Summary
Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.
Abstract
Kaposi 육 종 (KS) KSHV, 내 피 세포 (EC)의 감염에 의해 시작 되 고 면역 억제의 설정에서 가장 자주 개발 확산 스핀 들 세포의 구성 된 특이 한 종양 이다. 연구의 십 년간에 불구 하 고 KS의 최적의 치료 남아 가난 하 게 정의 하 고 임상 결과 리소스 제한 설정에 특히 유리한 되지 않습니다. KS 병 변은 병 적인 신생, 만성 염증 및 발암에 의해 구동 됩니다 하 고 다양 한 생체 외에서 세포 문화 모델 이러한 프로세스 연구 개발 되었습니다. 그래서 EC 계보 세포 제공 스핀 들 세포 선구자의 가장 적합 한 생체 외에서 서로게이트 KS 내 피 기원, KSHV에 감염 된 세포에서 발생 합니다. 그러나, EC 수명이 제한 된 생체 외에서 때문에 그리고 KSHV에 의해 고용 되어 종양 메커니즘은 tumorigenic 다른 바이러스의 그들 보다, 그것은 어려운 되었습니다에서 변환의 과정을 평가 하기 위해 또는 telomerase 불후 적 따라서, 소설 EC 기반 문화 모델 쉽게 변환 KSHV 감염 다음을 지 원하는 개발 되었다. 인간 papillomavirus 유형 16의 E6 및 E7 유전자의 소성 식 확장된 문화의 나이 및 통로 일치 모의 및 KSHV-감염 된 EC에 대 한 허용 하 고 진정으로 변환의 개발을 지원 합니다 (즉, tumorigenic) 표현 형에 감염 된 세포 배양 . KS의 세공 및 높은 재현성이 모델 임상 설정으로 번역에 대 한 높은 잠재력을 가진 몇 가지 필수적인 신호 통로의 발견을 촉진 했다.
Introduction
Kaposi 육 종 (KS)은 고급 면역 억제1의 설정에서 가장 일반적으로 발전 하는 다중 초점 angioproliferative 종양, 점 막, 피부 및 내장 사이트에 영향을 미치는. 4 개의 역학 양식 설명: 클래식, 일반적으로 지중해와 중동 유산;의 노인 들에 영향을 미치는 나태 한 형태 의원 성, 장기 이식; 다음 면역 억제 약물과 치료 결과 전염병, 에이즈-정의 암; 그리고 발병, 아프리카에서 풍토 성 지역에서 아이 들에 있는 일반적인 HIV 독립적인 형태. 에이즈의 치료에 대 한 효과적인 조합 방지 retroviral 약물 regimens의 도래와 함께 전염병 KS 훨씬 덜 일반적으로 개발 도상국에서 진단 이다. 그러나, 임상 적극적인 지방 병 및 전염병 양식 많은 아프리카 국가2,,34진단된 암 중 가장 일반적으로 남아 있습니다. 따라서, KS의 치료에 대 한 효과적인 병 인 대상 약물의 식별은 연구 우선권 이다.
조직학, EC 근원의 스핀 들 세포 불연속 혈관 네트워크5를 형성 하는 의하여 광범위 한 하지만 비정상적인 neovascularization KS 병 변 특징 이다. 이러한 비정상적인 혈관 ("혈관 슬릿") 그들의 독특한 색깔 장애를 주는 적혈구의 넘쳐 흐름을 수 있습니다. 또한, 병 변 수많은 백혈구 (림프 톨, 대 식 세포, 및 플라스마 세포) 만성 염증의 특성을 포함 합니다. KS 병 변 면역 재구성 다음의 회귀, KS 하이퍼 증식 병 변 및 진정한 종양6,,78,9의 기능을가지고 제안 설명 하고있다.
KS herpesvirus (KSHV), KS의 원인이 되는 대리인 199410에서 확인 되었다. 그때 많은 체 외에서 세포 배양 모델 개발 되었습니다 이후 병 인 연구를 활성화 하려면 셀을 포함 하 여 explanted 종양 생 검 재료와 기본에서 또는 telomerase를 표현 EC 감염 KSHV 생체 외에서11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. 현재 사용 가능한 모델의 아무도 완벽 하 게 KS 종양 microenvironment이 하지만 모든 KSHV 감염의 pathobiology의 우리의 이해에 귀중 한 지식을 공헌 했다. 다른 알려진된 tumorigenic 인간 herpesvirus 엡 스타인-바 바이러스 (EBV), 달리 KSHV 않습니다 하지 쉽게 변형 문화 드 노 보 감염19,20,21, 다음에 셀 그러나 22., microvascular 또는 림프는 E6 혼합의 기본 인간의 EC를 시험 하 여이 한계를 극복 하 고 인간 유 두 종에서 E7 유전자 입력 KSHV23,24 감염 전에 16 . 이러한 외 인 oncogenes의 표현은 극적으로 retinoblastoma 단백질 및 p5323,24의 저해를 추가 제공 하 여 일부에 KSHV에서 생체 외에서 의 변형 잠재력을 증가 한다. 이 EC 변환 방법은 키 변경 호스트를 식별 하기 위해 여러 실험실 세포 유전자 발현에 KSHV 감염에 의해 유도 된다 고 KS 세포 생존과 확산25,26 촉진을 나타나는 수 있다 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 여기에 설명 된 프로토콜 간단 하 고 매우 재현, 그리고 나이 고 통과 일치 KSHV 감염 EC 및 모의 감염 컨트롤까지 1 차 셀 이상 경작 될 수 것입니다 생성 귀 착될 것 이다 종양 메커니즘 KSHV에 의해 고용의 수사에 대 한 허용. 프로토콜 기본 유출 림프 종 세포 선 BCBL-1, E6/E7 불후 EC에서에서 KSHV에 매우 취약도 야생 타입의 생산을 위한 메서드가 포함 되어 있지만 감염 재조합 BACmid KSHV BAC1630파생. BAC16의 준비에 대 한 프로토콜은 설명 되어33,34.
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Protocol
참고: BSL-2 조건 하에서이 프로토콜에서 설명 하는 모든 절차를 수행 합니다.
1. KSHV 재고 준비
- 준비 TNE 버퍼: ddH 2 O 292.24 mg EDTA를 해산, 225 mL를 가져오고 pH 8에 조정. DdH 2 O 605.7 mg Tris를 녹이, 225 mL을 고 pH 8에 조정. EDTA와 트리 스 솔루션을 결합, 4.38 g NaCl을 추가, 500 mL를 최종 볼륨을 조정, 필터링, 소독 및 4 ° C .에서 저장
- 문화 KSHV 긍정, 5% CO 2 RPMI 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 약 1 제 보충에 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 EBV 부정적인 기본 유출 림프 종 셀 선 BCBL-1 mL 당 10 6 셀 x 1.2.
- KSHV 생산을 유도 하기 위해 신선한 매체와 문화 1:2 분할 및 20 ng/mL의 최종 농도에 Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 (PMA)을 추가 하 고 5 일에 대 한 문화를 품 어. 대신, 나트륨 낙 산 염 (NaB, 0.1 m m) 용균성 바이러스 성 복제를 유도 하기 위해 3 일에 대 한 세포 치료.
- 바이러스 성 입자를 수확, 먼저 작은 셀을 신선한 튜브 supernatants 전송 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 표면에 뜨는 문화 원심. 더 명확히 세포질 파편의 전송을 피하기 상쾌한
- 4에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 ° c.
참고:로 명확한 문화 supernatants의 여과 살 균 0.45 μ m 필터를 수행할 수 있습니다 통해 고속 원심 분리에 대안. 우리는 여과;를 사용 하 여 titer에 상당한 드롭 관찰 따라서, 우리가 일상적으로 수행 두 번째 원심 분리 단계 대신. - 다음, 6 ultracentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 명확히 문화의 약 30 mL와 TNE 버퍼에서 25% 자당 해결책의 5 mL을 오버레이.
- 원심 분리기 튜브 진공에서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 75000 x g에서 균형.
- 문화 표면에 뜨는 가만히 따르다, 가능한 만큼 상쾌한 및 자당 솔루션을 제거 하려면 각 튜브의 오 점 그리고 TNE 버퍼의 150 µ L에 표시 되지 않을 수 있습니다 바이러스 펠 릿 resuspend.
- 수영장 모든 resuspended 바이러스, 잘, 그리고 동결-80 ° C .에서 25 µ L aliquots
2. E 6와 E7 유 두 종 바이러스 유전자 EC의 변환
참고: 우리는 일상적으로 기본 적 성장을 위한 표준 조직 배양 플라스 크를 사용 그러나, EC의 불만족 성장을 가져온 경우 다음 상업 문화 플라스 크를 사용 하 여 고려해 야 합니다.
- 문화 기본 인간의 피부 microvascular 또는 림프 EC 5% 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 CO 2 EC 성장 매체에서 (EGM; EC 기저 매체 [EBM] EGM-2 BulletKit [FBS, 포함 된 보충을 포함 날린, 인간 섬유 아 세포 성장 인자-B, 혈관 EC 성장 인자, 인슐린 같은 성장 인자-1, 아 스 코르 빈 산, 인간 상피 성장 인자, 항생제, 및 헤 파 린]) 약 50% 합류 하 T75 셀 문화 플라스 크에.
- 변환, 문화 PA317 LXSN 16E6E7 세포 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 24 , 35 플러스 5% CO 2 DMEM 10 %FBS에 제 보충에 T150 셀 문화 플라스 크 들은 약 90% 합칠 때까지. 다음 매체의 16 mL에서 밤새 품 어.
- Centrifuging 300 x g 실 온에서 5 분에 의해 PA317 매체를 명확히.
- 명확히 PA317 매체의 12 mL와 EC 문화와 오버레이 셀에서는 EGM를 제거 하 고 4 헤에 대 한 품 어
참고: Centrifuging 16 mL 5 분 결과 명확히 상쾌한의 12 mL의 주의 후속 제거에 의해 방해 하지 소형 펠 릿에 대 한 300 x g에서 조절된 하는 매체의. 그러나, 필요한 경우 기본 EC 문화 PA317 LXSN 16E6E7 셀의 전송 (포장 셀 라인은 신속 하 게 자라 다 EC), 다음 전송 되기 전에 0.45 μ m 필터를 통해 바른된 상쾌한의 여과 수행할 수 있습니다. - 밤새 품 어 고 신선한 EGM PA317 매체의 6 mL.
- Refeed EC 12 mL와 함께 신선한 EGM 추가 48 헤 알을 품고 고
- EC, 하위 문화 매체를 제거 없이 양이온, PBS의 12 mL로 씻어 여 상업 효소 분리 솔루션 (예를 들어, TrypLE)의 3 개 mL를 추가 그리고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어
- 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심. 결과 셀 펠 릿 신선한 EGM에서 resuspend와 3 x T75 플라스 플라스 크 당 12 mL EGM의 최종 볼륨을 균등 하 게 나눌.
- E6 및 E7 불리고 EC에 대 한 선택, 두 구절, 후 transduced EC 수 있습니다 감염에 대 한 도금 또는 액체 질소에서 냉동에 대 한 200 µ g/mL의 최종 농도에 G418 추가.
3. KSHV로 불리고 EC의 감염
- 감염 전날에 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 EC 수확. EGM의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 셀의 5 µ L를 사용 하 여 준비 Trypan 블루에서 1/10 희석. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀 및 씨앗 10 5 라이브 셀 6 잘 플레이트에 잘 당 EGM의 2 mL x 2.5.
- 감염의 날, EGM 제거 잘, 당 3 mL PBS의 칼슘과 마그네슘을 가진 세포를 씻어 고 다음 추가 2 mL EBM.
참고: 그것은 필수적 이다 감염, 동안 EGM 보다 EBM을 사용 하도록 EGM에서 헤 파 린을 바이러스 성 입자의 바인딩 및 대상 적의 후속 감염 억제 - KSHV, 세포를 감염 시킬 각 음을 5 ~ 20 µ L 바이러스 주식을 추가 하 고 소용돌이를 섞어 접시. 모의 감염 된 세포 각 잘 하는 같은 TNE 버퍼 양의 추가.
- 실 온에서 30 분 400 x g에서 격판덮개 원심 고 90 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어
- 연구의 목표는 조사 초기 이벤트 동기 바이러스 감염, 예를 들면에 드 노 보 감염 초기 이벤트를 요구 하는 경우이 시점에서 바이러스 inoculum을 제거 합니다. 린스 및 2 mL와 함께 셀 refeed 신선한 EGM. 그렇지 않으면, 2 mL EGM 추가 하 고 밤새 문화를 품 어.
- 감염 후 다음 매일 2 mL EGM 셀 하루 refeed.
- 셀은 약 90% 합칠 때 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 수확 후 총 통과 번호와 통로 지적 T75에 3 개의 우물에서 셀 풀 감염 된 후.
- 모의 및 KSHV-감염 된 EC 어느 시간에 세포 실험에 사용 하거나 수 액체 질소에서 냉동 두 개 이상의 더 많은 구절에 대 한 1:3 분할으로 확장.
참고: e 6와 E7 불리고 EC의 분할와 마찬가지로 모의 KSHV 감염 세포의 유지 보수 문화 분할 해야 합류 (85 ~ 90%)에 도달 하기 전에.
4. 면역 형광에 의해 KSHV 감염 확인
참고: KSHV 대기 시간 관련 핵 항 (라-1/ORF73)의 감염의 신뢰할 수 있는 양적 측정을 제공 합니다. 안티-라 나 항 체는 상용.
- 얼룩, 전날 플레이트 두 웰 스와 모의 또는 KSHV-감염 된 EC 1 x 10 5에서 24-잘 접시에 각각 당 세포 1 mL EGM에서에서 잘 하 고 밤새 품 어.
- 세척 셀 두 번 500 µ L PBS 플러스 칼슘과 magniseum의. 30에 대 한 세척 락 플랫폼에 s.
- 외부 ventillated 연기 후드, 실 온에서 15 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 세포 수정.
- 셀 워시 버퍼 (0.1% 트라이 톤 X-100 플러스 PBS 플러스 양이온에 0.02% 염소 혈 청)의 500 µ L로 세 번 세척.
- 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 2% 염소 혈 청의 500 µ L로 세포를 차단.
- 셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.
- 라벨의 모의 또는 KSHV-감염 된 200 µ L의 1 차적인 항 체와 EC 1시 10분 희석 한 잘로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에 0. 워시 버퍼만의 200 µ L에서 나머지 두 개의 우물을 품 어.
- 셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.
- 로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 이차 항 체 희석 1: 100의 200 µ L로 모든 4 개의 우물을 라벨.
- 셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.
- 각 잘 하려면 중간 포함 DAPI를 탑재 하는 coverslip 20 µ L을 적용 하 고 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩을 평가.
- 적어도 200 셀에서 라 나 긍정적인 핵의 수를 계산 하 여 KSHV에 감염 된 세포의 백분율 감염을 확인 합니다. 재조합 KSHV Bac16 또한 GFP의 표현 위한 문화의 관찰을 통해 감시 될 수 있다 감염.
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Representative Results
기본 EC의 형태는 고전적인 "자갈 돌"로 설명 하 고이 형태는 유 두 종 바이러스 E6, E7 유전자 (그림 1A)의 표현에 의해 수정 되지 않습니다. 혼자 E6 및 E7 유전자의 표현; 변형 된 표현 형을 유도 하지 않습니다. 따라서, 셀 문의 억제에 취약 하 고 문화에 합류에 도달 시 분할 하는 것을 중단 됩니다. 그러나 셀 증식 하 고 합류 trypsinization와 낮은 밀도, 모의 감염 컨트롤 사용을 위한 연령 및 통행 일치 문화의 유지 보수에 대 한 허용에 replating을 regrow.
KSHV와 E6/E7 불리고 EC의 감염 KS 병 변 (그림 1B)에 "스핀 들 세포" 표현 형의 연상은 문화에 극적인 형태 변화를 발생 합니다. 변형 된 형도는 매니페스트 부분에 접촉 금지의 손실에 의해 셀 부드러운 천 (그림 2)에서 경작된 후 합류 (그림 1C)와 앵커리지에 관계 없이 성장 때 KSHV, 감염 시 유발 됩니다. 접촉 금지 및 발암 중 엑스트라 세포 매트릭스 상호 작용 (앵커리지)에 대 한 의존도 두 세포 변환36의 특징 중. 그것은 주 EC 또한 KSHV 감염에 취약 하며, 주 EC 시스템 elucidating 바이러스-호스트 상호 작용 및 그 결과의 다양 한 측면에 대 한 매우 귀중 한 되었습니다 해야 합니다. 이러한 연구는 문학에서 잘 표현 하 고 몇 가지 예제는 여기 인용37,38,39,40,,4142,43 ,44.
Immunofluorescent 얼룩 KSHV에 감염 된 세포의 스핀 들 형태는 라 나-1/ORF73 (그림 3A와 3B, 빨간색) 바이러스 성 단백질의 식이와 관련 된 방법을 보여 줍니다. KSHV 감염 된 문화 도달 되도록 잘 당 추가 하는 바이러스의 볼륨을 조정 한다 주식에 바이러스의 농도 준비 사이 다 것입니다, > 하나 또는 두 개의 구절 내에서 90% 감염. 직렬 통로와 감염의 비율 100% 접근 것 이다 하 고 문화 (약 20 구절) 동안 유지 됩니다. Paracrine 영향의 연구, 의도 또는 인접 한 감염 되지 않은 세포는 컨트롤 (예를 들어, 면역 형광 검사 연구 관심사의 다른 단백질을 포함)로 서 필요한 경우 바이러스의 낮은 금액을 사용할 수 있습니다. 감염 된 문화 또한 용균성 바이러스 성 단백질의 표현을 지원 하지만, KS 병 변에서 관찰은, 셀 문화에만 소수의 저절로 용균성 재 (그림 3B, 녹색)를 받게 될 것 이다. KSHV-BAC16, GFP와 태그는, 감염 한 세포는 또한 스핀 들 형태 (그림 3C 와 3D) 개발. KSHV-BAC16을 사용 하면 순차적으로 희석 집중된 바이러스 재고와 세포를 감염 하 고 흐름 cytometry30을 사용 하 여 48 시간 게시물 감염에 GFP 식에 대 한 셀을 평가 하 여 바이러스 titers는 얻을 수 있습니다.
재조합 및 WT 바이러스에 대 한 재고 준비에 바이러스 성 게놈 수 있습니다. 또한 KSHV DNA 수준; 부 량 PCR 뒤 감염 된 세포에서 DNA를 정화 하 여 측정할 수 그러나, 하나는 모든 게놈 전염 성45가정 하지 한다. KSHV 용균성 사이클의 경우, 바이러스 재 활성화에 의해 달성 될 수 있다 재 활성화의 효율성은 낮은23BCBL-1 셀, 위에서 설명한 대로 에이전트 유도와 EC를 자극. 용균성 주기 또한 KSHV transactivator 단백질 ORF5046EC의 변환에 의해 유도 될 수 있다. KS, 자연 스러운 표현과는 안정적인 잠재성 감염11,16의 유지 보수에도 불구 하 고 시간이 지남에 E6/E7 표현 EC 감소 KSHV 용균성 유전자의 화학 유도의 다른 세포 문화 모델 결과와 일치 .
그림 1: 모의-의 형태 및 KSHV 감염 적 중요 한 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 (A) 모의 감염 EC monolayers 전시 클래식 자갈 돌 모양입니다. KSHV 유전자의 행동 없이 이러한 셀 변환 되지 않습니다 및 따라서 분할 중단 되며 전시 문화에 합류에 도달 접촉 금지. (B) KSHV에 감염 된 세포, 반면, KS 스핀 들 세포의 연상 길쭉한 "스핀 들 세포" 형태를 개발합니다. 이 패널 5 일에 KSHV에 감염 된 세포의 형태를 보여줍니다 PI 합류에 도달. (C)에 KSHV에 감염 된 세포, 호스트 세포 유전자 발현에 광범위 한 변화 KSHV 감염 세포 통로 없이 교양 쌓이면 세포 변환 이어질. 이러한 조건 하에서 KSHV 감염 세포 확산 도달 셀의 다층된 foci의 개발을 선도 하는 합류 후에 계속. 두이 일 14에 KSHV에 감염 된 세포의 형태를 보여줍니다 PI, 9 일 포스트 합류에 대 한 교양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 앵커리지 독립적인 성장. 현상은 세포는 일반적으로 기판, anoikis 라는 프로세스와 접촉의 손실 다음 apoptotic 세포 죽음을 받 다. (A) 때 E6/E7 불리고 모의 감염, EC는 변환 되지 않습니다, 부드러운 천에 식민지를 형성 하지 않는다 그들은 2 주 동안 경작. (B) KSHV 감염 EC는 바이러스 변형, anoikis에 고 소프트 한 천에서 식민지를 형성할 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 바이러스 성 단백질 식의 데모. (A) 스핀 들 형태학 KSHV 감염 다음 분명 하다 (40 X 확대). (B) Immunofluorescent (A)에 표시 된 같은 필드의 얼룩에 스핀 들 형태는 표현의 바이러스 대기 시간 단백질 ORF73 (레드)와 관련 된 하는 방법을 보여 줍니다. 감염 된 세포 뿐만 아니라, 바이러스 프로 표현 하는 세포의 작은 백분율에 의해 증명 용균성 바이러스 성 복제를 지원cessivity 요소 (녹색) ORF59입니다. (A와 B 참조26에서 수정) KSHV BAC16 바이러스 (C)에 감염 된 세포의 스핀 들 형태학은 식 GFP (D)의 연관 (20 배 확대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
발암 circumvents36는 유기 체 내에서 중요 한 보호 하는 다단계 프로세스입니다. KS 병 변 진정한 sarcomas에 만성 염증의 스펙트럼을 따라 존재, KSHV에 의해 중재 특정 pathophysiological 프로세스의 변환9를 지 원하는 셀 문화 모델에 몇 가지 연구를 실시 해야 합니다. 그것은 접촉 금지 및 앵커리지 종속 성장, 고기 세포 변화의 지표로 쉽게 개발 하지 않습니다 주목 해야한다 기본 EC 또는 EC telomerase의 외 인 식으로 불후의 감염 다음. 따라서, 여기에 설명 된 KS의 생체 외에서 모델 KS 종양 microenvironment의 모든 측면을 하거나 explanted KS 셀의 동작 정리 하지 않습니다, 하는 동안 그것은 감염에 의해 유도 된 호스트 세포 유전자 발현에 변화를 공부 하 고 적합 KS tumorigenesis 기여할 KSHV
첫 번째 유전자 발현 연구 여기 설명 된 문화 시스템을 사용 하 여 프로 파일링 KSHV 감염 세포25의 변형 된 표현 형에 참여자로 수용 체 티로신 키 니 아 제 c-키트를 확인 했다. SiRNA를 사용 하 여 c-키트 표현의 허물고 또는 c-키트는 지배적인 부정적인 구문 또는 티로신 키 니 아 제 억제 물 STI 571 (Imatinib)를 사용 하 여 신호 억제 KSHV 매니페스트의 변형 능력 foci 형성 연장 후의 손실에 의해 방해 감염 된 세포의 문화입니다. Imatinib의 후속 임상 평가 전염병 KS47,,4849를 가진 환자에서이 약의 효능을 입증 했다. 다른 잠재적인 치료 표적도 확인 되었습니다, heme oxygenase-126,50, CXCR727, 그리고 베타 아드레날린 수용 체28, 모두의 성장 또는 변화에 있는 역할을 포함 하 여 EC 생체 외에서. 이러한 유전자 표현 패턴 기본 EC 뿐만 KS 생 검 조직이이 시스템의 생리 적인 관련성을 확인 하 고 KS 치료제25,26, 전 임상 모델의 값을 밑줄에 확인 51,,5253,54,55.
E6/E7 변환 시스템의 또 다른 힘은 그의 확장 된 수명 불후 주 EC 활성화에 비해 연령과 KSHV의 결과의 비교 평가 위한 모의 감염 제어 통과 일치 하는 셀의 장기적인 유지 관리 감염입니다. E 6와 E7 합류 (85 ~ 90%)에 도달 하기 전에 문화를 분할 하는 것이 중요 불리고 EC의 통행의 수를 최대화 하려면 유의 중요 하다. 또한, 이러한 세포 시간의 연장된 기간에 대 한 혈 청 무료 조건을 용납. 기본 EC 급속 하 게 성장 인자 철수 시 프로그램 된 세포 죽음을 받아야 하며 따라서 수 없습니다 교양 혈 청 또는 재조합 성장 요인56,57없이 오랜 기간 동안. 이 의존은 autocrine 신호 경로 전체 변환 전에 KSHV 감염 세포 또한 성장 인자 철수 (미 출판 시 프로그램 된 세포 죽음을 받게 될 것 이다로 파악 하 고 공부 하 고, 어려운 KSHV 감염에 의해 유도 된 관측)입니다. 그러나,이 모델에서 E6 및 E7 단백질의 존재 성장 인자 철수 다음 프로그램 된 세포 죽음을 방지 하 고 장기 (예를 들어, 48 h)에 대 한 허용 낮은 혈 청 또는 혈 청 무료 중간25,26 문화 , 28.
KS는 만성 염증 및 세포 변환의 기능으로 복잡 하 고 특이 한 질병 이다. 새로운 치료 전략에 대 한 임상 필요 훌륭합니다, 그리고 여기에 설명 된 셀 문화 모델 속성이 고유한 약 대상 후보자의 평가 허용 하는.
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Disclosures
없음입니다.
Acknowledgments
이 작품은 지원 K12 HD068322 (SCM)에 의해; R01 CA179921 및 P51 OD011092 (AVM); 그리고 수상 14PRE20320014 미국 심장 협회 (SB)에서.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BCBL-1 cells | NIH AIDS Reagent Program | 3233 | |
PA317 cells | ATCC | CRL-2203 | |
Neonatal dermal microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2505 | |
EBM-2 Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
anti-KSHV LANA/ORF 73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
TrypLETMExpress, no phenol red | ThermoFisher | 12604013 | |
RPMI | |||
DMEM | |||
PBS with calcium and magnesium |
References
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