Højt gennemløb, realtid, Dual-udlæsning Test af Intracellulær antimikrobielle aktivitet og eukaryote celle cytotoksicitet

Abstract

Traditionelle foranstaltninger af intracellulær antimikrobiel aktivitet og eukaryote celle cytotoksicitet stole på endpoint analyser. Sådanne endpoint assays kræver adskillige yderligere eksperimentelle trin før udlæsning, såsom cellelysis, kolonidannende enhed bestemmelse, eller tilføjelse reagens. Når der udføres tusindvis af assays, for eksempel under high-throughput screening, downstream indsats, der kræves for disse typer assays er betydelig. Derfor, for at lette high-throughput antimikrobielle opdagelse har vi udviklet et real-time assay til samtidig identificere inhibitorer af intracellulær bakterievækst og vurdere eukaryot celle cytotoksicitet. Specifikt blev påvisning i realtid intracellulær bakterievækst aktiveret ved at mærke bakterielle screening stammer med enten en bakteriel lux operon (1 ^st generation assay) eller fluorescerende protein reportere (2 ^nd generation, ortogonal assay). En ikke-toksisk, cellemembran-impermeabel, nukleinsyrebindende farvestofblev også tilsat under den første infektion af makrofager. Disse farvestoffer er udelukket fra levedygtige celler. Men ikke-levedygtige værtsceller mister membranintegritet tillader ind- og fluorescerende mærkning af kerne-DNA (deoxyribonucleinsyre). Især DNA binding er forbundet med en stor stigning i fluorescerende kvantumudbytte, der giver en løsning baseret udlæsning af værtens celledød. Vi har anvendt denne kombinerede assay til at udføre en høj-throughput skærm i mikroplade-format, og for at vurdere intracellulære vækst og cytotoksicitet ved mikroskopi. Især kan antimikrobielle stoffer demonstrere synergi, hvor den kombinerede virkning af to eller flere antimikrobielle midler, når de anvendes sammen, er større end når den anvendes særskilt. Test for in vitro-synergi mod intracellulære patogener er normalt en uhyre opgave som kombinatoriske permutationer af antibiotika ved forskellige koncentrationer skal vurderes. Vi fandt imidlertid, at vores real-time analyse kombineret med automatiseret, digital dispensering teknologi permitted Facile synergi testning. Ved hjælp af disse fremgangsmåder, kunne vi systematisk overskue virkning af et stort antal antimikrobielle stoffer alene og i kombination imod det intracellulære patogen, Legionella pneumophila.

Introduction

Patogener, der vokser eller tager ophold midlertidigt i intracellulære rum er vanskelige at terapeutisk udrydde. Obligat eller relativt obligate intracellulære patogener som Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, og Mycobacterium spp. ofte kræver langvarig kurser af antimikrobiel terapi for kur, der kan variere fra måned til endda år. Endvidere kan ekstracellulære patogener forbigående besætte intracellulære nicher og på den måde slippe efter normale forløb af antimikrobiel behandling og senere dukke at starte nye runder af ondartet infektion. Staphylococcus aureus ¹ og uropatogene Enterobacteriaceae ^2,3 infektioner er to mere anerkendt eksempler. Derfor er en grundlæggende opdagelse af lægemidler mål er at identificere hidtil ukendte antimikrobielle midler, som trænger ind i intracellulære rum. Optimal behandling til hurtigt udryddeintracellulære organismer og forebygge udviklingen af ​​resistens gennem sub-hæmmende antimikrobielle eksponering er særligt ønskelig.

Til dette formål har vi udviklet en high-throughput screening teknologi til at identificere intracellulære-penetrant antimikrobielle målrettet mod intracellulær vækst af modellen patogen, Legionella pneumophila. ⁴ Tidligere kliniske observationer tyder på, at standard antimikrobiel resistensbestemmelse ikke præcist forudsige in vivo terapeutisk virkning mod denne organisme. ⁵ Konkret var det, fordi de store klasser af antimikrobielle stoffer såsom p-lactamer og aminoglykosider, selvom meget effektiv mod axenisk vokset Legionella, ikke i tilstrækkelig grad trænge ind i intracellulære rum, hvor Legionella bosat. ^5,6 Senere beviser, at der teknisk mere komplekse intracellulære vækstassays effektivt forudsagt klinisk virkning. ⁷

Derfor har vi udviklet teknologi til tidstro bestemmelse af intracellulær bakteriel vækst. ⁶ Dette blev opnået ved anvendelse af en bakteriestamme modificeret ved integrering af enten en bakteriel luciferase operon ⁸ (første generation assay tidligere beskrevet) ⁴ eller fluorescerende protein ⁹ reportere (anden generation, ortogonal assay, der er beskrevet her) i det bakterielle kromosom. På denne måde, luminescerende eller fluorescerende signal giver et surrogat, real-time udlæsning af bakteriel nummer.

Men disse attributter ikke løse en større confounder i intracellulær infection assays, off-target effekter på værtsceller. Især død værtscellen ifølge sagens natur begrænser intracellulær vækst og fører til falsk positiv identifikation af antimikrobiel virkning. Som mange forbindelser i screeningsprogrammer biblioteker er eukaryote celle giftige, sådanne falske positiver ville overvælde sande antimikrobielle stoffer, hvilket nødvendiggør et stort antal opfølgning, endpoint cytotoksicitetsassays til opløsning.

Det var således af stor interesse for at kunne vurdere eukaryote celle levedygtighed og intracellulær vækst på samme tid. Især en egenskab af ikke-levedygtige eukaryote celler er tabet af cellemembranens integritet. Prober, der tester permeabiliteten af ​​cellemembranen kan derfor anvendes til at vurdere cellernes levedygtighed. Vi har tidligere karakteriseret evnen hos en række putativt cellemembran-impermeabel, fluorescerende, DNA-bindende farvestoffer til at få adgang til og plette nukleare DNA af døde celler. ⁴ Ved bindende nukleare DNA, disse farvestoffer vise en stor stigning i quantum fluorescerende udbytte resulterer i øget signal over baggrund løsning fluorescens. Som sådan er disse farvestoffer tilvejebragt en kvantitativ udlæsning af eukaryot celledød. ⁴ Især fandt vi, at flere var ikke-toksiske selv ved langvarig co-inkubering med J774 makrofager. Når det tilsættes under den indledende infektion, forudsat de en real-time, fluorescerende udlæsning af eukaryot celledød, der kan måles ved en mikroplade fluorimeter eller observeres mikroskopisk.

Derfor, ved at kombinere anvendelsen af ​​en bakteriel reporter og ikke-toksiske, membran-impermeabel, DNA-bindende farvestoffer, var vi i stand til at udvikle en enkel, ikke-destruktiv, real-time assay til at måle både bakteriel belastning og eukaryot celle cytotoksicitet samtidigt. Dette assay har tilladt os at screene i 384-brønds pladeformat ~ 10.000 kendte bioactives herunder ~ 250 antimikrobielle stoffer og> 240.000 små molekyler med funktionelt karakteriseret aktivitet for evnen til at inhibere intracellulær vækst afLegionella pneumophila, mens på samme tid at generere eukaryote celle cytotoksicitetsdata for hver forbindelse. ⁶ Vores analyse af kendte antimikrobielle stoffer mod intracellulær vækst af Legionella var den mest omfattende udforskning af denne type til dato. ⁶

Baseret på effektiviteten af ​​vores assayformat vi også efterfølgende undersøgt de potentielt synergistiske virkninger af kendte antibiotika, når de anvendes i kombination. En af de mest almindelige synergieffekter test, den såkaldte skakbræt assay standardmæssigt udføres ved at vurdere kombinatoriske virkninger af to-fold seriefortyndinger af to eller flere antimikrobielle midler. ¹⁰ I disse assays er synergi defineret ved observation af større virkning, når to eller flere antimikrobielle midler anvendes sammen end summen af virkningerne af hver anvendt særskilt. Af note, hidtil kun fokuseret og selektiv synergi test blev udført mod intracellulær Legionella pneumophila

For at lette synergi test, gjorde vi brug af vores real-time intracellulær vækst / eukaryote cytotoksicitet assay i kombination med automatiseret digital dispensering teknologi ^6. Denne automatisering tilladt os at dispensere serielle fortyndinger af forbindelser opløst i DMSO eller vandig opløsning alene eller i kombination i 384-brønds format. ¹¹ Desuden vil en sådan robust håndtering teknologi flydende tilladt os at nemt udføre højere opløsning, kvadratroden-of-to (snarere end standard, lavere opløsning, en fordobling) udvanding kombinationer for at opnå højere niveauer af specificitet i vores to-dimensionelle, skakternet synergi analyse. Denne resolution var især værdifulde i håndteringen bekymring i synergi feltet om reproducerbarhed ved brug af dobbelt fortyndingsserie ^12. Endelig vores assay var kvantitativt og også thernden målte gradueringer af hæmning. Som følge heraf assayet fanget samtlige inhiberende information, der kan udtrykkes i isocontour isobologrammer hvori isocontours forbinde kombinatoriske koncentrationer med tilsvarende niveauer af vækstinhibering. ⁶ Denne plotning strategi tillod visualisering af kombinatoriske dosisresponskurver. For at illustrere vores metode, vi beskrive vores protokol for at udføre disse analyser og viser repræsentative resultater.

Protocol

1. Real Time Intracellulær Vækst og eukaryote cellecytotoksicitetsassay

1. Forberedelse værtsceller (J774A.1 celler)
   1. Kultur J774A.1 Mus musculus makrofag-lignende celler i suspension i RPMI 1640 med 9% jern-suppleret kalveserum. Oprindeligt passage i vævskulturkolber. Efter cellerne er blevet sammenflydende i en 75 ^cm2 vævskulturkolbe i 15 ml medium, opdeles ved skrabning og fortynding til 65 ml med den samme type medium, hvoraf 15 ml returneres til vævsdyrkningskolben og 50 ml overføres til en 250 ml bakteriel rystekolbe.
   2. For opskalering, kultur i suspension i 250 ml og / eller 1.000 ml bakterielle kolber fyldt til en femtedel volumen med vævskulturmedium. Luftes ved at indstille rotationshastigheden på cirka 120 omdrejninger i minuttet. For konstant vækst, inkuberes ved præcis _5% CO2 og 37 ° C.
   3. Harvest celler, når de når densitet i området 2,5 x 10 ⁶ celler/ ml til 5 x 10 ⁶ celler / ml. Sikre døde celleprocenten (lettest analyseret ved trypanblåt-farvning), ikke overstiger 25%, som døde celler vil øge baggrundsstøjen i cytotoksicitetsassays.
   4. Plade i hvid, vævskultur-behandlet, 384-brønds mikroplader med 5 x 10 ⁴ J774A.1 celler i 30 pi vævskulturmedium per brønd. Inkuber mikroplader overnight at opnå 90% konfluens på dagen for eksperimentet.
2. Forberedelse Selvlysende eller Fluorescent Legionella pneumophila
   1. Passage L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: lux ⁸⁾ bakterier på passende medium, dvs. bufferet trækul gærekstrakt (BCYE) medium. Hvis du bruger en thymidin auxotrof stamme, supplere medium med 100 ug / ml thymidin. Forbered pletter af bakterier til eksperimenter ved at sprede organismer tykt på en ny BCYE plade og inkubering én dag (hvis fra en tidligere plade passage) eller to til tre dage (hvis fra frossen lager) for at opnå sammenflydendevækst.
      1. Forbered BCYE plader ved at opløse 10 g gærekstrakt, 10 g N - (2-acetamido) -2-aminoethansulfonsyre, 0,35 g K ₂ HPO _4, og 1 g monobasisk kalium α-ketoglutarat i 950 ml deioniseret vand. Juster til pH 6,9 med Kaliumhydroxid (≥ 2,5 ml 11,9 molær opløsning).
      2. Der tilsættes 15 g agar og 2 g aktivt kul; og bringe til en L endelige volumen. Tilføj en magnetisk omrører og autoklaver. Cool medium til 55 ° C og tilsæt filtersteriliserede opløsninger indeholdende 0,4 g L-cystein og 0,42 g Ammonium jern (III) citrat opløst i deioniseret vand. Brug magnet omrøringsplade at blandes inden hælde petriskåle.
      3. Til prøvning af L. pneumophila vækst i axenisk vækstmedium, forberede ACES-gærekstrakt bouillon (AYE) ved at kombinere alle kemiske reagenser, der anvendes til BCYE bortset fra trækul agar. Filter sterilisere og bruge med det samme, eller fryse til senere eksperimenter.
   2. Resuspender organismer i samig vævskulturmedium anvendes til J774A.1 celler med 100 pg / ml thymidin tilskud som passende.
3. makrofag Infektion
   1. Tilføj testforbindelser af interesse (screening forbindelser og positive og negative kontroller for bakteriel væksthæmning og eukaryot celle lysis). Fortrinsvis opløses stamopløsninger ved ≥500x i DMSO (dimethylsulfoxid) eller en vandig opløsning til at give tilstrækkelig fortynding af køretøjet.
      1. Selvom stamopløsninger kan opbevares frosset, undgå fryse-tø cykler for labile forbindelser og antimikrobielle midler.
   2. Fortynd luminescerende bakterier til at målrette på 2,5 x 10 ⁶ CFU (kolonidannende enhed) / m og fluorescerende reporter-mærkede bakterier til 1,0 x 10 ⁷ CFU / ml i vævskulturmedium og tilføje passende ikke-toksisk, membran-impermeabel, Nucleic syre- bindende farvestof på 2.5x slutassaykoncentrationen.
   3. Tilsæt 20 pi blanding til hver J774A.1 kultur brønd, endelige assayvolumen50 pi, endelig bakteriel koncentration 1 x 10 ⁶ CFU / ml (lux operon reporter) eller 4 x 10 10 ⁶ CFU / ml (fluorescerende protein reporter).
   4. Der inkuberes ved 37 ° C i 1-3 dage i 5% _CO2 ved 100% relativ fugtighed for at forhindre fordampningsemissioner randeffekter.
4. Assay Udlæsning
   1. Læs bakterievækst og eukaryot celle toksicitet på en mikroplade luminometer og fluorimeter som passende til reportere, der anvendes.
      1. At undgå temperatur-associeret randeffekter, termisk ligevægt mikroplader før luminescens aflæsning ved anbringelse i et enkelt lag på en lab bænk med låg på klem i ca. 20 min (eller i et biologisk sikkerhedsskab med låg fra for ca. 10 min).
   2. Retur mikroplader at inkubator hvis realtid udlæsning på senere tidspunkter er ønsket.

2. Dataanalyse

1. Normalisere data til positiv og negativ conkontroller til at beregne procent eller fold-inhibering til intracellulær bakteriel vækst og procent cytotoksicitet for eukaryote celler.
2. For at vurdere assay robusthed, beregne statistisk adskillelse mellem positive og negative kontroller til både bakteriel væksthæmning og cytotoksicitet under anvendelse Z-faktor (Z ') analyse, hvor Z' = 1 - 3 (σ _p + σ _n) / | u _p + u _n |. I denne ligning, σ _p og σ _n er standardafvigelserne for de positive og negative kontrolbrønde henholdsvis; μ _p og u _n er middelværdierne for de positive og negative kontrol brønde, hhv.
   1. For high-throughput screening-assays, beregne standard z-scores (eller andre alternative, kvantitative statistiske mål) for at vurdere virkningerne af testforbindelser af interesse. Alternativt, beregne en simpel fold-reduktion eller log gange reduktion som et potentielt fysiologisk mere relevant effektmål størrelsesorden for geometrisk replikerende bakterier.

3. Single og Multi-dimensional (dvs. Synergy) Dosis-respons Test og Data Interpretation

1. Forbered makrofager og bakterier, som beskrevet i protokol sektion 1.
2. Lige før infektion eller axenisk inkuberingen tilsættes antimikrobielle stoffer af eksperimentel interesse i en seriel, fordobling fortyndingsserier, med det mål spænder på den høje ende en koncentration, der fuldstændigt eliminerer vækst (dvs. den minimale inhiberende koncentration eller MIC) og den lave afslutte en koncentration, der viser ingen indlysende aktivitet.
3. Brug et automatiseret system håndtering væske at lette enkelt dosis-respons og kombinatorisk synergi test setup gennem direkte, automatiseret tilsætning af antimikrobielle fortyndinger ifølge fabrikantens protokol.
4. Overvej brug af sub-fordobling fortyndinger, for eksempel,841 / 54841eq1.jpg "/> - fold fortyndingsrække, og analysen replikerer at øge nøjagtigheden og reproducerbarhed af data.
5. For makrofag infektion, fortyndes luminescerende bakterier til at målrette på 2,5 x 10 ⁶ CFU (kolonidannende enhed) / ml i vævskulturmedium. Tilsæt 20 pi blanding til hver J774A.1 kultur brønd, endelige assayvolumen 50 pi, endelig bakteriel koncentration 1 x 10 ⁶ CFU / ml; og inkuberes ved 37 ° C i 5% _CO2 ved 100% relativ fugtighed.
   1. For axenisk test vækst, fortyndes luminescerende bakterier til en slutkoncentration på 1 x 10 ⁶ CFU / ml i AYE medium, tilsættes 50 pi til hver brønd i en plade med 384 brønde og inkuber ved 37 ° C i _5% CO2 ved 100% relativ fugtighed.
6. Beregn fraktioneret inhibitorkoncentration indeks for antimikrobielle kombinationer, der inhiberer bakterievækst. For hvert lægemiddel i kombinationen (a, b,.. N), som resulterer i fuldstændig eller> 99% inhibering af bakteriel gVÆKST, beregne den enkelte fraktioneret inhiberende koncentration (FIC _{a, b, n...)} som følger: FIC _a = koncentrationen af forbindelse "A" divideret med den minimale inhibitorkoncentration af "a" i sig selv. _. Brug den samme formel, beregner FIC _B osv derefter beregne den kombinatoriske FIC indeks eller FIC = FIC _a + _b + FIC. . .FIC _N for hver hæmmende kombination.
   1. Brug det kombinatoriske indeks, der afviger mest fra 1,0 til vurdering synergi. Overvej en afskæring på ≤0.5 som en konservativ indikation af en synergistisk virkning og ≥4, en antagonist virkning. ¹²
   2. Plot isobologrammer, isocontour isobologrammer, og / eller isosurface isobologrammer ⁶ som alternative grafiske fremstillinger af kombinatoriske effekter.

Representative Results

Mikroplade intracellulær vækst assay

Figur 1 viser som diagram analysetrin. kan udføres den automatiserede viste trin manuelt. Dog er throughput lettet betydeligt under anvendelse af flydende håndteringssystemer.

Figur 2 viser repræsentative resultater fra en 384-brønds mikroplade, dual-udlæsning, real-time intracellulær vækst og eukaryot celle cytotoksicitet assay under anvendelse af en Legionella-stamme (LP02) mærket med enten en lux operon (figur 2A, 2B) eller mNeptune2 fluorescerende protein ( Figur 2C, 2D) reporter. Positive og negative kontrolprøver forbindelserne (DMSO, antibiotika, saponin) blev tilsat til pladerne ved brug af en stift overførselsrobot at simulere ydeevnen i en high-throughput screening indstilling. Betydelig Legionella (figur 2A, 2C) let kan skelnes i forhold til saponin lyse og antibiotika-behandlede kontroller ved 24 til 72 timer for selvlysende bakterier og 48 til 72 timer for mNeptune2-mærkede bakterier hhv. Legionella lyserer typisk værtsceller efter replikerende i 48 til 72 timer. Dette kan blive værdsat i fig 1B og 1D, der udviser øget fluorescens af SYTOX Green (en repræsentant, impermeabel, nukleinsyrebindende farvestof og markør af host celledød) med tiden. Cytotoksicitet når til sidst den maksimale mængde observeret i detergent (saponin), værtscelle lysis, positiv kontrol. mNeptune2-mærkede organismer blev tilsat på en fire gange højere inokulum end lux-operon-mærkede bakterier, sandsynligvis tegner sig for en hurtigere værtscelle drab og tidligere tilhørende stigning i fluorescens signal i mNeptune2 eksperimenter. Som forventet, effektiv antimikrobiel behandling (levofloxacin eller azithromycin) prevteret både bakterievækst og vært cellelysis. Omvendt cytotoksiske forbindelser, som begrænsede intracellulær vækst gennem ødelæggelse af værtscellen (f.eks saponin) kunne let identificeres ved en kombination af lav luminescens eller mNeptune2 fluorescens og høj cytotoksicitet-associeret signal. Endvidere observation af kombineret fald i både luminescens og mNeptune2 fluorescens (bakterievækst), og cytotoksicitet forudsat rimelig sikkerhed, at en forbindelse er en sand intracellulær vækst inhibitor (fx azithromycin og levofloxacin positive kontroller) snarere end en falsk positiv følge af falsk indgreb i bakteriel reporter signal.

Tabel 1 - 3 viser repræsentative Z 'for tre forskellige bakterielle reportere (lux operon, mNeptune2, tdTomato) og tilsvarende fluorescens værdierne i forhold til kontrol. En Z '> 0,5 indikerer en statistically robust assay egnet til high-throughput indstillinger; kan dog lavere Z 'være egnet, afhængigt af eksperimentelle mål, dvs., evnen til pålideligt at skelne mere eller mindre subtile effekter af test forbindelser eller forstyrrelser. Baseret på resultater fra figur 2, mNeptune2 var ikke så følsom reporter som den bakterielle luciferase operonen. Derfor, som forventet, en robust forskel mellem mNeptune2 signal i negativ (DMSO) og positive (levofloxacin, azithromycin, saponin) vækstinhibitor kontroller blev ikke observeret indtil dag 2 eller dag 3 i inkubationen, i modsætning til tidligt, rimeligt robust signal af lux operon reporter bakterier på dag 1 efter infektion. I modsætning hertil tdTomato, en alternativ bakteriel fluorescerende reporter viste suboptimal Z 'i hele den smitsomme kurset. Suboptimale fluorescerende egenskaber resulterede i en del fra indgreb af fluorescens-excitation og emission hale ind i området bruges til optimal aflæsning af tdTomato signal. Dette indgreb kan forstås ud fra den positive Z 'findes i tdTomato saponin versus levofloxacin sammenligning (hvilket indebærer en væsentlig forskel i antallet af bakterier under to betingelser hvor bakterier ikke bør replikere). Dette resultat kan forklares ved saponin lysis forårsager en stærk fluorescenssignal, hvis hale detekteres som tdTomato emission, og derfor fører til en falsk forskel mellem saponin og antibiotiske kontroller. Derfor, mens den bakterielle lux og mNeptune2 reportere i kombination med fluorescens synes anvendelig til dual-udlæsning, løsningsorienterede baserede, real-time analyser, den tdTomato og fluorescens kombination, i hvert fald uden yderligere matematisk signal udfoldning, ikke.

Figur 3 viser tidligere offentliggjorte eksempler på dosisresponskurver for kendte antimikrobielle vha lux operon, reporter-mærkede organismer. ⁶ Især Legionella gørikke vokse i vævskulturmedium. Derfor replikering af bakterier i makrofag infektion analyser repræsenterer udelukkende intracellulær vækst. Dog vil Legionella vokse axenisk i en specialiseret, lavt natrium, flydende ACES (N - (2-acetamido) -2-aminoethansulfonsyre) gærekstrakt medium. ²⁰ Her virkninger på intracellulære og axenisk vækst blev sammenlignet. Ved hjælp af disse to vækst systemer, observerede vi, at polære antimikrobielle stoffer såsom p-lactamer (meropenem, ceftriaxon) og aminoglykosider (data ikke vist) er dårlige inhibitorer af intracellulær vækst, i modsætning til deres potente virkninger på axenisk vækst. Formentlig dårlig effekt i makrofag infektion assays er baseret på en manglende evne til at få adgang til intracellulære legionella replikative niche. I modsætning hertil eukaryot celle-penetrerende antimikrobielle stoffer såsom quinoloner (levofloxacin) og azithromycin, demonstrerede potente virkninger på både intracellulære og axeniske bakterier.

IC50 (koncentration for 50% bakterievækst inhibering) og _CC50 (koncentration, der inducerer 50% eukaryot celledød) kan bestemmes, og selektivitet, CC ₅₀ / _IC50, beregnes. Alle tre foranstaltninger er vigtige kriterier for sammensatte progression i lægemiddeludvikling indsats. Figur 4 viser et eksempel på sådan dobbelt, dosisresponskurver i afhængighed antibiotikummet doxycyclin, data opnået fra de samme screening brønde over tid. I figur 4A, på dag 1 af infektion, omkring hundrede gange bakterielt replikation er tydeligt i de nul antibiotiske testbrønde sammenlignet med de højeste niveauer af inhibering observeret med antibiotikum. Der var minimal associerede eukaryot celle toksicitet bortset fra ved meget høje doxycyCline koncentrationer (≥10 ug / ml). På dag 2 (figur 4B), bakteriel lux signal var ca. 10 gange større end dag 1 med betydelig bakteriel replikation-associerede cytotoksicitet observeret ved lave antimikrobielle koncentrationer. Som forventet, bakteriel replikation-induceret vært celledød sporer tæt med antallet af bakterier (lux signal) i hele den antimikrobielle dosisresponskurven. Ved højere antimikrobielle koncentrationer cytotoksicitet reduceres til baseline, indtil meget høje koncentrationer, hvor doxycyclin igen forekommer toksisk som observeret på dag 1. Den tilsyneladende forskydning af luminescens dosis-respons i retning lidt højere antimikrobielle koncentrationer sammenlignet med fluorescens-baserede cytotoksiske målinger er noget overdrevet når plotte luminescens og cytotoksicitet på log og lineære skalaer, henholdsvis som vist. _IC50 for bakterievækst var ca. 100 ng / ml, mens CC ₅₀ var ca. 10 ug / ml, 50 beskrevet tidligere for doxycyclinbehandling af leukocyt afstamning, HL-60-cellelinie. ²¹ Derfor samlede selektivitet bestemt på denne dobbelt udlæsning eksperiment var ca. 100.

Figur 5 viser tidligere offentliggjorte isocontour isobologrammer forbundet med todimensionale synergieffekter forsøg, hvor parvise kombinationer af antimikrobielle stoffer blev testet for forbedret virkning mod intracellulær L. pneumophila. ⁶ Selv standard isobologrammer forbinde de laveste kombinatoriske koncentrationer af antibiotika, der fuldstændig hæmmer vækst, vi har valgt, baseret på tilgængelige kvantitative hæmmende data, til at forbinde punkter med lignende niveauer af hæmning ved hjælp isocontours. Den rigtige fleste isocontour i disse figurer svarer til den standard isobologram linje. Konkav isobologrammer generelt indikerer synergi, mens konvekse isobologrammer generally indikerer ligegyldighed eller antagonisme. Eksempler på synergi (paneler AC) og ligegyldighed er vist (DF), i dette tilfælde svarende til FIC indeksværdier på <0,5 og ≥1 hhv. ⁶

Notatet parvise kombinationer af azithromycin, minocyclin, og rifampicin demonstrerede synergi. Derfor blev disse midler afprøvet sammen i trevejskombination som vist i figur 6 ^6. Her blev en overflade trukket til at forbinde de laveste kombinatoriske koncentrationer af de tre antibiotika, der førte til> 99% inhibering af bakteriel intracellulær vækst. Den observerede konkav-formet overflade, i sig selv tyder på tredimensionale synergi, svarede til en lav FIC indeks (0,325) indikerer væsentlig synergieffekt.

Tabel 1: Z 'for lux operon-rapportEr, Legionella Infektion sammenligning af positive og negative kontroller. Z 'svarer til datapunkter vist i figur 2A, 2B. Denne tabel er blevet ændret fra Chiaraviglio og Kirby 2014. ⁴ Positiv luminescens Z '> 0.25 er fremhævet med gule bogstaver på en sort baggrund.

Tabel 2: Z 'for mNeptune2-reporter, Legionella-infektion - sammenligning af positive og negative kontroller. Z 'svarer til datapunkter vist i figur 2C, 2D. Positiv mNeptune2 fluorescens Z '> 0,25 er fremhævet med røde bogstaver.

Tabel 3: Z 'for tdTomato-reporter, Legionella-infektion - sammenligning af positive og negative kontroller. Positiv tdTomato fluorescens Z '> 0,25 er fremhævet med røde bogstaver. Falsk positive Z '> 0.25 relateret til at overlappe af SYTOX Green og tdTomato emission er fremhævet med grønne tegn.

Figur 1: Pictorial repræsentation af dual-reporter assay setup. (A) -genudpladning af J774A.1 celler dyrket i suspension i 384 brønde. (B) Tilsætning af forbindelser af interesse for mikroplader. (C) Samtidig infektion og tilsætning af nukleinsyre-bindende farvestoffer; inkubation; og udlæsning. Klik her for at se en større version af denne figen ure.

Figur 2: Dual, real-time udlæsning af intracellulær bakteriel vækst og eukaryot cytotoksicitet i high-throughput format. Svarende luminescens (A) og fluorescerende (B) signaler under intracellulær infektion af J774A.1 celler med lux operon-udtrykkende Legionella pneumophila. Tilsvarende fluorescerende protein (C) og fluorescerende (D) signaler under intracellulær infektion af J774A.1 celler med mNeptune2-udtrykkende Legionella pneumophila. Fire behandlinger er vist: negativ DMSO kontrol ( ); positiv cytotoksicitet kontrol, saponin ( ); og positive bakterielle vækstinhibering kontroller, azithromycin (tion 4 "src =" / files / ftp_upload / 54.841 / 54841eq4.jpg "/>) og levofloxacin ( ). Datapunkter repræsenterer middelværdi og standardafvigelse på 96 replikater udført i dobbeltbestemmelse, 384-brønds plader. Bemærk, standard afvigelse fejllinjer for nogle datapunkter var minimale og derfor skjult i datapunktsymboler. Paneler A og B er blevet ændret fra Chiaraviglio og Kirby 2014. ⁴ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Repræsentative eksempler på endimensional, dosis-respons-assays. J774A.1-celler blev inficeret med lux operon-udtrykkende, L. pneumophila og behandles med en dobbelt fortyndingsserie af angivne antimikrobielle midler (laBeled som "intracellulær"). Parallelt hermed lux operon-udtrykkende, blev Legionella fortyndet til den samme slutkoncentration i Esser gærekstrakt medium (AYE) og behandlet med en identisk, dobbelt fortyndingsrække (mærket som "axenisk '). Luminescens blev læst to dage efter bakteriel inokulation og afsættes mod antimikrobiel koncentration. Panel A indbefatter antimikrobielle stoffer almindeligvis anvendes til behandling Legionella-infektion. Panel B sammenligner aktiviteten af forskellige makrolidantibiotika. Panel C indeholder flere forskellige klasser af antimikrobielle stoffer med varierende og til tider kontrasterende intracellulære og axenisk potens. Datapunkter repræsenterer gennemsnit og standardafvigelser for tre separate testbrønde pr tilstand. Dette tal er blevet ændret fra Chiaraviglio og Kirby 2015. ⁶ Klik her for at se et størreversion af denne figur.

Figur 4: Eksempel på en dual-udlæsning, dosis-respons eksperiment til bestemmelse _{IC50, CC50} og selektivitet. Virkninger af doxycyclin på intracellulær vækst og J774A.1 cellecytotoksicitet blev bestemt på dag 1 og 2 efter infektion. Datapunkter repræsenterer gennemsnit og standardafvigelser for tre separate testbrønde pr tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Eksempel på todimensionale synergieffekter assays. Kombinatorisk seriel dilutions af par af antimikrobielle stoffer blev testet for synergi imod intracellulær vækst af Legionella i J774A.1 makrofager. Isocontours linjer forbinder punkter med samme procent hæmning. Længst til højre isobologram forbinder kombinationer med fuldstændig intracellulær vækstinhibering (> 99% luminescens reduktion i forhold til ubehandlede kontroller) og svarer til standarden isobologram plot. Skravering angiver procent inhibition som afgrænset af Det farvekodede nøgle i hver graf. Isocontours fra venstre til højre svarer til 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 og 1% vækst i forhold til ubehandlede kontroller. Dette tal er blevet ændret fra Chiaraviglio og Kirby 2015. ⁶ Klik her for at se en større version af dette tal.

Eksempel på en tredimensional synergi assay. De laveste kombinatoriske koncentrationer af azithromycin, minocyclin og rifampicin, som resulterede i> 99% vækstinhibering blev forbundet for at danne et isobologram overflade plot. Dette tal er blevet ændret fra Chiaraviglio og Kirby 2015. ⁶ Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi beskriver realtid assays til samtidig detektering af intracellulær bakteriel vækst og værtscelle cytotoksicitet. Der er flere kritiske trin i protokollen. Først, for robust assay ydeevne, der skal være tilstrækkelig spektral adskillelse mellem bakterielle og cytotoksicitet udlæsninger. En sådan adskillelse er iboende for kombinationer af luciferase operon journalister og fluorescerende DNA-bindende farvestoffer. Men baseret på vores erfaringer (tabel 1-3, figur 2), brug af dobbelt, fluorescerende udlæsning kræver ikke-overlappende fluorescerende signaler (f.eks brug af en langt-rød fluorescerende protein reporter og grøn nukleinsyre plet) at opnå robust,, opløsningsbaserede data. Desuden fra tidligere erfaring, potentielt relateret til rådighed læser optik eller løsning fluorescensegenskaber kun DNA pletter med grøn eller orange emission gav brugbare cytotoksicitetsdata, dvs Z 'større end> 0,5, en foranstaltning indikerer strong assay ydeevne. ⁴ Derfor er opløsningsbaserede, dual-udlæsning assays noget begrænset i forhold til, hvad reportere kan anvendes.

Et andet kritisk trin er forholdet mellem inficerende bakterier til makrofager. Bakteriel infektion inducerer vært celledød. Derfor kan for højt et inokulum føre til tidlig vært celledød, relativt lave niveauer af bakteriel replikation, og potentielle formørkelse af direkte cytotoksiske virkninger af antibiotika, der undersøges. Den passende inficerer forhold kan bestemmes empirisk og kan afhænge af virulens af den særlige bakteriestamme, der undersøges. En lav-forhold på ca. 1: 1 er et godt udgangspunkt. Eksperimenter som dem vist i figur 2 og tabel 1 - 3 ud udført med flere infektion nøgletal vil tillade vurdering og optimering af betingelserne for anvendelse i fremtidige analyser. Notatet for Legionella især brug af en stamme baggrund med NATlukkende lavere værtscelle cytotoksicitet (en flagellin mutant) ⁸ bidraget væsentligt til den høje assay robusthed opnået. Endvidere oversættelse af dual-udlæsning teknik til andre intracellulære, patogen-værtssystemer kan også kræve yderligere justeringer af infektionen protokollen. Legionella vokser ikke i vævsdyrkningsmedium, tillader os at tilskrive øget reporter signal til intracellulær vækst alene. Men mange intracellulære patogener (fx Brucella) kan vokse i forskelligt omfang både intracellulært og i vævskulturmedium. Derfor kan yderligere trin, såsom gentamicin behandling og vask af værtsceller efter indledende infektion være nødvendigt at reducere ekstracellulær replikation og tillade selektiv undersøgelse af intracellulær replikation kapacitet. ²²

Assay opskalering til anvendelse i high-throughput screening og synergi test er forbundet med sit eget sæt af udfordringer. De fleste særligtly, fandt vi, at det store antal J774A.1 celler behov for bedste kunne dyrkes i bakterielle snarere end traditionelle vævskulturkolber (se figur 1). Men for at opretholde kulturen sterilitet, blev svamp skum eller andet filter caps for disse kolber fundet, at foretrække frem for standard bakterielle kolbe hætter. Placering af en lille orbitalryster platform inde i en standard vævskultur inkubator tilladt os at udføre opskalering kultur med udstyr på hånden. Endelig brug af automatiske dispensersystemer (figur 1A, B) i høj grad lettet assay opsætning og afprøvning af kombinatorisk fortyndingsrække.

Især tilstrækkelig detektion af bakteriel replikation er afhængig af evnen til i tilstrækkelig grad at udtrykke enten en lux operon eller fluorescerende protein i den bakterielle stamme af interesse. Til dette formål har vi skabt et sæt af fluorescerende og lux-operon reporter transposoner drevet af en stærk konstitutiv promotor, der skal gøre det muligt for facile mærkning af forskellige typer af bakterier (Kang og Kirby, data ikke vist). Alternativt, for patogener hvis intracellulær replikation viser cytotoksisk for værtscellen, i realtid cytotoksiske målinger alene kan anvendes som et surrogat for intracellulær replikation. Men i dette tilfælde, cytotoksiske og inaktive forbindelser kan ikke pålideligt skelnes i samme assay.

Tilgængeligheden af ​​tidstro udlæsning out giver særlig fordel for high-throughput screening assays. Specifikt undgåelse af endpoint vurdering af bakterievækst (kolonidannende enhed-bestemmelse) ⁷ og cytotoksicitet (tilsætning af cellelevedygtighed reagens ved afslutning af assay) ^23,24 eliminerer adskillige eksperimentelle trin og tilhørende arbejdskraft. Desuden kan tidsforløb nemt blive fulgt i de samme assay brønde med minimal stigning i eksperimentel indsats. Vigtigt er det, at tilgængeligheden af ​​to forskellige typer af bakterielle replikation reportere (bakterierl lux-operonen og fluorescerende protein) har særlig betydning for high-throughput screening assay udvikling. Konkret kan falsk positiv antimikrobielle udlæsning som følge af falsk interferens med lux operon eller fluorescerende reporter output løses gennem brug af både journalister sekventielt i komplementære ortogonale analyser i primær og sekundær screening, henholdsvis ^25. Især fandt vi, at den bakterielle lux-operonen var mere følsom reporter for bakterievækst med en omkring 20 gange til 100 gange lavere detektionsgrænse end vores fluorescerende protein reportere. Men lux output er sandsynligvis omfattet af flere falske positive baseret på flere genprodukter og nødvendige skridt for lysudbytte. ²⁶ Mere specifikt i modsætning til eukaryote enkelt gen luciferase reportere, den bakterielle lux-operonen er en fem-gen-klynge, som koder for både et to-komponent luciferaseenzymet og gener for endogen syntese af luciferasesubstrat. Det villemening derfor at bruge lux operatøren reporter i en primær screening for at sikre tilstrækkelig følsomhed, og det fluorescerende protein reportere i sekundære assays for at sikre specificitet.

Tilsammen den beskrevne metode giver real-time, ikke-destruktive alternativer til at Endpoint analyser til måling af bakteriel replikation og eukaryote cytotoksicitet og derfor repræsenterer en metodisk enkel og alsidig metode til at vurdere antimikrobielle virkninger på intracellulære patogener.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.