High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Abstract

Les mesures traditionnelles d'activité antimicrobienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules eucaryotes reposent sur des tests finaux. De tels tests finaux nécessitent plusieurs étapes expérimentales supplémentaires avant une lecture, telles que la lyse cellulaire, la formation de colonies de détermination de l'unité, ou l'addition de réactifs. Lorsque vous effectuez des milliers de tests, par exemple, au cours de criblage à haut-débit, l'effort aval requis pour ces types d'essais est considérable. Par conséquent, pour faciliter la découverte antimicrobienne à haut débit, nous avons développé un essai en temps réel pour identifier simultanément des inhibiteurs de la croissance bactérienne intracellulaire et d'évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Plus précisément, la détection de la croissance bactérienne intracellulaire en temps réel a été activé par le marquage des souches bactériennes de criblage soit d' un opéron bactérien lux (1 essai de génération ^st) ou reporters de protéines fluorescentes (2 ^ème génération, le dosage orthogonales). Une membrane cellulaire imperméant, un colorant de liaison aux acides non toxiques, Nucleica également été ajouté au cours de l'infection initiale des macrophages. Ces colorants sont exclues des cellules viables. Cependant, les cellules hôtes non viables perdent l'intégrité de la membrane permettant l'entrée et le marquage fluorescent de l'ADN nucléaire (acide désoxyribonucléique). Notamment, la liaison d'ADN est associée à une forte augmentation du rendement quantique de fluorescence qui fournit une lecture à base de solution de la mort de la cellule hôte. Nous avons utilisé ce dosage combiné pour réaliser un écran à haut rendement en format microplaque, et pour évaluer la croissance intracellulaire et la cytotoxicité par microscopie. En particulier, les antimicrobiens peuvent présenter une synergie dans laquelle l'effet combiné de deux ou plusieurs agents antimicrobiens, lorsqu'il est appliqué en même temps est supérieur lorsqu'ils sont appliqués séparément. Test de synergie in vitro contre les pathogènes intracellulaires est normalement une tâche prodigieuse permutations combinatoires d'antibiotiques à différentes concentrations doivent être évaluées. Cependant, nous avons trouvé que notre analyse en temps réel combinée avec automatisé, distribution numérique technologie permitted tests de synergie facile. L' utilisation de ces approches, nous avons pu étudier systématiquement l' action d'un grand nombre des seuls antimicrobiens et en combinaison contre le pathogène intracellulaire, Legionella pneumophila.

Introduction

Pathogens qui poussent ou résident temporairement dans des compartiments intracellulaires sont difficiles à éradiquer thérapeutique. OBLIGER ou relativement obliger les agents pathogènes intracellulaires tels que Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, et Mycobacterium spp. nécessitent souvent des cours de thérapie antimicrobienne prolongée pour la guérison qui peut aller de quelques mois à voire des années. En outre, les agents pathogènes extracellulaires peuvent transitoirement occuper des niches intracellulaires et de cette façon échapper à un dégagement de cours normales de traitement antimicrobien et de sortir plus tard pour commencer de nouveaux cycles d'infection virulente. Staphylococcus aureus ¹ et uropathogènes entérobactéries ^2,3 infections sont deux exemples de plus en plus reconnus. Par conséquent, un objectif fondamental de découverte de médicament consiste à identifier de nouveaux agents antimicrobiens qui pénètrent dans les compartiments intracellulaires. Le traitement optimal pour éradiquer rapidementorganismes intracellulaires et de prévenir le développement de la résistance aux antimicrobiens par l'exposition sous-inhibitrice est particulièrement souhaitable.

À cette fin, nous avons développé une technologie de criblage à haut débit pour identifier les antimicrobiens intracellulaires-ressuage ciblant la croissance intracellulaire de l'agent pathogène du modèle, Legionella pneumophila. ⁴ observations cliniques antérieures indiquent que les tests de sensibilité aux antimicrobiens norme n'a pas prédire avec précision in vivo l' efficacité thérapeutique contre cet organisme. ⁵ Plus précisément, ce fut parce que les principales catégories d'antimicrobiens tels que les ß-lactamines et aminosides, bien que très efficace contre axéniquement cultivé Legionella, ne pénètrent pas suffisamment dans les compartiments intracellulaires où Legionella réside. ^5,6 preuves plus tard suggéré que les essais de croissance intracellulaire techniquement plus complexes de manière efficace prédit l' efficacité clinique. ⁷

Par conséquent, nous avons développé la technologie pour la détermination en temps réel de la croissance bactérienne intracellulaire. ⁶ Cela a été réalisé par l' utilisation d'une souche bactérienne modifiée par l' intégration soit une luciférase bactérienne opéron ⁸ (dosage de première génération a été décrite précédemment) , ⁴ ou protéine fluorescente ⁹ reporters (deuxième génération, le dosage orthogonaux, décrit ici) dans le chromosome bactérien. De cette façon, luminescent ou signal fluorescent fournit un substitut, la lecture en temps réel du nombre de bactéries.

Cependant, ces attributs ne traitent pas un facteur de confusion majeure dans infectio intracellulairen essais, les effets hors-cible sur les cellules hôtes. En particulier, la mort de la cellule hôte limite intrinsèquement la croissance intracellulaire et conduit à l'identification de faux positifs de l'effet antimicrobien. Comme de nombreux composés dans les bibliothèques de criblage sont cellules eucaryotes toxiques, ces faux positifs submergent vrais antimicrobiens, ce qui nécessite un grand nombre de suivi, des tests de cytotoxicité point final pour la résolution.

Ainsi, il était d'un grand intérêt pour être en mesure d'évaluer la viabilité des cellules eucaryotes et la croissance intracellulaire simultanément. En particulier, une caractéristique des cellules eucaryotes non viables est la perte d'intégrité de la membrane cellulaire. Les sondes qui testent la perméabilité de la membrane cellulaire peuvent donc être utilisés pour évaluer la viabilité cellulaire. Nous avons précédemment caractérisé l'aptitude d'une série de cellules putativement membrane, imperméants, des colorants de liaison à l'ADN fluorescent d'accès et de souiller l'ADN nucléaire des cellules mortes. ⁴ sur la liaison de l' ADN nucléaire, ces colorants présentent une forte augmentation Quantum rendement de fluorescence entraînant une augmentation de signal sur la fluorescence de la solution de fond. Par conséquent, ces colorants ont fourni une lecture quantitative de la mort cellulaire eucaryote. ⁴ Notamment, nous avons constaté que plusieurs étaient non toxiques eux - mêmes pendant la co-incubation prolongée avec les macrophages J774. Lorsqu'il est ajouté au cours de l'infection initiale, ils ont fourni en temps réel, la lecture de fluorescence de la mort cellulaire eucaryote qui peut être mesurée par un fluorimètre à microplaques ou observée au microscope.

Par conséquent, en combinant l'utilisation d'un journaliste bactérienne et non toxique, membrane-impermeant, colorants de liaison d'ADN, nous avons pu mettre au point un non-destructif, simple essai, en temps réel pour mesurer à la fois la charge bactérienne et eucaryote cytotoxicité cellulaire simultanément. Ce test nous a permis d'écran dans 384 puits format de plaque ~ 10.000 bioactifs connus, y compris ~ 250 antimicrobiens et> 240.000 petites molécules ayant une activité fonctionnellement non caractérisée par la capacité à inhiber la croissance intracellulaire deLegionella pneumophila, tandis que dans le même temps , la génération de données de cytotoxicité des cellules eucaryotes pour chaque composé. ⁶ Notre analyse des antimicrobiens connus contre la croissance intracellulaire de Legionella était l'exploration la plus complète de ce type à ce jour. ⁶

Sur la base de l'efficacité de notre format d'essai, nous avons également exploré ensuite les effets synergiques potentiels des antimicrobiens connus lorsqu'ils sont utilisés en combinaison. L'un des essais de synergie les plus courants, le dosage que l'on appelle damiers, est réalisée en évaluant la manière standard les effets combinatoires des dilutions en série de deux en deux de deux ou plusieurs agents antimicrobiens. ¹⁰ Dans ces essais, la synergie est définie par l'observation d' un effet plus important lorsque deux ou plusieurs agents antimicrobiens sont appliqués en même temps que la somme des effets de chacun appliqués séparément. Il convient de noter, jusqu'à présent, uniquement axé et les tests de synergie sélective a été réalisée contre intracellulaire Legionella pneumophila

Pour faciliter les tests de synergie, nous avons fait usage de notre temps réel la croissance intracellulaire / test de cytotoxicité eucaryote en combinaison avec la technologie de distribution numérique automatisé ^6. Cette automatisation nous a permis de distribuer des dilutions en série des composés dissous dans du DMSO ou de la solution aqueuse seuls ou en combinaison dans un format à 384 puits. ¹¹ En outre, cette technologie de traitement des liquides robuste nous a permis d'effectuer facilement une résolution plus élevée, la racine carrée de deux enfants (plutôt que la norme, une résolution inférieure, doublant) combinaisons de dilution pour atteindre des niveaux plus élevés de spécificité dans nos deux dimensions, checkerboard synergie une analyse. Cette résolution a été particulièrement précieuse pour répondre aux préoccupations en matière de synergie sur les reproductibilité lors de l' utilisation double série de dilutions ^12. Enfin, notre analyse était quantitative et aussi thervant gradations d'inhibition mesurée. En conséquence, l'essai a capturé la totalité de l'information d'inhibition, exprimables dans isocontour isobologrammes dans lequel isocontours relier les concentrations combinatoires avec des niveaux similaires d'inhibition de la croissance. ⁶ Cette stratégie a permis la visualisation de tracé des courbes dose-réponse combinatoires. Pour illustrer notre méthodologie, nous décrivons notre protocole pour effectuer ces tests et montrer des résultats représentatifs.

Protocol

1. Temps réel intracellulaires croissance et cellules eucaryotes Essai de cytotoxicité

1. Préparation de cellules hôtes (Cellules J774A.1)
   1. Les cellules de type macrophage Culture J774A.1 Mus en suspension dans RPMI 1640 avec 9% de sérum de veau fer complété. Un premier passage dans des flacons de culture tissulaire. Après que les cellules sont devenues confluentes dans 75 cm ² flacon de culture tissulaire dans 15 ml de milieu, divisé par grattage et de dilution à 65 ml avec le même type de support, dont 15 ml retourne dans le flacon de culture tissulaire et 50 ml est transféré à un 250 ml bactérienne flacon shaker.
   2. Pour la mise à l'échelle, la culture en suspension dans 250 ml et / ou 1000 flacons bactériens ml remplie à un cinquième du volume avec un milieu de culture tissulaire. Aérer en réglant la vitesse de rotation à environ 120 tours par minute. Pour une croissance constante, incuber à% exactement 5 CO ₂ et 37 ° C.
   3. Récolte des cellules quand ils atteignent une densité dans la gamme de 2,5 x 10 ⁶ cellules/ ml à 5 x 10 ⁶ cellules / ml. Assurer le pourcentage de cellules mortes (le plus facilement dosée par coloration au bleu trypan) ne dépasse pas 25%, comme les cellules mortes vont augmenter le bruit de fond dans les tests de cytotoxicité.
   4. Plaque en blanc, culture de tissus traitée, 384 puits des microplaques à 5 x 10 ⁴ cellules J774A.1 dans 30 ul de milieu de culture tissulaire par puits. Incuber microplaques pendant une nuit pour atteindre 90% de confluence le jour de l'expérience.
2. Préparation luminescent ou fluorescent Legionella pneumophila
   1. Passage L. pneumophila (LP02 :: flaA :: lux ⁸⁾ bactéries sur un milieu approprié, à savoir, tamponnée extrait du charbon de levure (BCYE) moyenne. Si vous utilisez une souche auxotrophe de thymidine, compléter le milieu avec 100 pg / ml de thymidine. Préparer des taches de bactéries pour des expériences par des organismes d'étalement en couche épaisse sur une nouvelle plaque de BCYE et l'incubation d'une journée (si d'un passage de la plaque précédente) ou deux à trois jours (si du stock congelé) pour obtenir confluentescroissance.
      1. Préparer des plaques de BCYE en dissolvant 10 g d' extrait de levure, 10 g de N - (2-acétamido) -2-aminoéthanesulfonique, 0,35 g de K ₂ HPO ₄ et 1 g de potassium monobasique α-cétoglutarate dans 950 ml d' eau déminéralisée. Ajuster le pH à 6,9 avec de l'hydroxyde de potassium (≥ 2,5 ml d'une solution de 11,9 molaires).
      2. Ajouter 15 g d'agar et 2 g de charbon activé; et porter à 1 L volume final. Ajouter une barre d'agitation magnétique et autoclave. milieu frais à 55 ° C et ajouter des solutions stérilisées par filtration contenant 0,4 g de L-cystéine et 0,42 g d'ammonium fer (III), le citrate dissous dans de l'eau déminéralisée. Utilisez l'aimant plaque d'agitation pour mélanger avant de verser des boîtes de Pétri.
      3. Pour les essais de L. pneumophila dans la croissance du milieu de croissance axénique, préparer un bouillon d'extrait ACES-levure (AYE) en combinant tous les réactifs chimiques utilisés pour BCYE sauf pour le charbon de bois et d' agar. Filtre stériliser et utiliser immédiatement ou congeler pour des expériences ultérieures.
   2. Remettre en suspension dans les organismes SAMe milieu de culture de tissu utilisé pour les cellules J774A.1 avec 100 pg / ml de thymidine complémentation selon le cas.
3. infection Macrophage
   1. Ajouter des composés d'essai d'intérêt (criblage de composés, ainsi que des contrôles positifs et négatifs pour l'inhibition de la croissance bactérienne et la lyse des cellules eucaryotes). De préférence, on dissout les solutions mères à ≥500x dans du DMSO (diméthylsulfoxyde) ou une solution aqueuse pour permettre une dilution suffisante du véhicule.
      1. Bien que les solutions d'achat d'actions peuvent être conservés congelés, éviter les cycles de gel-dégel pour les composés labiles et antimicrobien.
   2. Diluer les bactéries luminescentes à une cible de 2,5 x 10 ⁶ UFC (unité formant colonie) / m et des bactéries marqué par un rapporteur fluorescent à 1,0 x 10 ⁷ UFC / ml dans un milieu de culture tissulaire et ajouter non toxique, membrane imperméant aux acides nucléiques appropriés un colorant de liaison à 2,5x concentration analytique finale.
   3. Ajouter 20 pi de mélange pour chaque culture J774A.1 bien, le volume d'essai final50 ul, la concentration bactérienne finale 1 x 10 ⁶ UFC / ml (lux opéron reporter) ou 4 x 10 10 ⁶ UFC / ml (fluorescent reporter de la protéine).
   4. Incuber à 37 ° C pendant 1-3 jours dans 5% de _CO2 à 100% d' humidité relative pour éviter les effets de bord par évaporation.
4. Assay Readout
   1. Lire la croissance bactérienne et la toxicité des cellules eucaryotes sur un luminomètre de microplaques et fluorimètre selon le cas pour les journalistes utilisé.
      1. Pour éviter les effets de bord associé à la température, thermiquement équilibrer microplaques avant luminescence lecture par le placement dans une seule couche sur un banc de laboratoire avec des couvercles entrebâillée pendant environ 20 min (ou dans une enceinte de sécurité biologique avec des couvercles off pendant environ 10 min).
   2. Retour microplaques à incubateur si la lecture en temps réel à des points de temps plus tard, est souhaitée.

Analyse 2. Données

1. Normaliser les données à con positive et négativecommandes pour calculer pour cent ou pliez-inhibition de la croissance bactérienne intracellulaire et la cytotoxicité pour cent pour les cellules eucaryotes.
2. Pour évaluer dosage robustesse, calculer la séparation statistique entre les contrôles positifs et négatifs à la fois pour l' inhibition de la croissance bactérienne et la cytotoxicité à l' aide du facteur Z (Z ') l' analyse dans laquelle Z' = 1 - 3 (σ _p + σ _n) / | u _p + u _n |. Dans cette équation, σ σ _p et _n sont les écarts - types pour les puits témoins positifs et négatifs, respectivement; μ _p et u _n sont les valeurs moyennes des puits témoins positifs et négatifs, respectivement.
   1. Pour les essais de criblage à haut débit, calculer z-scores standard (ou autre alternative, des mesures statistiques quantitatives) pour évaluer les effets des composés d'essai d'intérêt. Vous pouvez également calculer un pli-simple réduction ou log-fold réduction comme potentiellement physiologiquement plus pertinent mesure de l'effet grandeur pour les bactéries répliquant géométriquement.

3. Simple et multi-dimensionnelle (c. -à- Synergy) dose-réponse Test et données Interprétation

1. Préparer les macrophages et les bactéries comme décrit dans la section 1 du protocole.
2. Juste avant l'infection ou l' incubation axénique, ajouter des antimicrobiens d'intérêt expérimental dans une série, doublant la série de dilution, dans le but de spanning sur le haut de gamme une concentration qui élimine complètement la croissance (ie, la concentration ou MIC minimale inhibitrice) et sur le bas mettre fin à une concentration qui ne montre aucune activité évidente.
3. Utilisez un système de manipulation de liquide automatisé pour faciliter seule dose-réponse et la configuration de test de synergie combinatoire à travers, plus direct automatisé de dilutions antimicrobiennes selon le protocole du fabricant.
4. Envisager l'utilisation de dilutions sous-doublement, par exemple,841 / 54841eq1.jpg "/> - pliez série de dilution, et le dosage réplique pour augmenter la précision et la reproductibilité des données.
5. Pour l' infection des macrophages, diluer les bactéries luminescentes pour cibler de 2,5 x 10 ⁶ CFU (colonie unité formant) / ml dans un milieu de culture de tissus. Ajouter 20 pi de mélange à chaque culture de J774A.1 bien, volume final d'essai de 50 pi, la concentration bactérienne finale 1 x 10 ⁶ UFC / ml; et incuber à 37 ° C dans 5% de _CO2 à 100% d' humidité relative.
   1. Pour les essais de croissance axénique, on dilue les bactéries luminescentes à une concentration finale de 1 x 10 ⁶ UFC / ml dans un milieu AYE, ajouter 50 ul à chaque puits d'une plaque à 384 puits et incuber à 37 ° C dans 5% de CO ₂ à 100% d'humidité relative.
6. Calculer l'indice de concentration d'inhibiteur fractionnaire pour des combinaisons antimicrobiennes qui inhibent la croissance des bactéries. Pour chaque médicament dans la combinaison (a, b,.. N), qui se traduit par une inhibition totale ou> 99% des bactéries groissance, calculer la concentration inhibitrice fractionnelle individuelle (FIC _{a, b, n...)} de la manière suivante: FIC _A = la concentration du composé "a" divisée par la concentration inhibitrice minimale de "a" par lui - même. _. En utilisant la même formule, calculer FIC _b, etc. Ensuite , calculer l'indice FIC combinatoire ou FIC = FIC _a + _b + FIC. . .FIC _N pour chaque combinaison inhibitrice.
   1. Utilisez l'index combinatoire qui dévie le plus éloigné de 1,0 pour évaluer la synergie. Considérons une coupure de ≤0.5 comme une indication prudente d'un effet synergique et ≥4, un effet antagoniste. ¹²
   2. Terrain isobologrammes, isocontour isobologrammes, et / ou isosurface isobologrammes ⁶ représentations graphiques comme alternatives d'effets combinatoires.

Representative Results

essai de croissance intracellulaire microplaque

Figure 1 schématise les étapes d'essai. Les étapes automatisées indiquées peuvent être effectuées manuellement. Cependant, le débit est grandement facilité l'utilisation de systèmes de manipulation de liquides.

La figure 2 montre des résultats représentatifs d'une microplaque de 384 puits, à double lecture, la croissance intracellulaire en temps réel et eucaryote test de cytotoxicité cellulaire en utilisant une souche Legionella (LP02) marquée soit avec un opéron lux (Figures 2A, 2B) ou mNeptune2 protéine fluorescente ( Figure 2C, 2D) reporter. les composés témoins positifs et négatifs (DMSO, des antibiotiques, saponines) ont été ajoutés aux plaques en utilisant un robot de transfert de broche pour simuler les performances dans un environnement de criblage à haut débit. Legionella significative (Figures 2A, 2C) peut être facilement distingués par rapport à la lyse saponine et des contrôles traités aux antibiotiques à 24 à 72 heures pour les bactéries luminescentes et 48 à 72 heures pour les bactéries mNeptune2 marqués, respectivement. Legionella lyses typiquement des cellules hôtes après la réplication pendant 48 à 72 h. Cela peut être apprécié dans les figures 1B et 1D, qui montrent la fluorescence de SYTOX Green (un représentant, impermeant, colorant et marqueur de l' hôte mort cellulaire liaison aux acides nucléiques) a augmenté au fil du temps. Cytotoxicité atteint finalement la quantité maximale observée dans le détergent (saponine), la cellule hôte lyse, contrôle positif. organismes mNeptune2 marqués ont été ajoutés à un inoculum quatre fois plus élevé que les bactéries opéron marqué lux, probablement représentant plus hôte rapide destruction des cellules et antérieures associées augmentation du signal de fluorescence dans des expériences mNeptune2. Comme prévu, le traitement antimicrobien efficace (lévofloxacine ou azithromycine) prevENTED croissance et hôte bactérien lyse cellulaire. A l' inverse, des composés cytotoxiques qui limitaient la croissance intracellulaire par la destruction de la cellule hôte (par exemple, la saponine) pourraient facilement être identifiés par une combinaison de faible luminescence ou mNeptune2 fluorescence, et le signal haute cytotoxicité associée. En outre, l' observation de la baisse combinée à la fois luminescence et mNeptune2 fluorescence (croissance bactérienne), et la cytotoxicité a fourni une confiance raisonnable qu'un composé est un inhibiteur de véritable croissance intracellulaire (par exemple, l' azithromycine et la lévofloxacine des contrôles positifs) plutôt que d' un faux positif résultant des interférences parasites avec signal de journaliste bactérienne.

Tableau 1 - 3 montre Z représentant »pour trois journalistes bactériennes différentes (lux opéron, mNeptune2, tdTomato) et correspondant lectures de fluorescence par rapport aux témoins. A z '> 0,5 indique une statistically robuste appropriée de dosage pour les réglages à haut débit; cependant, Z inférieur »peut convenir en fonction des objectifs expérimentaux, à savoir, la capacité de distinguer de manière fiable des effets plus ou moins subtiles de composés d'essai ou de perturbations. En fonction des résultats de la figure 2, mNeptune2 n'a pas été reporter aussi sensible que la luciférase opéron bactérien. Par conséquent, comme prévu, une différence robuste entre le signal mNeptune2 en négatif (DMSO) et positive (lévofloxacine, azithromycine, saponine) contrôles inhibiteurs de croissance n'a pas été observée jusqu'à ce jour 2 ou 3 jour d'incubation, contrairement au début, un signal raisonnablement robuste de lux bactéries opéron reporter le jour 1 après l'infection. En revanche, tdTomato, un rapporteur fluorescent bactérienne de remplacement, a montré Z suboptimale »pendant toute la durée infectieuse. caractéristiques de fluorescence suboptimales ont donné lieu à une partie de l'empiétement de l'excitation de fluorescence et d'émission queue dans la plage utilisée pour la lecture optimale des tdTomato signal. Cet empiétement peut être apprécié à partir du Z positif »trouvé dans le tdTomato saponine contre comparaison lévofloxacine (ce qui implique une différence significative dans le nombre de bactéries dans deux conditions où les bactéries ne devraient pas reproduire). Ce résultat peut être expliqué par la lyse saponine provoquant un signal de fluorescence forte, dont la queue est détectée comme tdTomato émission, et donc conduisant à une différence parasite entre la saponine et des contrôles antibiotiques. Par conséquent, alors que le lux bactérien et reporters mNeptune2 en combinaison avec la fluorescence semblent utilisables pour double lecture,, des analyses en temps réel à base de solution, la tdTomato et la combinaison de fluorescence, du moins sans autre signal mathématique déconvolution, ne fonctionne pas.

La figure 3 montre déjà publié des exemples de courbes d'antimicrobiens connus dose-réponse en utilisant lux opéron, organismes rapporteurs marqués. ⁶ Notamment, Legionella nepas croître dans un milieu de culture tissulaire. Par conséquent, la réplication des bactéries dans les tests d'infection des macrophages représente uniquement la croissance intracellulaire. Cependant, Legionella se développera axéniquement dans une faible teneur en sodium spécialisée, ACES liquides (N - (2-acétamido) -2-aminoéthanesulfonique acide) milieu d'extrait de levure. ²⁰ Ici , les effets sur la croissance intracellulaire et axénique ont été comparés. L'utilisation de ces deux systèmes de croissance, on a observé que les antimicrobiens polaires tels que les ß-lactamines (méropénem, ​​la ceftriaxone) et aminoglycosides (données non représentées) sont des inhibiteurs de la croissance de mauvaises intracellulaire, contrairement à leurs puissants effets sur la croissance axénique. On peut supposer une faible efficacité dans des essais d'infection des macrophages est basée sur une incapacité à accéder à la niche réplicative intracellulaire Legionella. En revanche, les antimicrobiens de cellules-ressuage eucaryotes tels que les quinolones (lévofloxacine) et l'azithromycine, ont démontré des effets puissants sur les bactéries intracellulaires et axéniques.

IC50 (concentration à 50% d'inhibition de la croissance bactérienne) et _CC50 (concentration qui induit 50% de mort cellulaire eucaryote) peut être déterminée et la sélectivité, _CC50 / IC ₅₀ calculé. Ces trois mesures sont des critères importants pour la progression du composé dans les efforts de découverte de médicaments. La figure 4 montre un exemple de telles courbes double dose-réponse, en réponse à la doxycycline, les données obtenues à partir des mêmes puits de contrôle dans le temps. Dans la figure 4A, le jour 1 de l' infection, sur une réplication bactérienne centuple est évidente dans les puits d'essai zéro antibiotiques par rapport aux plus hauts niveaux d'inhibition observés avec des antibiotiques. Il y avait une toxicité cellulaire eucaryote associée minimale, sauf à très haute doxycyLes concentrations cline (≥10 pg / ml). Le jour 2 (figure 4B), signal de lux bactérien était d' environ 10 fois plus grande que le jour 1 avec la cytotoxicité de réplication associée bactérienne significative observée à des concentrations faibles antimicrobiens. Comme on s'y attendait, bactérienne mort cellulaire induite par l'hôte pour la replication suit de près avec le nombre de bactéries (signal lux) pendant toute la courbe dose-réponse aux antibiotiques. À des concentrations antimicrobiennes plus élevées cytotoxicité est réduite à la ligne de base, jusqu'à ce que des concentrations très élevées, où la doxycycline apparaît à nouveau toxique observé le jour 1. Le déplacement apparent de la luminescence dose-réponse à des concentrations antimicrobiennes légèrement plus élevés par rapport aux mesures de cytotoxicité basées sur la fluorescence est quelque peu exagérée lors du traçage de la luminescence et la cytotoxicité sur des échelles de journaux et linéaires, respectivement, comme indiqué. IC ₅₀ pour la croissance bactérienne était d' environ 100 ng / ml , tandis que _CC50 était d' environ 10 pg / ml, CC50 décrits précédemment pour le traitement de la doxycycline de la lignée leucocytaire, HL-60 lignée cellulaire. ²¹ Par conséquent, la sélectivité globale déterminée dans cette expérience à double lecture a été d' environ 100.

La figure 5 montre précédemment publié isocontour isobologrammes associés à des tests de synergie à deux dimensions dans lequel les combinaisons de paires d'antimicrobiens ont été testés pour effet amélioré contre intracellulaire L. pneumophila. ⁶ Bien que isobologrammes standards relient les concentrations les plus faibles combinatoires d'antibiotiques qui inhibent complètement la croissance, nous avons opté, sur la base des données inhibitrices quantitatives disponibles, pour relier les points avec des niveaux similaires d'inhibition en utilisant isocontours. Le droit le plus isocontour dans ces diagrammes correspond à la ligne de isobologramme standard. isobologrammes concaves indiquent généralement une synergie, tandis que de la convexes generally indiquer l'indifférence ou de l'antagonisme. Des exemples de synergie (panneaux AC) et l'indifférence sont représentés (DF), dans ce cas, correspondant à des valeurs de l'indice FIC de <0,5 et ≥1, respectivement. ⁶

Fait à noter, les combinaisons de paires d'azithromycine, la minocycline et la rifampicine ont démontré une synergie. Par conséquent, ces agents ont été testés en même temps , en combinaison à trois voies comme représenté sur la figure 6 ^6. Ici, une surface a été établi pour relier les concentrations les plus faibles combinatoires des trois antimicrobiens qui ont conduit à> 99% d'inhibition de la croissance intracellulaire bactérienne. La surface de forme concave observée en soi de la synergie trois dimensions, correspond à un indice FIC faible (0,325) indiquant l'important effet de synergie.

Tableau 1: Z 'pour lux opéron-rapporter, Legionella de la comparaison des contrôles positifs et négatifs. Z 'correspondent à des points de données représentés sur la figure 2A, 2B. Ce tableau a été modifié depuis Chiaraviglio et Kirby 2014. ⁴ Positive luminescence Z '> 0,25 sont mis en évidence avec des caractères jaunes sur un fond noir.

Tableau 2: Z »pour mNeptune2-reporter, infection Legionella - comparaison des contrôles positifs et négatifs. Z 'correspondent à des points de données représentés sur la figure 2C, 2D. Positive mNeptune2 fluorescence Z '> 0,25 sont mis en évidence avec des caractères rouges.

Tableau 3: Z 'pour tdTomato-reporter, infection Legionella - comparaison des contrôles positifs et négatifs. Positive tdTomato fluorescence Z '> 0,25 sont mis en évidence avec des caractères rouges. Z positif False '> 0,25 liée à chevaucher des SYTOX vert et tdTomato émission sont mis en évidence avec des caractères verts.

Figure 1: Représentation graphique de l' installation d'essai à double-reporter. (A) replacage des cellules J774A.1 cultivées en suspension dans des boîtes de 384 puits. (B) L' addition de composés d'intérêt à microplaques. (C) L' infection simultanée et l' addition de colorants de liaison aux acides nucléiques; incubation; et la lecture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette fig ure.

Figure 2: Double, lecture en temps réel de la croissance bactérienne intracellulaire et la cytotoxicité eucaryote en format à haut débit. Correspondant des signaux de fluorescence (B) , la luminescence (A) et lors d'une infection intracellulaire de cellules J774A.1 avec lux-opéron exprimant Legionella pneumophila. Correspondant des signaux de fluorescence (D) une protéine fluorescente (C) et au cours de l' infection intracellulaire de cellules J774A.1 avec mNeptune2 exprimant Legionella pneumophila. Quatre traitements sont présentés: le contrôle de DMSO négatif ( ); le contrôle de cytotoxicité positif, la saponine ( ); et bactériens témoins d'inhibition de la croissance positive, azithromycine (tion 4 "src =" / files / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) et lévofloxacine ( ). Les points de données représentent moyenne et l'écart-type de 96 répétitions effectuées dans des plaques en double, 384 puits. Notez, les barres d'erreur de déviation standard pour certains points de données ont été minimes et donc caché à l'intérieur des points de données de symboles. Panneaux A et B ont été modifiées par Chiaraviglio et Kirby 2014. ⁴ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: exemples représentatifs d'essais unidimensionnel, dose-réponse. Les cellules ont été infectées avec J774A.1 opéron exprimant lux L. pneumophila et traités avec une série de dilutions deux fois des antimicrobiens indiqués (laBeled comme «intracellulaire»). En parallèle, l' opéron lux exprimant Legionella ont été dilués à la même concentration finale dans le milieu d'extrait de levure aces (AYE) et traité avec une série de dilutions de deux fois identiques (appelée «axénique). Luminescence a été lu deux jours après l'inoculation bactérienne et tracée en fonction de la concentration antimicrobienne. Le panneau A comprend les antimicrobiens couramment utilisés pour traiter l' infection par Legionella. Groupe B compare l' activité des différents antibiotiques macrolides. Panel C comprend plusieurs classes différentes d'antibiotiques avec différents et parfois intracellulaire et la puissance axénique contrastante. Les points de données représentent les moyennes et les écarts-types de trois puits d'essai séparés par condition. Ce chiffre a été modifié depuis Chiaraviglio et Kirby 2015. ⁶ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Figure 4: Exemple d'une double lecture, expérience dose-réponse pour déterminer IC _50, CC ₅₀ et la sélectivité. Les effets de la doxycycline sur la croissance et les cellules J774A.1 intracellulaire cytotoxicité ont été déterminés les jours 1 et 2 infection post. Les points de données représentent les moyennes et les écarts-types de trois puits d'essai séparés par condition. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Exemple de tests de synergie à deux dimensions. dil série Combinatorialutions de paires d'antimicrobiens ont été testés pour la synergie contre la croissance intracellulaire de Legionella dans les macrophages J774A.1. Isocontours lignes relient les points de pour cent d'inhibition similaire. Isobologramme la droite reliant les combinaisons avec une inhibition complète de la croissance intracellulaire (> 99% de réduction de la luminescence par rapport aux témoins non traités) et correspond à la courbe de isobologramme standard. Shading indique pour cent d'inhibition telle que délimitée par la clé de code couleur dans chaque graphique. Isocontours de gauche à droite correspondent à 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 et 1% de croissance par rapport aux témoins non traités. Ce chiffre a été modifié depuis Chiaraviglio et Kirby 2015. ⁶ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Exemple d'un essai de synergie trois dimensions. Les concentrations les plus faibles combinatoires de l'azithromycine, la minocycline et de rifampicine qui ont abouti à> 99% d'inhibition de la croissance ont été reliés pour former un tracé de la surface de isobologramme. Ce chiffre a été modifié depuis Chiaraviglio et Kirby 2015. ⁶ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous décrivons des tests en temps réel pour la détection simultanée de la croissance bactérienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules hôtes. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. D'abord, pour les performances du test robuste, il doit y avoir une séparation spectrale suffisante entre les lectures bactériennes et cytotoxicité. Une telle séparation est intrinsèque des combinaisons de reporters opéron luciférase et des colorants de liaison à l'ADN fluorescents. Cependant, sur la base de notre expérience (Tableau 1-3, Figure 2), l' utilisation de la double, la lecture fluorescente nécessite des signaux non-chevauchement fluorescents (par exemple, l' utilisation d'un reporter de la protéine fluorescente rouge lointain et vert tache d'acide nucléique) pour obtenir robuste, données à base de solution. En outre, à partir de l' expérience antérieure, pouvant être liée à l' optique disponible du lecteur ou des propriétés de fluorescence de la solution, seules taches d'ADN avec émission verte ou orange ont donné des données utilisables de cytotoxicité, c. -à- Z 'supérieur à> 0,5, une mesure indicative de strong performance du test. ⁴ Par conséquent, à base de solution, des essais à double lecture sont quelque peu contraints en termes de ce que les journalistes peuvent être utilisés.

Une autre étape critique est le rapport d'infecter les bactéries pour les macrophages. L'infection bactérienne provoque la mort de la cellule hôte. Par conséquent, un inoculum trop élevé peut conduire à la mort précoce de la cellule hôte, des niveaux relativement faibles de réplication bactérienne, et l'obscurcissement potentiel d'effets cytotoxiques directs des antimicrobiens à l'étude. Le rapport infectant approprié peut être déterminé de façon empirique et peut dépendre de la virulence de la souche bactérienne particulière à l'étude. Un faible ratio d'environ 1: 1 est un bon point de départ. Des expériences telles que celles représentées sur la figure 2 et les tableaux 1 à 3 réalisée avec plusieurs ratios d'infection permettra l' évaluation et l' optimisation des conditions d'utilisation dans des analyses futures. Il convient de noter, pour Legionella , en particulier, l' utilisation d'un fond de souche nativement inférieure cytotoxicité de la cellule hôte (un mutant de flagelline) ⁸ a contribué de manière significative à la robustesse de dosage élevé obtenu. En outre, la traduction de la technique à double lecture à d'autres intracellulaire, systèmes pathogène-hôte peut également nécessiter des ajustements supplémentaires au protocole d'infection. Legionella ne pousse pas dans un milieu de culture de tissu, ce qui nous permet d'attribuer un signal accru de reporter à la croissance intracellulaire seul. Cependant, de nombreux agents pathogènes intracellulaires (par exemple, Brucella) peuvent se développer à des degrés variables à la fois intracellulairement et dans un milieu de culture tissulaire. Par conséquent, des mesures supplémentaires telles que le traitement de la gentamicine et le lavage des cellules hôtes après l'infection initiale peut être nécessaire de réduire la réplication extracellulaire et permettre un examen sélectif de la capacité de réplication intracellulaire. ²²

Assay scale-up pour une utilisation dans des tests de dépistage et de synergie à haut débit est associé à son propre ensemble de défis. La plupart particulierly, nous avons constaté que le grand nombre de cellules J774A.1 nécessaires pourraient mieux être cultivées dans des bactéries plutôt que traditionnels flacons de culture de tissu (voir Figure 1). Toutefois, pour maintenir la culture de stérilité, de la mousse d'éponge ou d'autres bouchons de filtre pour ces flacons ont été trouvés préférable de bouchons de flacons bactériens. Placement d'une petite plate-forme agitateur orbital dans un incubateur de culture tissulaire norme nous a permis d'effectuer la culture de mise à l'échelle avec un équipement à portée de main. Enfin, l' utilisation de systèmes de distribution automatisés (Figures 1A, B) a grandement facilité l' installation et les essais des séries de dilution combinatoire essai.

Notamment, la détection adéquate de replication bactérienne repose sur la capacité à exprimer suffisamment soit un opéron lux ou une protéine fluorescente dans la souche bactérienne d'intérêt. À cette fin, nous avons créé un ensemble de transposons rapporteurs fluorescents et lux opéron entraînés par un promoteur constitutif fort qui devrait permettre à fale marquage de différents types de bactéries cile (Kang et Kirby, données non présentées). Sinon, pour les agents pathogènes dont la réplication intracellulaire prouve cytotoxique pour la cellule hôte, seul cytotoxicité des mesures en temps réel peuvent être utilisés comme un substitut pour la réplication intracellulaire. Cependant, dans ce cas, les composés cytotoxiques et inactifs ne peuvent pas être distinguées de manière fiable dans un seul essai.

La disponibilité de lecture en temps réel sur fournit un avantage particulier pour les essais de criblage à haut débit. Plus précisément, l' évitement de l' évaluation du point final de la croissance bactérienne (colony forming de détermination de l' unité) ⁷ et la cytotoxicité (addition du réactif de viabilité cellulaire à la fin de dosage) ^23,24 élimine plusieurs étapes expérimentales et de travail associé. De plus, les temps peuvent facilement être suivies dans les mêmes puits d'essai avec une augmentation minimale de l'effort expérimental. Fait important, la disponibilité de deux types distincts de reporters de réplication bactériennes (bactériesl opéron et protéine fluorescente lux) revêt une importance particulière pour le développement à haut débit de test de dépistage. Plus précisément, fausse lecture antimicrobien positif résultant des interférences parasites avec opéron lux ou de sortie de rapporteur fluorescent peut être traitée grâce à l' utilisation des deux reporters séquentiellement dans des essais orthogonaux complémentaires dans le dépistage primaire et secondaire, respectivement ^25. Notamment, nous avons trouvé que le lux opéron bactérien était le journaliste plus sensible de la croissance bactérienne avec une 20 fois à peu près à 100 fois la limite de détection inférieure à nos reporters de protéines fluorescentes. Cependant, la production lux est susceptible soumis à des faux positifs plus sur la base de plusieurs produits géniques et les étapes nécessaires à la production de lumière. ²⁶ Plus spécifiquement, contrairement aux eucaryotes simples reporters de luciférase du gène, le lux opéron bactérien est un groupe de cinq gène qui code à la fois une enzyme et les gènes de luciférase à deux composants pour la synthèse endogène du substrat de la luciférase. Il seraitsens donc d'utiliser le journaliste de l'opérateur lux dans un écran principal pour assurer une sensibilité suffisante, et les reporters de protéines fluorescentes dans des analyses secondaires pour assurer la spécificité.

Pris ensemble, la méthodologie décrite fournit en temps réel, des alternatives non destructives pour Endpoint tests pour mesurer la réplication bactérienne et la cytotoxicité eucaryote et représente simple méthodologique et méthode polyvalente pour évaluer les effets antimicrobiens sur les agents pathogènes intracellulaires donc.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.