Høy gjennomstrømning, Real-time, Dual-avlesning Testing av intracellulær antimikrobiell aktivitet og eukaryote celle Cytotoksisitet

Abstract

Tradisjonelle målinger av intracellulært antimikrobiell aktivitet og eukaryot celle cytotoksisitet stole på endepunkt analyser. Slike endepunkt assays krever flere andre eksperimentelle trinn før avlesning, slik som cellelyse, kolonidannende enhet bestemmelse, eller reagens tilsetning. Ved utførelse av tusenvis av analyser, for eksempel under high-throughput screening, nedstrøms innsats som er nødvendig for slike analyser er stor. Derfor, for å lette high-throughput antimikrobielle oppdagelse, har vi utviklet en sanntids analyse for samtidig å identifisere inhibitorer av intracellulær bakterievekst og vurdering eukaryot celle cytotoksisitet. Spesielt ble sanntid intracellulær bakterievekst gjenkjenning aktivert ved å markere bakterie screening stammer med enten en bakteriell lux operon (1 ^st generasjon analyse) eller fluoriserende protein journalister ^(2. generasjon, ortogonal assay). En ikke-toksisk, cellemembran-impermeant, nukleinsyre-bindende fargestoffDet ble også lagt under første infeksjon av makrofager. Disse fargestoffer er utelukket fra levedyktige celler. Men ikke-levedyktige vertsceller mister membran integritet tillater oppføring og fluorescerende merking av nukleært DNA (deoksyribonukleinsyre). Spesielt, DNA-binding er forbundet med en stor økning i fluorescerende kvantumutbyttet som gir en løsning basert på avlesning av verts celledød. Vi har brukt denne kombinerte analyse for å utføre en high-throughput-skjermen i mikroplateformat, og å vurdere intracellulær vekst og cytotoksisitet ved mikroskopi. Spesielt, kan antibiotika demonstrere synergi i hvilken den kombinerte virkning av to eller flere antimikrobielle midler når de anvendes sammen er større enn når det anvendes separat. Testing for in vitro synergi mot intracellulære patogener er normalt en uhyre oppgave som kombinatoriske permutasjoner av antibiotika ved forskjellige konsentrasjoner må vurderes. Men vi fant ut at vår sanntid analyse kombinert med automatisert, digital dispensering teknologi permitted lettvinte synergi testing. Ved hjelp av disse metodene, var vi i stand til å systematisk kartlegge virkningen av et stort antall antimikrobielle midler alene og i kombinasjon mot intracellulære patogener, Legionella pneumophila.

Introduction

Patogener som vokser eller bor midlertidig i intracellulære er vanskelig å terapeutisk utrydde. Forplikte eller relativt obligate intracellulære patogener som Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, og Mycobacterium spp. ofte krever langvarig kurs av antimikrobiell behandling for kur som kan variere fra måneder til og med år. Videre kan ekstracellulære patogener forbigående oppta intracellulære nisjer og på denne måten unngå en avklaring av normale kurs av antimikrobiell behandling og senere komme til å starte nye runder med virulent infeksjon. Staphylococcus aureus ¹ og uropathogenic Enterobacteriaceae ^2,3 infeksjoner er to stadig mer anerkjente eksempler. Derfor er en grunnleggende medisiner som mål å identifisere nye antimikrobielle stoffer som trenger inn i intracellulære rom. Optimal behandling for raskt å utryddeintracellulære organismer og forebygge utvikling av resistens gjennom sub-hemmende antimikrobielle eksponering er spesielt ønskelig.

For å oppnå dette, har vi utviklet en high-throughput screening teknologi for å identifisere intracellulære-penetrerende antimikrobielle midler rettet mot intracellulære veksten av modellen patogen, Legionella pneumophila. ⁴ Tidligere kliniske observasjoner tyder på at standard antimikrobiell resistenstesting ikke nøyaktig forutsi in vivo terapeutisk effekt mot denne organismen. ⁵ Spesielt var dette fordi store klasser av antimikrobielle stoffer som beta laktamer og aminoglykosider, men svært effektiv mot axenically vokst Legionella, ikke i tilstrekkelig grad trenge inn i intracellulære hvor Legionella bor. ^5,6 Senere bevis antydet at teknisk mer kompliserte intracellulære vekstanalyser effektivt spådd klinisk effekt. ⁷

Derfor har vi utviklet teknologi for sanntids måling av intracellulær bakterievekst. ^6. Dette ble oppnådd ved bruk av en bakteriestamme modifisert ved integrering av enten en bakteriell luciferase-operonet ⁸ (første generasjon assay, beskrevet tidligere) ⁴ eller fluorescerende protein ⁹ reportere (andre generasjon, ortogonal analyse, som er beskrevet her) i det bakterielle kromosom. På denne måten, luminescerende eller fluorescerende signal gir et surrogat, sanntids utlesning av bakteriell nummer.

Men disse attributtene ikke håndtere en betydelig confounder i intracellulær infection analyser, off-target effekter på vertsceller. Spesielt død vertscellen iboende begrenser intracellulær vekst og fører til falsk positiv identifikasjon av antimikrobiell effekt. Som mange forbindelser i screening biblioteker er eukaryote celle giftige, slike falske positiver vil overvelde sanne antimikrobielle midler, nødvendiggjør et stort antall oppfølging, endepunkt cytotoksisitetsassayer for oppløsning.

Dermed var det av stor interesse å kunne vurdere eukaryote celle levedyktighet og intracellulær vekst samtidig. Spesielt, et karakteristisk for ikke-levedyktige eukaryote celler er tap av cellemembranintegritet. Prober som tester permeabiliteten av cellemembranen kan derfor brukes til å vurdere cellelevedyktighet. Vi har tidligere karakterisert muligheten for en rekke putatively cellemembranen-impermeant, fluorescerende, DNA-bindende fargestoffer for å få tilgang til og beis DNA hos døde celler. ⁴ På bindende kjerne-DNA, disse fargestoffer viser en stor økning i quantum fluorescerende utbytte resulterer i økt signal over bakgrunn løsning fluorescens. Som sådan er disse fargestoffer ga en kvantitativ avlesning av eukaryotisk celledød. ⁴ Spesielt, fant vi at flere var giftfri selv ved langvarig co-inkubasjon med J774 makrofager. Da lagt ved førstegangs infeksjon, de ga en real-time, fluorescerende avlesning av eukaryote celledød som kan måles ved en mikro fluorimeter eller observert mikroskopisk.

Derfor, ved å kombinere bruk av en bakteriell reporter og ikke-giftig, membran-impermeant, DNA-bindende fargestoffer, kunne vi utvikle en enkel, ikke-destruktiv, real-time analyse for å måle både bakteriemengde og eukaryote celle cytotoksisitet samtidig. Denne analysen har tillatt oss å screene i 384-brønn plate-format ~ 10.000 kjente bioaktive stoffer, inkludert ~ 250 antimikrobielle midler og> 240.000 små molekyler med funksjonelt uncharacterized aktivitet for evnen til å hemme veksten av intracellulærLegionella pneumophila, mens på samme tid å generere eukaryote celle cytotoksisitet data for hver forbindelse. ⁶ Vår analyse av kjente antibiotika mot intracellulære vekst av Legionella var den mest omfattende utforskning av denne typen til dags dato. ⁶

Basert på effektiviteten i vår analyseformat, vi også senere utforsket de potensielt synergieffekter av kjente antibiotika når de brukes i kombinasjon. En av de mest vanlige synergi tester, den såkalte sjakkbrett-assay, blir standardmessig utføres ved å vurdere virkningene av kombinatoriske to-gangers seriefortynninger av to eller flere antimikrobielle midler. ¹⁰ I disse analysene blir synergi definert ved observasjon av større effekt når to eller flere antimikrobielle midler anvendes sammen enn summen av virkningen av hver enkelt anvendt hver for seg. Av notatet, hittil, kun fokusert og selektiv synergi testing ble utført mot intracellulære Legionella pneumophila

For å lette synergi testing, har vi gjort bruk av vår sanntid intracellulær vekst / eukaryote cytotoksisitet analyse i kombinasjon med automatisert digital dispensering teknologi ^seks. Dette automatisering tillatt oss å dispensere seriefortynninger av forbindelser oppløst i DMSO eller i vandig oppløsning, alene eller i kombinasjon i 384-brønners format. ¹¹ Videre slik robust væskehåndtering teknologi tillater oss å enkelt utføre høyere oppløsning, kvadratrot-of-to (i stedet for standard, lavere oppløsning, dobling) utvannings kombinasjoner for å oppnå høyere nivåer av spesifisitet i våre to-dimensjonal, sjakkbrett synergi analyse. Denne resolusjonen var spesielt verdifull i å ta hensyn i synergi feltet om reproduserbarhet ved bruk av to-fold fortynning serien ^12. Til slutt, vår analyse var kvantitativ og også therefore målt graderinger av hemming. Som et resultat av analysen fanget helheten av hemmende informasjon, uttrykkbart i isocontour isobologrammer hvori isocontours koble kombinatoriske konsentrasjoner med tilsvarende nivåer av veksthemming. ⁶ Denne plotting strategien tillot visualisering av kombinatorisk dose-responskurver. For å illustrere vår metodikk, beskriver vi vår protokoll for å utføre disse analysene og viser representative resultater.

Protocol

1. Real Time Intracellulær Vekst og eukaryote celle Cvtotoksisitetsmålinq

1. Forbereder vertsceller (J774A.1 celler)
   1. Kultur J774A.1 Mus musculus makrofaglignende celler i suspensjon i RPMI 1640 med 9% jern-supplementert kalveserum. Til å begynne med passasjen i vevskulturflasker. Etter at cellene er blitt konfluent i en 75 ^cm2 vevskulturkolbe i 15 ml medium, splittet ved skraping og fortynning til 65 ml med den samme type medium, hvorav 15 ml føres tilbake til vevskultur kolbe og 50 ml overføres til en 250 ml bakterierystekolbe.
   2. For oppskalering, kultur i suspensjon i 250 ml og / eller 1000 ml bakterieflasker fylt til en femtedel av volumet med vevskulturmedium. Luft ved å sette rotasjonshastighet på ca 120 omdreininger per minutt. For jevn vekst, ruge på nøyaktig 5% CO ₂ og 37 ° C.
   3. Høste cellene når de når densitet i området 2,5 x 10 celler ⁶/ ml til 5 x 10 ⁶ celler / ml. Sikre død celle prosentandel (lettest bestemt ved trypanblått-farving) ikke overstiger 25%, så døde celler vil øke bakgrunnsstøyen i cytotoksisitetsanalyser.
   4. Plate i hvitt, vevskultur-behandlede, 384-brønners mikrotiterplater ved 5 x 10 ⁴ celler J774A.1 i 30 mL vevsdyrkningsmedium per brønn. Inkuber mikro over natten for å oppnå 90% samløpet på dagen for forsøket.
2. Forbereder Selvlysende eller Fluorescent Legionella pneumophila
   1. Passage L. pneumophila (Lp02 :: Flaa :: lux ⁸⁾ bakterier på egnet medium, dvs. bufret kull gjærekstrakt (BCYE) medium. Hvis du bruker en tymidin auksotrof belastning, supplere medium med 100 pg / ml tymidin. Forbered flekker av bakterier for eksperimenter ved å spre organismer tett på en ny BCYE plate og ruger en dag (hvis fra en tidligere plate passasje) eller to til tre dager (hvis fra frossen lager) for å oppnå konfluentvekst.
      1. Forbered BCYE platene ved å oppløse 10 g gjærekstrakt, 10 g N - (2-acetamido) -2-aminoetansulfonsyre, 0,35 g K HPO _{2 til 4,} og 1 g monobasisk kalium α-ketoglutarat i 950 ml avionisert vann. Juster til pH 6,9 med kaliumhydroksyd (≥2.5 ml 11,9 molar oppløsning).
      2. Tilsett 15 g agar og 2 g aktivert trekull; og ta med til en L sluttvolum. Legg en magnetisk rørestav og autoklav. Kjølig medium til 55 ° C og tilsett filtersterilisert oppløsninger inneholdende 0,4 g L-cystein og 0,42 g ammonium jern (III) sitrat oppløst i avionisert vann. Bruk magnet oppstuss plate å blande før helle Petri plater.
      3. For testing av L. pneumophila vekst i axenic vekstmedium, forberede ACES-gjærekstrakt buljong (AYE) ved å kombinere alle kjemiske reagenser som brukes for BCYE unntatt kull og agar. Filter sterilisere og bruk umiddelbart, eller fryse for senere eksperimenter.
   2. Resuspender organismer i SAmeg vevskulturmedium som brukes for J774A.1 celler med 100 ug / ml thymidin supplering etter behov.
3. makrofag Infeksjon
   1. Legg testforbindelser av interesse (screening forbindelser og positive og negative kontroller for bakterievekst inhibering og eukaryot cellelyse). Fortrinnsvis oppløses stamløsninger ved ≥500x i DMSO (dimetylsulfoksyd) eller en vandig oppløsning for å tillate tilstrekkelig fortynning av kjøretøyet.
      1. Selv om lagerløsninger kan lagres frosset, unngår fryse-tine-sykluser for labile forbindelser og antimikrobielle midler.
   2. Fortynn selvlysende bakterier til målet på 2,5 x 10 ⁶ CFU (kolonidannende enhet) / m og fluorescerende rapportør-merket bakterier til 1,0 x 10 ⁷ cfu / ml i vevskulturmedium og tilsette en tilsvarende ikke-toksiske, membran-impermeant, nuklein- syre bindende fargestoff på 2.5x endelige analysen konsentrasjon.
   3. Tilsett 20 ul av blandingen til hver J774A.1 kulturbrønn, endelig analysevolum50 pl, sluttbakteriekonsentrasjon 1 x 10 ⁶ CFU / ml (lux operon reporter) eller 4 x 10 10 ⁶ CFU / ml (fluorescent protein rapportør).
   4. Inkuber ved 37 ° C i 1-3 dager i _5% CO2 ved 100% relativ fuktighet for å forhindre fordamping kanteffekter.
4. analyse~~POS=TRUNC Timer
   1. Les bakterievekst og eukaryot celle toksisitet på en mikroplate luminometer og fluorimeter som passer for reportere som brukes.
      1. For å unngå temperatur forbundet kanteffekter, termisk likevekt mikro før luminescens lesing av plassering i et enkelt lag på en lab benk med lokk på gløtt for ca 20 min (eller i et biologisk sikkerhetskabinett med lokk av for ca 10 min).
   2. Returner mikro til kuvøse hvis sanntid avlesning på senere tidspunkter er ønsket.

2. Data Analysis

1. Normal data til positive og negative controller å beregne prosent eller fold-hemming for intracellulær bakterievekst og prosent cytotoksisitet for eukaryote celler.
2. For å vurdere assay robusthet, beregne statistiske skille mellom positive og negative kontroller for både bakterie- vekst-inhibering og cytotoksisitet ved bruk av Z-faktor (Z ') analyse hvor Z' = 1 - 3 (σ _p + σ _n) / | u _p + u _n |. I denne ligning, σ _p og σ _n er standardavvikene for de positive og negative kontrollbrønner, henholdsvis; μ _p og u _n er gjennomsnittsverdiene for de positive og negative kontrollbrønner, respektivt.
   1. For high-throughput screening-analyser, beregner standard z-score (eller andre alternativ, kvantitative statistiske mål) for å vurdere effekter av testforbindelser av interesse. Alternativt beregne en enkel fold-reduksjon eller logg-fold reduksjon som et potensielt fysiologisk mer relevant mål på effekt magnitude for geometrisk Replikere bakterier.

3. Enkelt og Multi-dimensjonale (dvs. Synergy) Dose-respons Testing og Data Tolkning

1. Forbered makrofager og bakterier som beskrevet i protokollen § 1.
2. Like før infeksjon eller axenic inkubasjon legge antimikrobielle midler av eksperimentell interesse i en serie, dobling fortynning serien, med mål om å spanning på den høye enden en konsentrasjon som fullstendig eliminerer vekst (dvs. minimal hemmende konsentrasjon eller MIC) og på den lave avslutte en konsentrasjon som viser ingen åpenbare aktivitet.
3. Bruk en automatisert væske håndteringssystem til rette for enkel dose-respons og kombi synergi testing setup gjennom direkte, automatisert tillegg av antimikrobielle fortynninger i henhold til produsentens protokoll.
4. Vurdere bruk av sub-dobling fortynninger, f.eks841 / 54841eq1.jpg "/> - fold fortynning serie, og analyse replikerer for å øke nøyaktigheten og reproduserbarheten av data.
5. For makrofag infeksjon, fortynn luminescerende bakterier til målet på 2,5 x 10 ⁶ CFU (kolonidannende enhet) / ml i vevskulturmedium. Tilsett 20 ul av blandingen til hver J774A.1 kulturbrønn, endelig analysevolum 50 pl, sluttbakteriekonsentrasjon 1 x 10 ⁶ CFU / ml; og inkuberes ved 37 ° C i _5% CO2 ved 100% relativ fuktighet.
   1. For axenic vekst testing, fortynn luminescerende bakterie til sluttkonsentrasjon på 1 x 10 ⁶ CFU / ml i AYE medium, tilsett 50 ul til hver brønn i en 384-brønners plate og inkuberes ved 37 ° C i _5% CO2 ved 100% relativ fuktighet.
6. Beregn brøk inhibitor konsentrasjon indeks for antimikrobielle kombinasjoner som hemmer bakterievekst. For hvert legemiddel i kombinasjonen (a, b,. N.) Som resulterer i fullstendig eller> 99% inhibering av bakteriell growth, beregne den enkelte fraksjonelle inhiberende konsentrasjon (FIC _{a, b, n...)} som følger: FIC _a = den konsentrasjon av forbindelse "a" delt på den minimale konsentrasjon av inhibitor "a" av seg selv. _. Ved hjelp av den samme formelen, beregn FIC _b, etc. Deretter beregne kombinatoriske FIC indeks eller FIC = FIC _a + FIC _b +. . .FIC _N for hver hemmende kombinasjon.
   1. Bruk kombi indeks som avviker lengst fra 1,0 til å vurdere synergi. Vurdere en cutoff av ≤0.5 som en konservativ indikasjon på en synergistisk effekt og ≥4, en antagonist effekt. ¹²
   2. Plot isobologrammer, isocontour isobologrammer, og / eller isosurface isobologrammer ⁶ som alternative grafiske fremstillinger av kombinatoriske effekter.

Representative Results

Mikroplate intracellulær vekst assay

Figur 1 diagrammer analysetrinn. De automatiserte trinn som er vist kan utføres manuelt. Imidlertid er gjennomstrømningen mye lettere å bruke flytende håndteringssystemer.

Figur 2 viser representative resultater fra en 384-brønners mikroplate, to-avlesning, sanntids intracellulær vekst og eukaryot celle cytotoksisitet assay ved anvendelse av en Legionella-stamme (Lp02) merket med enten et lux operonet (figurene 2A, 2B) eller mNeptune2 fluorescerende protein ( Figur 2C, 2D) reporter. Positive og negative kontrollforbindelser (DMSO, antibiotika, saponin) ble tilsatt til platene ved bruk av en tapp overføring robot for å simulere ytelse i en high-throughput screening setting. betydelig Legionella (figur 2A, 2C) kan lett skilles i forhold til saponin lysis og antibiotika-behandlede kontroller ved 24 til 72 timer for selvlysende bakterier og 48 til 72 timer for mNeptune2-merkede bakterier, henholdsvis. Legionella lyserer vanligvis vertsceller etter å replikere i 48 til 72 timer. Dette kan forstås i figurene 1B og 1D, som viser økt fluorescens av SYTOX Grønn (en representativ, impermeant, nukleinsyre-bindende fargestoff og markeringen av verts celledød) over tid. Cytotoksisitet slutt når den maksimale mengde observert i vaskemiddel (saponin), vertscellelyse, positiv kontroll. mNeptune2-merkede organismer ble lagt på en fire ganger høyere podestoff enn lux operon-merket bakterier, sannsynligvis sto for raskere vertscelledreping og tidligere tilhørende økning i fluorescens signal i mNeptune2 eksperimenter. Som forventet, effektiv antimikrobiell behandling (Levofloxacin eller azitromycin) prevented både bakterie- vekst og vertscellelyse. Omvendt, cytotoksiske forbindelser som begrenset intracellulær vekst ved ødeleggelse av vertscellen (f.eks saponin) kan lett bli identifisert ved en kombinasjon av lav luminescens eller mNeptune2 fluorescens, og høy cytotoksisitet-forbundet signal. Videre observasjon av kombinerte reduksjon i både luminescens og mNeptune2 fluorescens (bakterievekst), og cytotoksisitet forutsatt rimelig visshet om at en forbindelse er en sann intracellulære veksthemmere (f.eks, azitromycin og levofloksacin positive kontroller) i stedet for et falskt positivt resultat som skyldes uønsket innblanding bakteriell reporter signal.

Tabell 1-3 viser representative Z 'for tre ulike bakterie journalister (lux operon, mNeptune2, tdTomato) og tilsvarende fluorescens avlesninger i forhold til kontrollene. En Z '> 0,5 indikerer en STATISTICAlly robust analyse passende for high-throughput innstillinger; Imidlertid kan lavere Z 'være egnet, avhengig av eksperimentelle mål, dvs. evnen til å skille pålitelig mer eller mindre subtile effekter av testforbindelser eller perturbasjoner. Basert på resultater fra figur 2, mNeptune2 var ikke så følsom en reporter som bakteriell luciferase operon. Derfor er, som forventet, en robust forskjell mellom mNeptune2 signal i negativ (DMSO) og positive (levofloxacin, azitromycin, saponin) vekstinhibitor kontrollene ikke ble observert inntil dag 2 og dag 3 av inkubasjon, i motsetning til for tidlig, rimelig robust signal fra lux operon reporter bakterier på dag 1 etter smitte. I kontrast, tdTomato, et alternativ bakteriell fluorescerende reporter viste suboptimal Z 'hele smittsomme kurset. Suboptimale fluorescerende egenskaper førte til en del fra utbredelsen av fluorescens eksitasjon og emisjon hale inn i rekken som brukes for optimal avlesning av tdTomato signal. Dette inngrep kan forstås fra den positive Z 'befinner seg i samme tdTomato saponin versus levofloxacin sammenligning (noe som tyder på en signifikant forskjell i bakterietall under to betingelser hvor bakterier ikke skal replikere). Dette resultat kan forklares ved saponin lysis å forårsake en sterk fluorescens-signal, hvis hale er detektert som tdTomato utslipp, og derfor fører til et falsk forskjell mellom saponin og antibiotiske kontroller. Derfor, mens bakterie lux og mNeptune2 journalister i kombinasjon med fluorescens synes brukbare for dual-avlesning, løsningsbasert, sanntidsanalyser, den tdTomato og fluorescens kombinasjon, i alle fall uten ytterligere matematisk signal deconvolution, ikke gjør det.

Figur 3 viser tidligere publiserte eksempler på dose-responskurvene på kjente antimikrobielle midler ved hjelp av lux operonet, rapportørmerkede organismer. ⁶ Spesielt gjør Legionellaikke vokse i vevskultur-medium. Derfor replikasjon av bakterier i makrofag-infeksjonsanalyser representerer utelukkende intracellulær vekst. Imidlertid vil Legionella vokse axenically i en spesialisert, lav natrium, flytende ACES (N - (2-acetamido) -2-aminoetansulfonsyre) gjærekstrakt-medium. ²⁰ Her effekter på intracellulær og axenic vekst ble sammenlignet. Ved hjelp av disse to systemene vekst, observerte vi at polare antimikrobielle midler som for eksempel p-laktamer (meropenem, ceftriaxone) og aminoglykosider (data ikke vist) er dårlige inhibitorer av intracellulær vekst, i motsetning til sine potente effekter på axenic vekst. Antagelig dårlig effekt på makro infeksjon analyser er basert på en manglende evne til å få tilgang til intracellulære Legionella replicative nisje. I motsetning til dette, eukaryote celle-penetrerende antimikrobielle midler som kinoloner (levofloxacin) og azitromycin, demonstrerte potente effekter på både intracellulære og axenic bakterier.

IC50 (konsentrasjon for 50% bakterievekst inhibering) og _CC50 (konsentrasjon som induserer 50% eukaryot celledød) kan bestemmes, og selektivitet, CC ₅₀ / IC _50, beregnet. Alle tre tiltak er viktige kriterier for sammensatte progresjon i legemiddel innsats. Figur 4 viser et eksempel på slike doble, dose-responskurver som reaksjon på det antibiotiske doksycyklin, data oppnådd fra de samme brønnene screening over tid. I figur 4A, på dag 1 av infeksjon, omtrent et hundre ganger bakteriell replikasjon er tydelig i null antibiotiske testbrønner sammenlignet med de høyeste nivåer av inhibisjon observert med antibiotika. Det var minimal tilhørende eukaryot celletoksisitet, unntatt ved meget høy doxycyCline konsentrasjoner (≥10 mg / ml). På dag 2 (figur 4B), bakteriell lux signal var omtrent 10 ganger større enn en dag med sterk bakteriell replikasjonsassosierte cytotoksisitet observert ved lave antimikrobielle konsentrasjoner. Som forventet, sporer bakteriell replikasjon-induserte verts celledød tett med bakterietall (lux signal) i løpet av antimikrobielle dose-responskurve. Ved høyere antimikrobielle konsentrasjoner cytotoksisitet er redusert til grunnlinjen, til svært høye konsentrasjoner, der doksycyklin igjen vises giftig som observert på dag 1. Den tilsynelatende forskyvning av luminescens dose-respons mot litt høyere antimikrobielle konsentrasjoner sammenlignet med fluorescens-basert cytotoksisitetstester målinger er noe overdrevet når plotting luminescens og cytotoksisitet på logg og lineære skalaer, henholdsvis, som vist. _IC50 for bakteriell vekst ble omtrent 100 ng / ml, mens _CC-50 var tilnærmet 10 ug / ml, CC-50 som er beskrevet tidligere for doksycyklin behandling av leukocytt-avstamning, HL-60-cellelinjen. ²¹ Derfor total selektivitet bestemt i denne dual-avlesning eksperimentet var ca 100.

Figur 5 viser tidligere utgitt isocontour isobologrammer assosiert med to-dimensjonale synergi tester der parvise kombinasjoner av antimikrobielle stoffer ble testet for økt effekt mot intracellulære L. pneumophila. ⁶ Selv om standard isobologrammer koble de laveste kombinatoriske konsentrasjoner av antibiotika som helt hemmer vekst, har vi valgt, basert på tilgjengelige kvantitative hemmende data, for å koble poeng med tilsvarende nivåer av inhibisjon ved hjelp isocontours. Lengst til høyre isocontour i disse diagrammene tilsvarer standard isobologram linje. Konkave isobologrammer generelt indikerer synergi, mens konvekse isobologrammer generally indikerer likegyldighet eller motstand. Eksempler på synergi (paneler AC) og likegyldighet er vist (DF), i dette tilfelle svarer til FIC indeksverdier på <0,5 og ≥1, respektivt. ⁶

Av notatet, parvise kombinasjoner av azitromycin, minocycline, og rifampicin demonstrerte synergi. Derfor ble disse midler testet sammen i tre-veis kombinasjoner som vist i figur 6 ^6. Her ble en overflate trukket til å koble de laveste kombinatoriske konsentrasjoner av de tre antimikrobielle midler som førte til> 99% inhibering av bakterievekst intracellulært. Den observerte konkavt formet flate, av seg selv tyder på tre-dimensjonale synergi, tilsvarte en lav FIC-indeks (0,325) som indikerer vesentlig synergi effekt.

Tabell 1: Z 'for lux operon-rapporteh, Legionella infection- sammenligning av positive og negative kontroller. Z 'samsvarer med datapunkter som er vist i figur 2A, 2B. Denne tabellen har blitt forandret fra Chiaraviglio og Kirby 2014. ⁴ Positiv luminescens Z '> 0,25 er uthevet med gule tegn på en sort bakgrunn.

Tabell 2: Z 'for mNeptune2-reporter, Legionella infeksjon - sammenligning av positive og negative kontroller. Z 'samsvarer med datapunkter som er vist i figur 2C, 2D. Positiv mNeptune2 fluorescens Z '> 0,25 er uthevet med rød tegn.

Tabell 3: Z 'for tdTomato-reporter, Legionella infeksjon - sammenligning av positive og negative kontroller. Positiv tdTomato fluorescens Z '> 0,25 er uthevet med rød tegn. Falsk positiv Z '> 0,25 relatert til overlapping av SYTOX Grønn og tdTomato utslipp er markert med grønne tegn.

Figur 1: billedlig fremstilling av dual-reporter analysen oppsett. (A) replating av J774A.1 celler dyrket i suspensjon i 384-brønners skåler. (B) Tilsetning av forbindelser av interesse for mikroplater. (C) samtidig infeksjon og tilsetning av nukleinsyre-bindingsfargestoffer; inkubasjon; og avlesning. Klikk her for å se en større versjon av dette fiken ure.

Figur 2: Dual, real-time avlesning av intracellulær bakterievekst og eukaryote cytotoksisitet i high-throughput format. Tilsvarende luminescens (A) og fluoriserende (B) signaler i løpet av intracellulær infeksjon av J774A.1 celler med lux operon-uttrykkende Legionella pneumophila. Tilsvarende fluorescerende protein (C) og fluoriserende (D) signaler i løpet av intracellulær infeksjon av celler med J774A.1 mNeptune2-uttrykk Legionella pneumophila. Fire behandlinger er vist: negativ DMSO kontroll ( ); positiv cytotoksisitet kontroll, saponin ( ); og positive bakterieveksthemming kontroller, azitromycin (sjon 4 "src =" / files / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) og Levofloxacin ( ). Datapunkter representerer gjennomsnittet og standardavvik for 96 replikater utført i to eksemplarer, 384-brønns plater. Note, standardavvik feilfelt for noen datapunkter var minimal og derfor skjult innenfor datapunktsymboler. Paneler A og B har blitt forandret fra Chiaraviglio og Kirby 2014. ⁴ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Representative eksempler på endimensjonal, dose-responsanalyser. J774A.1-celler ble infisert med lux operon-uttrykkende, L. pneumophila og behandlet med et to-gangers fortynningsserie av angitte antimikrobielle midler (laBeled som "intracellulær"). Parallelt med lux operon-uttrykkende, ble Legionella fortynnet til den samme endelige konsentrasjon i ess gjærekstraktmedium (AYE) og behandlet med en identisk, to-gangers fortynningsserie (merket som "axenic '). Luminescence ble lest to dager etter bakteriell inokulering og plottet mot antimikrobielle konsentrasjon. Panel A inneholder antimikrobielle midler som vanligvis brukes til å behandle legionellasmitte. Panel B sammen aktivitet av ulike makrolidantibiotika. Panel C omfatter flere ulike klasser av antimikrobielle stoffer med varierende og noen ganger kontraster intracellulær og axenic potens. Datapunkter representerer gjennomsnitt og standardavvik av tre separate testbrønner per tilstand. Dette tallet har blitt forandret fra Chiaraviglio og Kirby 2015. ⁶ Vennligst klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.

Figur 4: Eksempel på en dual-avlesning, dose-respons eksperiment for å bestemme _IC-50, CC ₅₀ og selektivitet. Effekter av doksycyklin på intracellulær vekst og J774A.1 celle cytotoksisitet ble bestemt på dag 1 og 2 etter infeksjon. Datapunkter representerer gjennomsnitt og standardavvik av tre separate testbrønner per tilstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Eksempel på to-dimensjonale synergimetodene. Kombiserie dilutions av par av antimikrobielle stoffer ble testet for synergi mot intracellulær vekst av Legionella i J774A.1 makrofager. Isocontours linjer koble interessante lignende prosent hemming. Lengst til høyre isobologram forbinder kombinert med fullstendig intracellulære veksthemming (> 99% luminescens reduksjon sammenlignet med ubehandlede kontroller) og svarer til standard isobologram plottet. Grått indikerer prosent hemming som avgrenses av fargekodede nøkkelen i hver graf. Isocontours fra venstre til høyre tilsvarer 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 og 1% vekst i forhold til ubehandlede kontroller. Dette tallet har blitt forandret fra Chiaraviglio og Kirby 2015. ⁶ Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Eksempel på en tredimensjonal synergi-assay. De laveste kombinatoriske konsentrasjoner av azitromycin, minocycline og rifampicin som resulterte i> 99% veksthemming ble koblet til å danne en isobologram flate tomten. Dette tallet har blitt forandret fra Chiaraviglio og Kirby 2015. ⁶ Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Vi beskriver sanntids analyser for simultan deteksjon av intracellulær bakteriell vekst og vertscelle cytotoksisitet. Det er flere kritiske trinn i protokollen. Først for robust analyseytelsen, må det være tilstrekkelig spektral skille mellom bakterielle og cytotoksiske avlesninger. En slik atskillelse er egenverdi for kombinasjoner av luciferase operon reportere og fluorescerende DNA-bindende fargestoffer. Men basert på vår erfaring (Tabell 1-3, Figur 2), bruk av dual krever fluorescerende avlesning ikke-overlappende fluorescerende signaler (for eksempel bruk av en langt-rød fluorescerende protein reporter og grønt nukleinsyre flekken) å skaffe robust, løsningsbaserte data. Videre fra tidligere erfaring, muligens relatert til tilgjengelige leser optikk eller løsning fluorescens egenskaper, bare DNA flekker med grønn eller oransje utslipp ga brukbare cytotoksisitetstester data, dvs. Z 'større enn> 0,5, et mål som indikerer strong analyseytelsen. ⁴ Derfor, løsningsbasert, dual-avlesning analyser er noe begrenset i forhold til hva journalister kan brukes.

Et annet kritisk punkt er forholdet mellom infiserer bakterier til makrofager. Bakteriell infeksjon induserer verts celledød. Derfor kan en for høy inokulum føre til tidlig verts celledød, forholdsvis lave nivåer av bakteriell replikasjon, og potensialet tåkelegging av direkte cytotoksiske effekter av antimikrobielle midler som ble studert. Den passende infiserer Forholdet kan bestemmes empirisk og kan være avhengig av virulensen av den spesielle bakteriestamme under studien. Et lavt forhold på tilnærmet 1: 1 er et godt utgangspunkt. Eksperimenter som de som er vist i figur 2 og tabell 1 - 3 utført med flere infeksjonsforhold vil tillate evaluering og optimalisering av betingelser for bruk i fremtidige analyser. Av notatet, for Legionella særlig bruk av en belastning bakgrunn med natively lavere vertscelle cytotoksisitet (en flag mutant) ⁸ bidratt vesentlig til den høye analysen robusthet oppnådd. Videre oversettelse av dual-avlesning teknikken til andre intracellulære, patogen-vertssystemer kan også kreve ytterligere justeringer av infeksjon protokollen. Legionella ikke vokser i vevskultur medium, slik at vi kan tilskrive økt reporter signal til intracellulær vekst alene. Men mange intracellulære patogener (for eksempel, Brucella) kan vokse i varierende grad både intracellulært og i vevskulturmedium. Derfor kan ytterligere trinn slik som gentamicin behandling og vasking av vertsceller etter første infeksjon være nødvendig å redusere ekstracellulære replikasjon og tillate selektiv undersøkelse av intracellulær replikasjonskapasitet. ²²

Analyse oppskalering til bruk i high-throughput screening og synergi testing er assosiert med sitt eget sett av utfordringer. mest spesieltly, fant vi at det store antallet J774A.1 celler som trengs kan best dyrkes i bakterie snarere enn tradisjonelle vevskulturflasker (se figur 1). Men for å opprettholde sterilitet kultur, svamp skum eller andre filterlokk for disse kolber ble funnet å foretrekke fremfor vanlige bakterielle kolbe caps. Plassering av en liten orbital shaker plattform inne i en standard vevsdyrkningsinkubator tillatt oss å utføre oppskalering kultur med utstyr på hånden. Til slutt, bruk av automatiserte dispensersystemer (figur 1A, B) mye lettere analyse oppsett og testing av kombi fortynning serien.

Spesielt tilfredsstillende påvisning av bakteriell replikasjon er avhengig av evnen til i tilstrekkelig grad å uttrykke enten et lux operonet eller fluorescerende protein i bakteriestammen av interesse. For å oppnå dette, har vi laget et sett med fluorescerende og lux operon reporter transposoner drevet av en sterk konstitutiv promoter som bør tillate facile merking av forskjellige typer bakterier (Kang og Kirby, data ikke vist). Alternativt, for patogener som har intracellulær replikasjon viser cytotoksisk for vertscellen, sanntidsmålinger cytotoksiske alene kan brukes som et surrogat for intracellulær replikasjon. Men i dette tilfellet, cytotoksiske og inaktive forbindelser kan ikke være pålitelig måte skilles i en enkelt analyse.

Tilgjengeligheten av sanntids avlesning ut gir spesiell fordel for high-throughput screening-analyser. Nærmere bestemt, unngåelse av endepunkt vurdering av bakterievekst (kolonidannende enhet bestemmelse) ⁷ og cytotoksisitet (tilsetning av cellelevedyktighet reagens ved avslutning av analysen) ^23,24 eliminerer flere eksperimentelle trinn og tilhørende arbeidskraft. Videre kan tidsforløp lett bli fulgt i de samme analyse brønner med minimal økning i eksperimentell innsats. Viktigere, tilgjengeligheten av to forskjellige typer av bakterielle replikering journalister (bakterierl lux operonet og fluorescerende protein) har særlig betydning for high-throughput screening analyse utvikling. Spesielt kan falsk positiv antimikrobiell avlesning som følge av falsk interferens med lux operon eller fluorescerende reporter utgang løses gjennom bruk av både journalister sekvensielt i komplementære ortogonale analyser i primær- og sekundærscreening, henholdsvis ^25. Spesielt, har vi funnet at bakterie lux operon var mer sensitiv reporter for bakterievekst med en omtrent 20 ganger til 100 ganger lavere deteksjonsgrense enn våre fluorescerende protein reportere. Imidlertid er lux utgang sannsynlig utsatt for flere falske positiver basert på flere genprodukter og trinn som kreves for lys. ²⁶ Mer spesifikt, i motsetning til eukaryote enkelt gen luciferase reportere, er den bakterielle lux operonet en fem-genklusteret som koder for både en to-komponent luciferase-enzym og gener for endogen syntese av luciferase substrat. Det villefornuftig derfor å bruke lux operatør reporter i en primær skjerm for å sikre tilstrekkelig følsomhet, og de fluorescerende protein journalister i videregående analyser for å sikre spesifisitet.

Til sammen metoden beskrevet gir real-time, ikke-destruktive alternativer til endepunkt analyser for å måle bakteriereplikasjon og eukaryote cytotoksisitet og representerer derfor en metodisk enkel og allsidig metode for å vurdere antimikrobielle effekter på intracellulære patogener.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.