टी फोकल angioproliferative ट्यूमर को प्रभावित करने वाला अधययन, श्लैष्मिक, और आंत साइटों है कि सबसे अधिक विकसित की सेटिंग में उन्नत प्रतिरक्षा दमन1. चार महामारी विज्ञान के रूपों का वर्णन किया गया है: शास्त्रीय, एक indolent रूप है कि आम तौर पर भूमध्य और मध्य पूर्वी विरासत के पुराने लोगों को प्रभावित करता है; iatrogenic, गुर्दे दवाओं के साथ उपचार के परिणामस्वरूप अंग प्रत्यारोपण के बाद; महामारी, एक एड्स-कैंसर को परिभाषित; और स्थानिकमारी वाले, एक एचआईवी-स्वतंत्र फार्म अफ्रीका में स्थानिकमारी वाले क्षेत्रों में बच्चों में आम । एचआईवी के उपचार के लिए प्रभावी संयोजन विरोधी सिंड्रम दवा परहेजों के आगमन के साथ, महामारी KS बहुत कम सामांयतः विकासशील देशों में निदान है । हालांकि, नैदानिक आक्रामक स्थानिकमारी और महामारी रूपों कई अफ्रीकी देशों में2,3,4में सबसे अधिक निदान कैंसर के बीच रहते हैं । इसलिए, KS के उपचार के लिए प्रभावी रोगजनन-लक्षित दवाओं की पहचान एक शोध प्राथमिकता है ।

Histologically, के एस घावों व्यापक लेकिन असामांय neovascularization जिससे चुनाव आयोग मूल के धुरी कोशिकाओं सतत संवहनी नेटवर्क के रूप में विशेषता है5। ये असामान्य जहाजों ("संवहनी slits") एरिथ्रोसाइट्स के extravasation की अनुमति देते हैं, जो घावों को अपनी विशेषता रंग देते हैं । इसके अतिरिक्त, घावों में कई ल्यूकोसाइट्स है कि जीर्ण सूजन (यानी, लिम्फोसाइटों, मैक्रोफेज, और प्लाज्मा कोशिकाओं) की विशेषता हैं । के ks घावों के प्रतिगमन प्रतिरक्षा पुनर्गठन के बाद वर्णित किया गया है, सुझाव है कि KS दोनों एक हाइपर प्रफलन घाव और एक सच ट्यूमर6,7,8,9की विशेषताएं हैं ।

ks gerpevirusnoy (KSHV), एस के प्रेरणा का एजेंट, १९९४ में पहचाना गया था10। तब से इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में कई रोगजनन अध्ययनों को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया है, ट्यूमर बायोप्सी सामग्री और प्राथमिक या टेलोमिरेज-एक्सप्रेस चुनाव आयोग से explanted कोशिकाओं के साथ संक्रमित KSHV इन विट्रो11 में , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. वर्तमान में उपलब्ध मॉडलों में से कोई भी KS ट्यूमर microenvironment पूरी तरह से recapitulates, लेकिन सभी KSHV संक्रमण के pathobiology की हमारी समझ के लिए बहुमूल्य ज्ञान योगदान दिया है । अंय ज्ञात tumorigenic मानव gerpevirusnoy Epstein-बर्र वायरस (EBV) के विपरीत, KSHV आसानी से संस्कृति में कोशिकाओं को नहीं बदल de नोवो संक्रमण19,20,21, 22. तथापि, इस सीमा या तो मिश्रित microvascular या लसीका E6 और मानव papillomavirus प्रकार से E7 जीन के साथ transducing प्राथमिक मानव चुनाव आयोग द्वारा दूर किया गया है 16 KSHV के साथ संक्रमण से पहले23,24 . इन exogenous oncogenes की अभिव्यक्ति नाटकीय रूप से retinoblastoma प्रोटीन और p5323,24के आगे निषेध प्रदान करके भाग में इन विट्रो में KSHV के बदलने की क्षमता बढ़ जाती है । इस चुनाव आयोग transduction विधि एकाधिक प्रयोगशालाओं की मेजबानी की सेल जीन अभिव्यक्ति है कि KSHV संक्रमण द्वारा प्रेरित कर रहे है में महत्वपूर्ण परिवर्तन की पहचान करने की अनुमति दी गई है और कि एस सेल के अस्तित्व और प्रसार की सुविधा के लिए दिखाई देते है25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , ३२. प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्पष्ट और अत्यधिक प्रतिलिपि हैं, और उंर की पीढ़ी में परिणाम होगा-और मार्ग-मिलान KSHV-संक्रमित चुनाव आयोग और नकली संक्रमित नियंत्रण है कि अब तक प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में लंबे समय के लिए और संस्कृति हो सकता है होगा oncogenic KSHV द्वारा नियोजित तंत्र की जांच के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि प्रोटोकॉल प्राथमिक बहाव लिंफोमा सेल लाइन BCBL से जंगली प्रकार KSHV के उत्पादन के लिए एक विधि शामिल है-1, E6/E7-अमर चुनाव आयोग भी अत्यधिक संयोजक BACmid व्युत्पंन KSHV-BAC16 के साथ संक्रमण की संभावना है30। BAC16 की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल कहीं३३,३४बताए गए हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी कार्यविधियां बीएसएल-2 शर्तों के अंतर्गत निष्पादित की जानी चाहिए ।

< p class = "jove_title" > 1. KSHV शेयर वडा

  1. TNE बफर तैयार: भंग २९२.२४ मिलीग्राम EDTA ddH 2 ओ में, २२५ मिलीलीटर लाने के लिए, और 8 पीएच को समायोजित करें । भंग ६०५.७ ddH में मिलीग्राम Tris 2 हे, लाने के लिए २२५ मिलीलीटर, और समायोजित करने के लिए पीएच 8. EDTA और Tris समाधान संयोजित करें, ४.३८ g NaCl जोड़ें, अंतिम वॉल्यूम को ५०० mL, फ़िल्टर बंध्याकरण, और स्टोर को 4 & #176 पर समायोजित करें; C .
  2. संस्कृति KSHV-सकारात्मक, EBV-नकारात्मक प्राथमिक बहाव लिंफोमा सेल लाइन BCBL-1 एक humidified मशीन में ३७ & #176; सी प्लस 5% सह में 2 10% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (RPMI) और रोगाणुरोधी करने के लिए लगभग 1 को १.२ x 10 6 कोशिकाओं प्रति मि.
  3. KSHV उत्पादन प्रेरित करने के लिए, ताजा माध्यम के साथ विभाजित संस्कृतियों 1:2 और जोड़ने Phorbol 12-Myristate 13-एसीटेट (पमा) के लिए 20 एनजी के एक अंतिम एकाग्रता/एमएल और 5 दिनों के लिए मशीन । एक विकल्प के रूप में, lytic वायरल प्रतिकृति प्रेरित करने के लिए 3 दिनों के लिए सोडियम butyrate (नब; ०.१ मिमी) के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
  4. वायरल कणों फसल के लिए, पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर संस्कृति supernatant के लिए कोशिकाओं को गोली और ताजा ट्यूबों के लिए supernatants स्थानांतरण ।
  5. आगे supernatant ताकि सेलुलर मलबे के हस्तांतरण से बचने के लिए स्पष्ट करने के लिए, २,५०० पर 10 मिनट के लिए x g केंद्रापसारक 4 & #176; C.
    नोट: संस्कृति supernatants के स्पष्टीकरण के लिए उच्च गति केंद्रापसारक के लिए एक विकल्प के रूप में, निस्पंदन के माध्यम से एक बाँझ ०.४५ & #181; m फ़िल्टर किया जा सकता है । हम निस्पंदन का उपयोग कर titer में एक महत्वपूर्ण ड्रॉप मनाया है; इसलिए, हम नियमित रूप से दूसरा केंद्रापसारक कदम के बजाय प्रदर्शन ।
  6. अगला, 6 ultracentrifuge ट्यूबों में स्पष्ट संस्कृति supernatant के लगभग 30 मिलीलीटर के साथ TNE बफर में 25% सुक्रोज समाधान के 5 मिलीलीटर ओवरले ।
  7. केंद्रापसारक संतुलित ट्यूबों पर ७५,००० x g के लिए 2 ज पर 4 & #176; C के अंतर्गत निर्वात.
  8. खिचड़ी भाषा संस्कृति supernatant और दाग प्रत्येक ट्यूब के रिम के रूप में ज्यादा supernatant और सुक्रोज समाधान को दूर करने के लिए, तो वायरस गोली, जो दिखाई नहीं हो सकता है reसस्पेंड, १५० में & #181; TNE बफर के एल.
  9. पूल सभी reसस्पैंड वायरस, अच्छी तरह से मिश्रण, और फ्रीज 25 & #181; L aliquots at-८० & #176; ग .
< p class = "jove_title" > 2. E6 और E7 Papillomavirus जीन के साथ EC की Transduction < p class = "jove_content" > नोट: हम नियमित रूप से बढ़ते प्राथमिक चुनाव आयोग के लिए मानक ऊतक संस्कृति कुप्पी का उपयोग करें । हालांकि, अगर चुनाव आयोग के असंतोषजनक वृद्धि प्राप्त कर रहे है तो वाणिज्यिक संस्कृति कुप्पी के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए ।

  1. संस्कृति प्राथमिक मानव चमड़े का microvascular या लसीका चुनाव आयोग में एक humidified मशीन में ३७ & #176; सी प्लस 5% कं 2 ईसी ग्रोथ मीडियम में (ईजीएम; चुनाव आयोग बेसल मध्यम [इबीएम] ईजीएम के साथ पूरक-2 BulletKit [युक्त FBS, hydrocortisone, मानव fibroblast विकास फैक्टर-बी, संवहनी ईसी वृद्धि कारक, इंसुलिन जैसे विकास फैक्टर-1, ascorbic एसिड, मानव उपकला विकास कारक, एंटीबायोटिक दवाओं, और हेपरिन]) में एक T75 सेल संस्कृति कुप्पी के लिए लगभग ५०% संगम.
  2. For transduction, culture PA317 LXSN 16E6E7 cells < सुप class = "xref" > 24 , < सुप वर्ग = "xref" > 35 एक humidified मशीनी में ३७ & #176; सी प्लस 5% कं 2 में DMEM 10% के साथ पूरक FBS और एक में रोगाणुरोधी T150 सेल संस्कृति कुप्पी जब तक वे लगभग ९०% धाराप्रवाह हैं । तो मध्यम के 16 मिलीलीटर में रात भर गर्मी ।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा PA317 माध्यम स्पष्ट ।
    4. ईसी कल्चर से ईजीएम को हटा
  4. और 4 ज.
    के लिए स्पष्ट PA317 माध्यम और मशीन के 12 मिलीलीटर के साथ ओवरले कोशिकाओं नोट: ३०० एक्स जी में वातानुकूलित मध्यम के 16 मिलीलीटर एक कॉंपैक्ट गोली में 5 मिनट के परिणाम के लिए है कि स्पष्ट supernatant के 12 मिलीलीटर के सावधान बाद हटाने से परेशान नहीं है केंद्रापसारक । हालांकि, अगर प्राथमिक चुनाव आयोग संस्कृतियों के लिए PA317 LXSN 16E6E7 कोशिकाओं का स्थानांतरण एक चिंता का विषय है (पैकेजिंग सेल लाइन जल्दी ईसी तबदील हो जाएगा), तो एक ०.४५ & #181 के माध्यम से वातानुकूलित supernatant के निस्पंदन; एम फ़िल्टर स्थानांतरण से पहले किया जा सकता है ।
  5. ताजा ईजीएम और रात भर गर्मी के साथ PA317 माध्यम से 6 मिलीलीटर की जगह ।
  6. 12 मिलीलीटर ताजा ईजीएम के साथ चुनाव आयोग को फिर से खिलाने और एक आगे ४८ ज.
    7. उप-संस्कृति चुनाव आयोग को
  7. , मध्यम निकालें और cations के बिना पंजाब के 12 मिलीलीटर से धो लें, और वाणिज्यिक एंजाइमी पृथक्करण समाधान ( उदा , TrypLE) के 3 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ & #176; C के लिए 3 min.
  8. स्थानांतरण सेल एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए निलंबन और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । ताजा ईजीएम में परिणामी सेल गोली reसस्पेंड और कुप्पी प्रति 12 मिलीलीटर ईजीएम की एक अंतिम मात्रा के साथ 3 एक्स T75 कुप्पी में समान रूप से विभाजित ।
    9. E6 और E7 के साथ चुनाव आयोग transduced के लिए
  9. का चयन करने के लिए, २०० & #181 के अंतिम एकाग्रता में G418 जोड़ने के लिए, दो मार्ग के लिए जी/एमएल, जिसके बाद transduced ईसी संक्रमण के लिए या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए के लिए चढ़ाया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 3. KSHV

  1. के साथ Transduced ईसी के संक्रमण से पहले दिन पर संक्रमण फसल चुनाव आयोग द्वारा एंजाइमी के रूप में ऊपर वर्णित वाणिज्यिक एंजाइमी पृथक्करण समाधान का उपयोग कर पाचन । ईजीएम के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । Trypan blue में 1/10 कमजोरियां तैयार करने के लिए कक्षों के 5 & #181; L का उपयोग करें । एक hemocytometer और बीज २.५ x 10 5 रहते कोशिकाओं का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं की गणना ईजीएम के 2 मिलीलीटर में अच्छी तरह से 6 प्लेटों में ।
  2. संक्रमण के दिन, ईजीएम और धो कोशिकाओं कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ ठीक है, और फिर 2 मिलीलीटर इबीएम जोड़ें ।
    नोट: यह संक्रमण के दौरान ईजीएम से इबीएम बजाय उपयोग करने के लिए आवश्यक है, ईजीएम में हेपरिन के रूप में वायरल कणों के बंधन को रोकना होगा और लक्ष्य चुनाव आयोग के बाद संक्रमण.
  3. KSHV के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, जोड़ने के लिए 5 से 20 & #181; एल वायरस स्टॉक प्रत्येक अच्छी तरह से और भंवर थाली मिश्रण करने के लिए । नकली संक्रमित कोशिकाओं के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से TNE बफर के एक बराबर मात्रा में जोड़ें ।
  4. ४०० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्लेट्स केंद्रापसारक और फिर ३७ & #176 पर प्लेटें मशीन, ९० मिनट के लिए सी ।
  5. अगर अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक तुल्यकालिक वायरल संक्रमण की आवश्यकता होती है जल्दी घटनाओं की जांच करने के लिए है, जैसे , de नोवो संक्रमण में जल्दी घटनाओं, इस बिंदु पर वायरल इनोक्युलम निकालें । कुल्ला और 2 मिलीलीटर ताजा ईजीएम के साथ कोशिकाओं को फिर से खिला । अंयथा, 2 मिलीलीटर ईजीएम और गर्मी संस्कृतियों रात भर जोड़ें ।
  6. 2 मिलीलीटर ईजीएम के साथ कोशिकाओं को फिर से खिलाना संक्रमण के बाद दिन और फिर हर दूसरे दिन.
  7. जब कोशिकाओं लगभग ९०% धाराप्रवाह कर रहे हैं, एंजाइमी पाचन द्वारा फसल वाणिज्यिक एंजाइमी पृथक्करण समाधान का उपयोग कर के रूप में ऊपर वर्णित है, तो पूल तीन कुओं से एक T75 में कोशिकाओं, दोनों कुल गद्यांश संख्या और बीतने टिप्पण संक्रमण के बाद.
  8. का विस्तार करें नकली और KSHV-संक्रमित चुनाव आयोग के साथ 1:3 विभाजनों के लिए जो समय कोशिकाओं में प्रयोग किया जा सकता है या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए कम से कम दो मार्ग के लिए ।
    नोट: E6 और E7 के साथ चुनाव आयोग transduced के बंटवारे के साथ के रूप में, नकली के रखरखाव संस्कृतियों-और KSHV-संक्रमित कोशिकाओं संगम तक पहुंचने से पहले विभाजित किया जाना चाहिए (~ ८५ ९०%) ।
< p class = "jove_title" > 4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा KSHV के साथ पुष्टि संक्रमण

< p class = "jove_content" > नोट: KSHV विलंबता-संबद्ध परमाणु प्रतिजन का पता लगाना (LANA-1/ORF73) संक्रमण का एक विश्वसनीय मात्रात्मक माप प्रदान करता है । विरोधी LANA एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।

  1. दिन पहले धुंधला करने के लिए, थाली दो कुओं नकली के साथ प्रत्येक-या KSHV-संक्रमित एक 24 पर अच्छी तरह से थाली पर चुनाव आयोग 1 x 10 5 में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं 1 मिलीलीटर ईजीएम और गर्मी में रात भर ।
  2. धो कोशिकाओं के साथ दो बार ५०० & #181; पंजाब प्लस कैल्शियम और magniseum के एल. एक कमाल मंच पर 30 एस के लिए धो लें ।
    3. एक बाह्य-वेंटिलेटेड धुएं डाकू में
  3. , ५०० & #181 के साथ फिक्स कोशिकाओं, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के एल ।
  4. वॉश सेल ५०० के साथ तीन बार & #181; वॉश बफ़र के एल (०.१% ट्राइटन प्लस cations में ०.०२% बकरी सीरम).
  5. ब्लॉक सेल with ५०० & #181; 2% बकरी सीरम के एल धोने बफर में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
  6. धो कोशिकाओं के साथ तीन बार ५०० & #181; धो के एल बफर.
  7. लेबल एक अच्छी तरह से नकली-या KSHV-संक्रमित ईसी २०० & #181 के साथ; प्राथमिक एंटीबॉडी का L पतला 1:100 धोने बफर में 30 मिनट के लिए एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर । २०० में शेष दो कुओं की मशीन & #181; वॉश बफ़र केवल के एल
  8. धो कोशिकाओं के साथ तीन बार ५०० & #181; धो के एल बफर.
  9. लैबल के सभी चार कुओं को २०० & #181 के साथ ठोंक कर माध्यमिक एंटीबॉडी के एल 1:100 वॉश बफर में 30 मिनट के लिए एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर पतला ।
  10. धो कोशिकाओं के साथ तीन बार ५०० & #181; धो के एल बफर.
  11. के लिए एक अच्छी तरह से लागू 20 & #181; DAPI युक्त मध्यम और एक coverslip और एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग दाग का मूल्यांकन के एल ।
  12. कम २०० कोशिकाओं में LANA-पॉजिटिव नाभिक की संख्या की गणना करके KSHV-संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत संक्रमण का निर्धारण करते हैं. संयोजक KSHV के साथ संक्रमण-Bac16 भी GFP की अभिव्यक्ति के लिए संस्कृतियों के अवलोकन के माध्यम से निगरानी की जा सकती है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्राथमिक चुनाव आयोग की आकृति विज्ञान क्लासिक "पक्की स्टोन" के रूप में वर्णित है, और इस आकृति विज्ञान papillomavirus E6 और E7 जीन की अभिव्यक्ति द्वारा बदल नहीं है (चित्र 1a) । E6 और E7 जीन की अभिव्यक्ति अकेले एक तब्दील phenotype प्रेरित नहीं करता है; इस प्रकार, कोशिकाओं को निषेध संपर्क करने के लिए अतिसंवेदनशील होते है और संस्कृति में संगम तक पहुंचने पर विभाजित संघर्ष करेंगे । कोशिकाओं को हालांकि पैदा और trypsinization पर संगम को फिर से विकसित करने और एक कम घनत्व पर चढ़ाना होगा, उंर के रखरखाव के लिए अनुमति-और मार्ग-नकली संक्रमित नियंत्रण के रूप में प्रयोग के लिए संस्कृतियों मिलान ।

KSHV के साथ E6/E7-transduced ईसी का संक्रमण का कारण बनता है कि संस्कृति में नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन की याद ताजा कर रहे है "धुरी सेल" के KS घावों में मनाया phenotype (चित्र 1b) । एक तब्दील phenotype भी KSHV के साथ संक्रमण पर प्रेरित है, जो संपर्क निषेध के नुकसान से भाग में प्रकट होता है जब कोशिकाओं को संस्कृति के बाद संगम (चित्रा 1C) और शीतल आगार में anchorage-स्वतंत्र विकास (चित्रा 2) । दोनों संपर्क निषेध की हानि और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स बातचीत (anchorage) पर निर्भरता oncogenesis के दौरान सेलुलर परिवर्तन३६की पहचान के दो हैं । यह ध्यान दें कि प्राथमिक चुनाव आयोग भी KSHV और प्राथमिक चुनाव आयोग प्रणालियों के साथ संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील है महत्वपूर्ण है elucidating वायरस के विभिंन पहलुओं-मेजबान बातचीत के लिए बहुत मूल्यवान है, और उसके परिणाम है । इस तरह के अध्ययन साहित्य में अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं और कई उदाहरणों के साथ उद्धृत कर रहे हैं स्पेसिफिकेशंस३७,३८,३९,४०,४१,४२,४३ ,४४.

Immunofluorescent धुंधला दर्शाता है कि KSHV-संक्रमित कोशिकाओं की धुरी आकृति विज्ञान वायरल प्रोटीन LANA की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है-1/ORF73 (चित्रा 3 और 4 बी, लाल). के रूप में शेयरों में वायरस की एकाग्रता तैयारियों के बीच भिन्न होगा, वायरस की मात्रा के प्रति अच्छी तरह से समायोजित किया जाना चाहिए ताकि KSHV-संक्रमित संस्कृतियों तक पहुँचने & #62; एक या दो मार्ग के भीतर ९०% संक्रमण. सीरियल बीतने के साथ संक्रमण का प्रतिशत १००% दृष्टिकोण होगा और संस्कृति की अवधि के लिए बनाए रखा जाएगा (लगभग 20 मार्ग) । वायरस की कम मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर paracrine प्रभाव का एक अध्ययन करना है, या यदि आसंन संक्रमित कोशिकाओं के नियंत्रण के रूप में वांछनीय है (जैसे, इम्यूनोफ्लोरेसेंस हित के अंय प्रोटीन को शामिल अध्ययन के लिए) । संक्रमित संस्कृतियों भी lytic वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति का समर्थन लेकिन, के रूप में एस घावों में मनाया जाता है, केवल संस्कृति में कोशिकाओं के एक अल्पसंख्यक अनायास lytic पुनर्क्रियाशीलता से गुजरना होगा (चित्र बी, हरा) । KSHV-BAC16, जो GFP के साथ टैग की जाती है के साथ संक्रमित कोशिकाओं को भी एक धुरी आकृति विज्ञान (चित्रा 3 सी और 3 डी) का विकास । जब KSHV-BAC16 प्रयोग किया जाता है, वायरल titers एक प्रश्नपत्र पतला केंद्रित वायरस स्टॉक के साथ कोशिकाओं को संक्रमित द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और ४८ पर GFP अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं का मूल्यांकन एच पोस्ट संक्रमण का उपयोग कर प्रवाह cytometry30।

दोनों संयोजक और WT वायरस के लिए, स्टॉक की तैयारी में वायरल जीनोम भी KSHV डीएनए के स्तर की पीसीआर ठहराव के बाद संक्रमित कोशिकाओं से डीएनए शुद्ध द्वारा मापा जा सकता है; हालांकि, एक नहीं मान लेना चाहिए कि सभी जीनोम संक्रामक है४५। यदि KSHV lytic चक्र के अध्ययन करना है, वायरस पुनः सक्रियण उत्प्रेरण एजेंटों के साथ BCBL-1 कोशिकाओं के लिए ऊपर वर्णित के रूप में चुनाव आयोग उत्तेजक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि पुनर्सक्रियण की क्षमता कम है23। lytic चक्र भी KSHV transactivator प्रोटीन ORF50४६के साथ चुनाव आयोग के transduction द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । KS के अंय सेल संस्कृति मॉडल में निष्कर्षों के अनुरूप, दोनों सहज अभिव्यक्ति और E6 में KSHV lytic जीन की रासायनिक प्रेरण/E7-एक्सप्रेस चुनाव आयोग एक स्थिर अव्यक्त संक्रमण के रखरखाव के बावजूद समय के साथ कम हो जाती है11,16 .

Figure 1
चित्रा 1: नकली और KSHV संक्रमित ईसी की आकृति विज्ञान (क) नकली संक्रमित चुनाव आयोग monolayers चरण विपरीत महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोप द्वारा क्लासिक पक्की स्टोन उपस्थिति प्रदर्शन । KSHV जीन की कार्रवाई के बिना इन कोशिकाओं में तब्दील नहीं कर रहे है और इसलिए विभाजित संघर्ष और संस्कृति में संगम तक पहुंचने पर संपर्क निषेध प्रदर्शन करेंगे । (ख) KSHV-संक्रमित कोशिकाओं, इसके विपरीत, एक लंबी "धुरी सेल" KS धुरी कोशिकाओं की याद ताजा आकृति विज्ञान का विकास । इस पैनल KSHV-संक्रमित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिन में 5 PI संगम तक पहुँचने पर दिखाता है. (ग) में KSHV-संक्रमित कोशिकाओं, सेलुलर परिवर्तन करने के लिए मेजबान सेल जीन अभिव्यक्ति नेतृत्व में व्यापक परिवर्तन, जो स्पष्ट हो जाता है जब KSHV-संक्रमित कोशिकाओं को पारित किए बिना संस्कृति रहे हैं । ऐसी स्थितियों के तहत, KSHV-संक्रमित कोशिकाओं proliferating कोशिकाओं के बहु स्तरित घावों के विकास के लिए अग्रणी संगम तक पहुँचने के बाद भी जारी है । यह पैनल KSHV-संक्रमित कोशिकाओं के दिन 14 PI में आकृति विज्ञान, 9 दिनों के बाद संगम के लिए संस्कृति से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Anchorage स्वतंत्र विकास । unअपोप्तोटिकd कोशिकाओं को आम तौर पर एक सब्सट्रेट, anoikis नामक प्रक्रिया के साथ संपर्क की हानि के बाद कोशिका मौत से गुजरना । (क) जब E6/E7-transduced नकली संक्रमित चुनाव आयोग, जो तब्दील नहीं कर रहे हैं, नरम आगर में निलंबित कर दिया और दो सप्ताह वे कालोनियों फार्म नहीं है के लिए प्रसंस्कृत कर रहे हैं । (ख) KSHV-संक्रमित चुनाव आयोग, जो वायरस बदल रहे हैं, anoikis के लिए प्रतिरोधी रहे हैं और नरम आगर में कालोनियों के रूप में होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन । (क) धुरी आकृति विज्ञान KSHV (40X इज़ाफ़ा) के साथ निम्नलिखित संक्रमण स्पष्ट है. (B) में दर्शाए गए समान फ़ील्ड के Immunofluorescent धुंधलान (A) दर्शाता है कि धुरी आकृति विज्ञान वायरल विलंबता प्रोटीन ORF73 (लाल) की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है । संक्रमित कोशिकाओं lytic वायरल प्रतिकृति के रूप में अच्छी तरह से समर्थन, के रूप में वायरल समर्थक व्यक्त कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत द्वारा प्रदर्शनcessivity कारक ORF59 (हरा) । (A और B संदर्भ से संशोधित26.) KSHV-BAC16 वायरस (C) से संक्रमित कोशिकाओं की धुरी आकृति विज्ञान GFP (D) (20X आवर्धन) की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oncogenesis एक multistep प्रक्रिया है कि एक जीव के भीतर महत्वपूर्ण सुरक्षा उपायों को दरकिनार है३६। के रूप में एस घावों सच sarcomas को पुरानी सूजन के स्पेक्ट्रम के साथ मौजूद है, कुछ pathophysiological KSHV द्वारा मध्यस्थता प्रक्रियाओं के elucidation की आवश्यकता है कि कुछ अध्ययनों सेल संस्कृति मॉडल में आयोजित किया है कि परिवर्तन का समर्थन9। यह संपर्क निषेध और anchorage निर्भर विकास, सेलुलर परिवर्तन का संकेत phenotypes की हानि, तत्काल प्राथमिक चुनाव आयोग या टेलोमिरेज की exogenous अभिव्यक्ति द्वारा अमर चुनाव आयोग के निंनलिखित संक्रमण का विकास नहीं है कि ध्यान दिया जाना चाहिए । इसलिए, जबकि ks के इन विट्रो मॉडल यहां वर्णित के ks ट्यूमर microenvironment या explanted के एस कोशिकाओं के व्यवहार के सभी पहलुओं दोहराऊंगा नहीं है, यह विशिष्ट मेजबान सेल जीन के साथ संक्रमण से प्रेरित अभिव्यक्ति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है KSHV कि KS tumorigenesis में योगदान करते हैं ।

पहली रिपोर्ट जीन अभिव्यक्ति की संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर अध्ययन के साथ साथ वर्णित रिसेप्टर tyrosine कळेनासे सी किट KSHV-संक्रमित कोशिकाओं के रूपांतरित phenotype के लिए एक योगदानकर्ता के रूप में पहचान की25। सी के नीचे दस्तक-किट अभिव्यक्ति सिरना या सी के निषेध का उपयोग किट एक प्रमुख नकारात्मक का निर्माण या tyrosine कळेनासे अवरोध करनेवाला STI ५७१ (Imatinib) के बाद लंबे समय तक घावों के गठन के नुकसान से KSHV प्रकट की क्षमता बदलने के साथ दखल का उपयोग कर सिग्नलिंग संक्रमित कोशिकाओं की संस्कृति । Imatinib के बाद नैदानिक मूल्यांकन महामारी KS४७,४८,४९के साथ रोगियों में इस दवा की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है । अंय संभावित उपचार लक्ष्य भी पहचान की गई है, षयवस्तु oxygenase सहित-126,५०, CXCR727, और बीटा एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स28, जिनमें से सभी के विकास या परिवर्तन में एक भूमिका निभा विट्रो में EC. प्राथमिक चुनाव आयोग में इन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एस बायोप्सी ऊतक इस प्रणाली के शारीरिक प्रासंगिकता की पुष्टि और एक पूर्व के रूप में अपने मूल्य रेखांकित करता है ks चिकित्सकीय के लिए नैदानिक मॉडल25,26, ५१,५२,५३,५४,५५.

E6/E7 transduction प्रणाली की एक और ताकत है कि प्राथमिक चुनाव आयोग की तुलना में अमर के विस्तारित जीवन काल की उंर और मार्ग के दीर्घकालिक रखरखाव में सक्षम बनाता है-मिलान नकली संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं KSHV के परिणामों के तुलनात्मक मूल्यांकन के लिए संक्रमण. यह ध्यान दें कि आदेश में E6 और E7 के साथ चुनाव आयोग transduced के मार्ग की संख्या को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है यह संगम तक पहुंचने से पहले विभाजित संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है (~ ८५ ९०%) । इसके अलावा, इन कोशिकाओं को समय की विस्तारित अवधि के लिए सीरम मुक्त शर्तों को बर्दाश्त । प्राथमिक चुनाव आयोग तेजी से विकास कारक वापसी पर क्रमादेशित सेल मौत से गुजरना और इसलिए सीरम या संयोजक विकास कारकों के बिना लंबे समय के लिए नहीं किया जा सकता है५६,५७। इस निर्भरता autocrine संकेत KSHV के साथ संक्रमण से प्रेरित रास्ते की पहचान और अध्ययन करने के लिए मुश्किल है, के रूप में पूर्ण परिवर्तन KSHV-संक्रमित कोशिकाओं को भी विकास कारक वापसी पर क्रमादेशित सेल मौत से गुजरना होगा (अप्रकाशित अवलोकन). इस मॉडल में E6 और E7 प्रोटीन की उपस्थिति, तथापि, विकास कारक वापसी के बाद क्रमादेशित सेल मौत को रोकने और लंबे समय तक (जैसे, ४८ ज) संस्कृति में कम सीरम या सीरम मुक्त मध्यम25,26 के लिए अनुमति दें , 28.

KS दोनों पुरानी सूजन और सेलुलर परिवर्तन की सुविधाओं के साथ एक जटिल और असामान्य बीमारी है । उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए नैदानिक की जरूरत है महान है, और सेल संस्कृति मॉडल यहां वर्णित अद्वितीय गुण है कि उंमीदवार दवा लक्ष्य के आकलन की अनुमति है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई.

Acknowledgments

यह काम K12 HD068322 (SCM) द्वारा समर्थित था; R01 CA179921 तथा P51 OD011092 (एवीएम); और अमेरिका हार्ट एसोसिएशन (एसबी) से पुरस्कार 14PRE20320014 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

कैंसर बायोलॉजी इश्यू १२६ Kaposi सार्कोमा प्राइमरी बहाव लिंफोमा KSHV परिवर्तन oncogenesis endothelial सेल
Kaposi सार्कोमा gerpevirusnoy द्वारा सेलुलर परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक इन <em>विट्रो </em>मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter