Hög genomströmning, i realtid, med dubbla avläsning Provning av intracellulära antimikrobiell aktivitet och eukaryot cell cytotoxicitet

Abstract

Traditionella mått på intracellulär antimikrobiell aktivitet och eukaryot cell cytotoxicitet lita på endpoint analyser. Sådana endpoint analyser kräver flera ytterligare experimentella steg före avläsning, såsom cell-lys, kolonibildande enhet bestämning, eller tillsats av reagens. Vid utförande av tusentals analyser, till exempel under high-throughput screening, är den nedströms belägna ansträngning som krävs för dessa typer av analyser betydande. Därför att underlätta hög genomströmning antimikrobiell upptäckt, har vi utvecklat en realtidsanalys för att samtidigt identifiera hämmare av intracellulära bakterietillväxt och bedöma eukaryot cell cytotoxicitet. Specifikt realtid intracellulär bakterietillväxt detektering aktiveras genom att markera bakterie screening stammar med antingen en bakteriell lux-operonet (1 ^st generationen analys) eller fluorescerande protein reportrar ^{(2: a} generationens, ortogonala analys). En icke-toxisk, cellmembran impermeant, nukleinsyrabindande färgämnetillsattes också vid initial infektion av makrofager. Dessa färgämnen är uteslutna från levande celler. Men icke livsdugliga värdceller förlorar membranintegritet medger inträde och fluorescerande märkning av kärn-DNA (deoxiribonukleinsyra). Notably, DNA-bindning är förknippad med en stor ökning av fluorescerande kvantutbyte som ger en lösningsbaserad utläsning av värd celldöd. Vi har använt denna kombinerade analys för att utföra en hög genomströmning skärm i mikroformat, och för att bedöma intracellulära tillväxt och cytotoxicitet av mikroskopi. Anmärkningsvärt, kan antimikrobiella visar synergi där den kombinerade effekten av två eller flera antimikrobiella medel när de appliceras tillsammans är större än när det appliceras separat. Testning för in vitro synergi mot intracellulära patogener är normalt en ofantlig uppgift som kombinatoriska varianter av antibiotika vid olika koncentrationer skall bedömas. Vi fann emellertid att vår realtidsanalys i kombination med automatiserad, digital dispenseringsteknik permitted facile synergi testning. Med hjälp av dessa metoder, kunde vi systematiskt kartlägga inverkan av ett stort antal enbart antimikrobiella medel och i kombination mot den intracellulära patogenen, Legionella pneumophila.

Introduction

Patogener som växer eller uppe tillfälligt i intracellulära fack är svåra att terapeutiskt utrota. Förpliktigar eller förpliktigar relativt intracellulära patogener såsom Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, och Mycobacterium spp. ofta kräver långvarig kurser antimikrobiell behandling för botemedel som kan variera från månader till och med år. Dessutom kan extracellulära patogener gående ockupera intracellulära nischer och på så sätt undgå clearance av normala kurser antimikrobiell behandling och senare dyker starta nya omgångar av virulent infektion. Staphylococcus aureus ¹ och uropatogena Enterobacteriaceae ^2,3 infektioner är två alltmer erkända exempel. Därför är en grundläggande läkemedelsutveckling mål att identifiera nya antimikrobiella medel som tränger in i intracellulära fack. Optimal terapi för att snabbt utrotaintracellulära organismer och förhindra utveckling av resistens genom sub-hämmande antimikrobiella exponering är särskilt önskvärd.

För detta ändamål har vi utvecklat en high-throughput screening teknik för att identifiera intracellulära-penetrerande antimikrobiella medel som riktar sig till intracellulära tillväxten av modellen patogen, Legionella pneumophila. ⁴ Tidigare kliniska observationer tyder på att standarden resistensbestämning inte exakt hade förutsäga in vivo terapeutisk effekt mot denna organism. ⁵ Närmare bestämt var detta eftersom stora klasser av antimikrobiella medel såsom p-laktamer och aminoglykosider, men mycket effektiv mot axeniskt odlade Legionella, inte tillräckligt tränga in i intracellulära avdelningar där Legionella är bosatt. ^5,6 Senare bevis föreslog att tekniskt mer komplexa intracellulära tillväxtanalyser effektivt förutspått klinisk effekt. ⁷

Därför har vi utvecklat teknologi för realtids-bestämning av intracellulär bakterietillväxt. ⁶ Detta åstadkoms genom användning av en bakteriestam modifierad genom integration av antingen en bakteriell luciferas operon ⁸ (första generationen analysen tidigare beskrivits) ⁴ eller fluorescerande protein ⁹ reportrar (andra generationens, ortogonala analys, beskrivs här) i bakteriekromosomen. På detta sätt, självlysande eller fluorescerande signal ger ett surrogat realtid avläsning av bakteriell nummer.

Men dessa attribut inte upp en stor confounder i intracellulär infection analyser, off-target effekter på värdceller. I synnerhet död av värdcellen i sig begränsar intracellulär tillväxt och leder till falsk positiv identifiering av antimikrobiell effekt. Som många föreningar i screeningsbibliotek är eukaryota celler giftiga sådana falska positiva skulle överväldiga verkliga antimikrobiella medel, vilket kräver ett stort antal uppföljnings endpoint cytotoxicitetsanalyser för upplösning.

Således var det av stort intresse att kunna bedöma eukaryot cellviabilitet och intracellulär tillväxt samtidigt. Noterbart är en egenskap av icke-viabla eukaryota celler förlust av cellmembranintegritet. Prober som testar permeabiliteten av cellmembranet kan därför användas för att bedöma cellviabilitet. Vi tidigare karaktäriserat förmågan hos en serie av förmodat cellmembran impermeant, fluorescerande, DNA-bindande färgämnen för att få tillgång till och ge fläckar kärn-DNA av döda celler. ⁴ Den bindande nukleärt DNA, dessa färgämnen visar en stor ökning av quantum fluorescerande utbyte resulterar i ökad signal över bakgrunds lösning fluorescens. Som sådana dessa färgämnen förutsatt en kvantitativ avläsning av eukaryot celldöd. ⁴ Särskilt fann vi att flera var giftfri sig under långvarig samtidig inkubation med J774 makrofager. När läggas under den första infektionen, de tillhandahöll en realtid, fluorescerande avläsning av eukaryot celldöd som kan mätas genom en mikro fluorimeter eller observeras mikroskopiskt.

Därför genom att kombinera användning av en bakteriell reporter och giftfri, membran ogenomtränglig, DNA-bindande färgämnen, kunde vi utveckla en enkel, icke-förstörande, realtidsanalys för att mäta både bakteriehalten och eukaryota celler cytotoxicitet samtidigt. Denna analys har gjort det möjligt för oss att screena i 384-brunnar format ~ 10000 kända bioaktiva substanser inklusive ~ 250 antimikrobiella och> 240.000 små molekyler med funktionellt karaktäriserad aktivitet för förmågan att hämma intracellulär tillväxtLegionella pneumophila, medan på samma gång generera eukaryota cell cytotoxicitet data för varje förening. ⁶ Vår analys av kända antimikrobiella medel mot intracellulär tillväxt av Legionella var den mest omfattande undersökning av denna typ hittills. ⁶

Baserat på effektiviteten i vår analysformat, vi senare undersökte också de potentiellt synergistiska effekterna av kända antimikrobiella medel när de används i kombination. En av de vanligaste synergitester, den så kallade checkerboard-analysen, är standardmässigt utförs genom att bedöma kombinatoriska effekter av två-faldiga seriespädningar av två eller flera antimikrobiella medel. ¹⁰ I dessa analyser är synergi definieras av observationen av större effekt när två eller flera antimikrobiella medel används tillsammans än summan av effekterna av varje tillämpas separat. Notera hittills bara fokuserat och selektiv samverkan test utfördes mot intracellulära Legionella pneumophila

För att underlätta samverkan testning, gjorde vi användning av vår realtids intracellulär tillväxt / eukaryot cytotoxicitetsanalys i kombination med automatiserad digital dispenseringsteknik ^6. Denna automatisering möjligt för oss att dispensera seriespädningar av föreningar lösta i DMSO eller vattenlösning ensamma eller i kombination i 384-brunnsformat. ¹¹ Vidare medgivit en sådan robust flytande teknik hantering oss att enkelt utföra högre upplösning, kvadratroten av två-(snarare än den vanliga, lägre upplösning, en fördubbling) utspädnings kombinationer för att uppnå högre nivåer av specificitet i vår tvådimensionella, schack synergi analys. Resolutionen var särskilt värdefullt att ta itu med problem i samverkan fältet om reproducerbarhet när tvåfaldig spädningsserie ^12. Slutligen vår analys var kvantitativt och även finsöre mätt graderingar av inhibition. Som ett resultat, analysen fångade helheten av inhiberande informationen, som kan uttryckas i isokontur isobolograms där isocontours ansluta kombinatoriska koncentrationer med liknande nivåer av tillväxthämning. ⁶ Denna plottning strategi tillät visualisering av kombi dos-responskurvor. För att illustrera vår metodik, beskriver vi våra protokoll för att utföra dessa analyser och visar representativa resultat.

Protocol

1. Real Time Intracellulär tillväxt och eukaryot cell cytotoxicitet

1. Förbereder värdceller (J774A.1 Cells)
   1. Kultur J774A.1 Mus musculus makrofagliknande celler i suspension i RPMI 1640 med 9% järn-kompletterat kalvserum. Inledningsvis passage i vävnadsodlingskolvar. Efter det att cellerna har blivit sammanflytande i en 75 cm ² vävnadsodlingskolv på 15 ml medium, uppdelad genom skrapning och utspädning till 65 ml med samma typ av medium, varav 15 ml återförs till vävnadsodlingskolv och 50 ml överförs till en 250 ml bakteriell skakkolv.
   2. För uppskalning, kultur i suspension i 250 ml och / eller 1000 ml bakterie flaskor fyllda till en femtedel volym med vävnadsodlingsmedium. Luftas genom att ställa in rotationshastigheten på approximativt 120 varv per minut. För en stabil tillväxt, inkubera vid exakt 5% _CO2 och 37 ° C.
   3. Harvest celler när de når densitet i området 2,5 x 10 ⁶ celler/ ml till 5 x 10 ⁶ celler / ml. Säkerställa död cell procentsats (lättast analyseras genom trypan blå färgning) inte överstiger 25%, såsom döda celler kommer att öka bakgrundsbruset i cytotoxicitetsanalyser.
   4. Platta i vitt, vävnadskultur-behandlade, 384 mikrobrunnar på 5 x 10 ⁴ J774A.1 celler i 30 ^ vävnadsodlingsmedium per brunn. Inkubera mikroplattor över natten för att uppnå 90% sammanflytning på dagen för experimentet.
2. Förberedelse Självlysande eller fluorescerande Legionella pneumophila
   1. Passage L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: lux ⁸⁾ bakterier på lämpligt medium, dvs buffrat kol jästextrakt (BCYE) medium. Om du använder en tymidin auxotrof stam, komplettera medium med 100 pg / ml tymidin. Förbereda fläckar av bakterier för experiment genom att sprida organismer tjockt på en ny BCYE platta och inkubering en dag (om från en tidigare platta passage) eller två till tre dagar (om från frysta lager) för att erhålla sammanflytandetillväxt.
      1. Förbereda BCYE plattorna genom upplösning av 10 g jästextrakt, 10 g N - (2-acetamido) -2-aminoetansulfonsyra, 0,35 g K ₂ HPO _4, och en g monobasisk kalium α-ketoglutarat i 950 ml avjoniserat vatten. Justera till pH 6,9 med kaliumhydroxid (≥ 2,5 ml av 11,9 molar lösning).
      2. Tillsätt 15 g agar och 2 g aktivt kol; och ta med till en L slutlig volym. Lägg till en magnetisk omrörarstav och autoklav. Kyler mediet till 55 ° C och tillsätt filtersteriliserade lösningar innehållande 0,4 g L-cystein och 0,42 g Ammonium järn (III) citrat löstes i avjoniserat vatten. Använd magnetomrörningsplatta för att blanda före upphällningen petriskålar.
      3. För testning av L. pneumophila tillväxt i axenisk odlingsmedium, förbereda ACES-jästextrakt-buljong (AYE) genom att kombinera alla kemiska reagenser som används för BCYE exklusive träkol och agar. Filter sterilisera och använd omedelbart eller frysa för senare experiment.
   2. Resuspendera organismer i samig vävnadsodlingsmedium som används för J774A.1-celler med 100 | ig / ml tymidin tillskott som är lämpligt.
3. makrofag Infektion
   1. Lägg testföreningar av intresse (screening av föreningar, och positiva och negativa kontroller för bakterietillväxthämning och eukaryota celler lys). Företrädesvis upplösa stamlösningar vid ≥500x i DMSO (dimetylsulfoxid) eller en vattenlösning för att ge tillräcklig utspädning av fordonet.
      1. Även stamlösningar kan förvaras fryst, undvika frys-tö cykler för labila föreningar och antimikrobiella medel.
   2. Späd luminescenta bakterier att rikta av 2,5 x 10 ⁶ CFU (kolonibildande enhet) / m och fluorescerande reportermärkta bakterier till 1,0 x 10 ⁷ CFU / ml i vävnadsodlingsmedium och tillsätt lämplig icke-toxisk, membran impermeant, nuklein syra- bindande färgämnet vid 2,5x slutlig analyskoncentration.
   3. Tillsätt 20 pl av blandningen till varje J774A.1 odlingsbrunn, slutlig analysvolym50 il, slutlig bakteriekoncentration 1 x 10 ⁶ CFU / ml (lux-operon reporter) eller 4 x 10 10 ⁶ CFU / ml (fluorescerande protein reporter).
   4. Inkubera vid 37 ° C under 1-3 dagar i 5% _CO2 vid 100% relativ fuktighet för att förhindra avdunstningskanteffekter.
4. assay Readout
   1. Läs bakterietillväxt och eukaryot celltoxicitet på en mikro luminometer och fluorimeter som är lämpligt för reportrar som används.
      1. För att undvika temperatur tillhörande kanteffekter, termiskt jämvikt mikro före luminiscens läsning genom placering i ett enda lager på en laboratoriebänk med lock på glänt för cirka 20 minuter (eller i ett biologiskt säkerhetsskåp med lock av cirka 10 minuter).
   2. Återgå mikroplattor för att inkubator om realtidsavläsning vid senare tidpunkter önskas.

2. Dataanalys

1. Normalisera data till positiva och negativa konkontroller för att beräkna procent eller fold-hämning för intracellulär bakterietillväxt och procent cytotoxicitet för eukaryota celler.
2. För att bedöma analys robusthet, beräkna statistisk separation mellan positiva och negativa kontroller för både bakterietillväxthämning och cytotoxicitet med hjälp av Z-faktor (Z ") analys där Z '= 1-3 (σ _p + σ _n) / | | j _p + | j _n |. I denna ekvation, σ _p och σ _n är standardavvikelserna för de positiva och negativa kontrollbrunnar, respektive; μ _p och | j _n är medelvärden för de positiva och negativa kontrollbrunnar, respektive.
   1. För hög genomströmning screeningsanalyser, beräkna standard z-poäng (eller annat alternativ, kvantitativa statistiska mått) för att bedöma effekterna av testföreningar av intresse. Alternativt beräkna en enkel fold-minskning eller logga-faldig minskning som en potentiellt fysiologiskt mer relevant effektmått storlek för geometriskt repliker bakterier.

3. Single och Multi-dimensionell (dvs Synergy) Dos-respons Test och tolkning av data

1. Förbered makrofager och bakterier som beskrivs i protokoll avsnitt 1.
2. Strax före infektion eller axenisk inkubation, till antibiotika av experimentell intresse i en serie, en fördubbling spädningsserie, med målet att spänner på den övre delen en koncentration som helt eliminerar tillväxt (dvs den minimala hämmande koncentrationen eller MIC) och den låga avsluta en koncentration som visar någon uppenbar aktivitet.
3. Använda ett automatiserat vätskehanteringssystem för att underlätta enkel dos-respons och kombinato synergi testning inställning genom direkt, automatiserad tillsats av antimikrobiella utspädningar enligt tillverkarens protokoll.
4. Överväga användning av under fördubbling utspädningar, till exempel,841 / 54841eq1.jpg "/> - faldig spädningsserie, och analysen replikerar att öka noggrannheten och reproducerbarhet av data.
5. För makrofager infektion, späd självlysande bakterier att rikta av 2,5 x 10 ⁶ CFU (kolonibildande enhet) / ml i vävnadsodlingsmedium. Tillsätt 20 pl av blandningen till varje J774A.1 odlingsbrunn, slutlig analysvolym 50 pl, slut bakteriell koncentration 1 x 10 ⁶ CFU / ml; och inkubera vid 37 ° C i 5% _CO2 vid 100% relativ fuktighet.
   1. För axenisk tillväxt testning, späd luminescenta bakterier till slutlig koncentration av 1 x 10 ⁶ CFU / ml i AYE medium, tillsätt 50 | il till varje brunn i en 384-brunnars platta och inkubera vid 37 ° C i 5% _CO2 vid 100% relativ fuktighet.
6. Beräkna fraktionerad inhibitorkoncentrationen index för antimikrobiella kombinationer som hämmar bakterietillväxt. För varje läkemedel i kombinationen (a, b,.. N) som resulterar i fullständig eller> 99% hämning av bakteriell gTILLVÄXT, beräkna den individuella fraktionerad inhiberande koncentration (FIC _{a, b, n...)} enligt följande: FIC _a = den koncentration av föreningen "a" dividerad med koncentrationen minimal inhibitor av "a" av sig själv. _. Genom att använda samma formel, beräkna FIC _b etc. Sedan beräknar kombi FIC index eller FIC = FIC _a + FIC _b +. . .FIC _N för varje hämmande kombination.
   1. Använda kombinatoindex som avviker längst bort från 1,0 för att bedöma synergi. Betrakta en cutoff av ≤0.5 som en konservativ indikation på en synergistisk effekt och ≥4, en antagonisteffekt. ¹²
   2. Plot isobolograms, isokontur isobolograms, och / eller isosurface isobolograms ⁶ som alternativa grafiska representationer av kombinatoriska effekter.

Representative Results

Mikroplattan intracellulära tillväxtanalys

Figur 1 visar i diagramanalyssteg. De automatiserade stegen som visas kan utföras manuellt. Dock är genomströmningen underlättas avsevärt med hjälp av system vätskehantering.

Figur 2 visar representativa resultat från en 384-brunnars mikroplatta, dual-avläsning i realtid intracellulära tillväxt och eukaryot cell cytotoxicitet analys med användning av en Legionella-stam (LP02) märkt med antingen en lux-operonet (figurerna 2A, 2B) eller mNeptune2 fluorescerande protein ( Figur 2C, 2D) reporter. Positiva och negativa kontrollföreningar (DMSO, antibiotika, saponin) sattes till plattorna genom användning av en tapp överföringsrobot för att simulera prestanda i en high-throughput screening inställning. betydande Legionella (figurerna 2A, 2C) kan lätt skiljas i jämförelse med saponin lys och antibiotikabehandlade kontroller vid 24 till 72 timmar för självlysande bakterier och 48 till 72 timmar för mNeptune2-märkta bakterier, respektive. Legionella lyserar typiskt värdceller efter replikera för 48-72 timmar. Detta kan inses i figurerna 1B och 1D, som visar ökad fluorescens av Sytox Green (en representant, impermeant, nukleinsyrabindande färgämne och markör för värd celldöd) över tid. Cytotoxicitet når så småningom den maximala belopp som observerats i tvättmedel (saponin), värdcell lys, positiv kontroll. mNeptune2-märkta organismer tillsattes vid en fyrfaldigt högre inokulat än lux Operon märkta bakterier, sannolikt står för snabbare värd celldöd och tidigare tillhörande ökning av fluorescenssignal i mNeptune2 experiment. Som väntat, effektiv antimikrobiell behandling (levofloxacin eller azitromycin) föregåendeterade både bakterietillväxt och värdcell-lys. Omvänt, cytotoxiska föreningar som begränsade intracellulär tillväxt genom förstörelse av värdcellen (t.ex. saponin) kan lätt identifieras genom en kombination av låg luminiscens eller mNeptune2 fluorescens, och hög cytotoxicitet associerad signal. Dessutom observation av kombinerad minskning av både luminiscens och mNeptune2 fluorescens (bakterietillväxt), och cytotoxicitet förutsatt rimlig säkerhet att en förening är en sann intracellulär tillväxtinhibitor (t.ex. azitromycin och levofloxacin positiva kontroller) snarare än ett falskt positivt till följd av falska störningar med bakteriell reportersignal.

Tabell 1-3 visar representativa Z "för tre olika bakterie reportrar (lux-operonet, mNeptune2, tdTomato) och motsvarande fluorescens avläsningen i förhållande till kontrollerna. En Z '> 0,5 indikerar ett statistically robust analys lämplig för hög genomströmning inställningar; emellertid kan lägre Z 'vara lämpliga beroende på experimentella mål, det vill säga, förmågan att på ett tillförlitligt sätt skilja mer eller mindre subtila effekter av testföreningar eller störningar. Baserat på resultaten från figur 2, mNeptune2 var inte lika känslig reporter som bakterie luciferas operonet. Därför, som väntat, en robust skillnad mellan mNeptune2 signal i negativ (DMSO) och positiv (levofloxacin, azitromycin, saponin) styr tillväxthämmare observerades inte förrän dag 2 eller dag 3 av inkubation, i motsats till tidigt rimligt robust signal av lux operon reporter bakterier på dag 1 efter infektion. Däremot tdTomato en alternativ bakteriell fluorescerande reporter, visade suboptimal Z "i hela smitt kursen. Suboptimala fluorescerande egenskaper resulterade i en del från intrång av fluorescens excitation och emissions svans i intervallet används för optimal avläsning av tdTomato signal. Detta ingrepp kan uppskattas från den positiva Z "finns i tdTomato saponinen mot levofloxacin jämförelse (vilket innebär en signifikant skillnad i antalet bakterier under två villkor där bakterier inte replikera). Detta resultat kan förklaras av saponin lys orsakar en stark fluorescenssignal, vars svans detekteras som tdTomato utsläpp, och därför leder till en falsk skillnad mellan saponinen och antibiotiska kontroller. Därför, medan bakterie lux och mNeptune2 reportrar i kombination med fluorescens förefaller användbar för dual-avläsning, lösningsbaserade, realtidsanalyser, det tdTomato och fluorescens kombination, åtminstone utan ytterligare matematisk signal avfaltning, inte.

Figur 3 visar tidigare publicerade exempel på dos-responskurvor med kända antimikrobiella medel med användning av lux-operonet, reporter-märkta organismer. ⁶ Framför allt gör Legionellainte växa i vävnadsodlingsmedium. Därför replikering av bakterier i makrofager infektionsanalyser utgör enbart intracellulär tillväxt. Dock kommer Legionella växa axeniskt i ett specialiserat, låg natrium, flytande ACES (N - (2-acetamido) -2-aminoetansulfonsyra) jästextraktmedium. ²⁰ Här effekter på intracellulära och axenisk tillväxten jämfördes. Med hjälp av dessa två tillväxtsystem, observerade vi att polära antimikrobiella såsom p-laktamer (meropenem, ceftriaxon) och aminoglykosider (data visas ej) är dåliga inhibitorer av intracellulär tillväxt, i motsats till sina kraftfulla effekter på axenisk tillväxt. Förmodligen dålig effektivitet i makrofager infektions analyser bygger på en oförmåga att få tillgång till den intracellulära Legionella replika nisch. Däremot eukaryota cellpenetrerings antibiotika såsom kinoloner (levofloxacin) och azitromycin visat potenta effekter på både intracellulära och axenisk bakterier.

IC50 (koncentration för 50% bakterietillväxthämning) och CC ₅₀ (koncentration som inducerar 50% eukaryot celldöd) kan bestämmas, och selektivitet, CC ₅₀ / _IC50, beräknas. Alla tre åtgärder är viktiga kriterier för förening progression i läkemedelsforskning. Figur 4 visar ett exempel på sådana dubbla, dos-responskurvor som svar på antibiotika doxycyklin, data som erhållits från samma kontrollbrunnar över tiden. I figur 4A, dag 1 av infektion, ett hundratal gånger bakteriell replikering är uppenbar i noll antibiotiska testbrunnarna jämfört med de högsta nivåerna av hämning observerades med antibiotika. Det var minimal tillhörande eukaryot celltoxicitet utom vid mycket hög doxycyCline koncentrationer (≥10 | ig / ml). På dag 2 (fig 4B), bakteriell lux signalen var approximativt 10-faldigt högre än dag 1 med betydande bakteriell replikationsassocierade cytotoxicitet observerades vid låga antimikrobiella koncentrationer. Som väntat, spårar bakteriell replikation-inducerad värd celldöd nära med bakterieantal (lux signal) under hela den antimikrobiella dos-responskurvan. Vid högre antimikrobiella koncentrationer cytotoxicitet reduceras till baslinjen, tills mycket höga koncentrationer, där doxycyklin igen verkar giftiga som observerades på dag 1. Den skenbara förskjutning av luminiscens dos-respons mot något högre antimikrobiella koncentrationer jämfört med fluorescensbaserade cytotoxicitet mätningar är något överdriven när rita luminiscens och cytotoxicitet på log och linjära skalor, respektive, som visas. IC ₅₀ för bakterietillväxt var approximativt 100 ng / ml, medan CC ₅₀ var cirka 10 | j, g / ml, 50 beskrivits tidigare för doxycyklin behandling av leukocyt härstamning, HL-60-cellinjen. ²¹ Därför totala selektivitet bestäms i denna dubbla avläsning experiment var cirka 100.

Figur 5 visar tidigare publicerats isokontur isobolograms samband med tvådimensionella synergitester där parvisa kombinationer av antibiotika testades för ökad effekt mot intracellulära L. pneumophila. ⁶ Även om vanliga isobolograms ansluta de lägsta kombi koncentrationer av antibiotika som fullständigt hämmar tillväxten, vi valde, baserat på tillgängliga kvantitativa hämmande uppgifter, för att ansluta punkter med liknande nivåer av hämning med hjälp av isocontours. Längst till höger isokontur i dessa diagram motsvarar standard isobologram linjen. Konkava isobolograms indikerar generellt samverkan, medan konvex isobolograms generally anger likgiltighet eller antagonism. Exempel på synergi (paneler AC) och likgiltighet visas (DF), i detta fall motsvarande index FIC-värdena för <0,5 och ≥1 respektive. ⁶

Notera parvisa kombinationer av azitromycin, minocyklin, och rifampicin visade synergi. Följaktligen är dessa medel testas tillsammans i tre-vägskombination såsom visas i figur 6 ^6. Här var en yta dras att ansluta de lägsta kombi koncentrationer av de tre antimikrobiella som ledde till> 99% hämning av bakteriell intracellulär tillväxt. Den observerade konkav-formad yta, i sig tyder på tredimensionella synergi, motsvarade ett lågt FIC-index (0,325) tyder på någon betydande synergieffekt.

Tabell 1: Z "för lux-operonet-rapporter, Legionella Infektions- jämförelse av positiva och negativa kontroller. Z 'motsvarar datapunkter som visas i fig 2A, 2B. Denna tabell har ändrats från Chiaraviglio och Kirby 2014. ⁴ Positiv luminiscens Z> 0,25 är markerade med gula tecken på en svart bakgrund.

Tabell 2: Z "för mNeptune2-reporter, Legionella infektion - jämförelse av positiva och negativa kontroller. Z 'motsvarar datapunkter som visas i Figur 2C, 2D. Positiva mNeptune2 fluorescens Z> 0,25 är markerade med röda tecken.

Tabell 3: Z 'för tdTomato-reporter, Legionella infektion - jämförelse av positiva och negativa kontroller. Positiv tdTomato fluorescens Z> 0,25 är markerade med röda tecken. Falskt positiv Z '> 0,25 i samband med överlappande Sytox grön och tdTomato utsläpp är markerade med gröna tecken.

Figur 1: Pictorial representation av dubbla reporter assay setup. (A) omstryka av J774A.1 celler odlade i suspension i 384 brunnar. (B) Tillsats av föreningar av intresse för mikroplattor. (C) Samtidig infektion och tillsats av nuklein-syrabindande färgämnen; inkubation; och avläsning. Klicka här för att se en större version av denna figur ure.

Figur 2: Dual realtid avläsning av intracellulära bakterietillväxt och eukaryota cytotoxicitet i hög genomströmning format. Motsvarande luminiscens (A) och fluorescent (B) signaler under intracellulär infektion av J774A.1-celler med lux-operon-uttryck Legionella pneumophila. Motsvarande fluorescerande protein (C) och fluorescerande (D) signaler under intracellulär infektion av J774A.1-celler med mNeptune2-uttryck Legionella pneumophila. Fyra behandlingar visas: negativ DMSO kontroll ( ); positiv cytotoxicitet kontroll, saponin ( ); och positiva bakteriella tillväxthämningskontroller, azitromycin (tion 4 "src =" / filer / ftp_upload / 54.841 / 54841eq4.jpg "/>) och levofloxacin ( ). Datapunkter representerar medelvärdet och standardavvikelsen för 96 replikat utförs i två exemplar, 384-brunnsplattor. Observera standard barer deviationsfelet för vissa datapunkter var minimal och därför gömd i datapunktsymboler. Paneler A och B har ändrats från Chiaraviglio och Kirby 2014. ⁴ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Representativa exempel på en endimensionell, dos-responsanalyser. J774A.1-celler infekterades med lux-operon-uttryckande, L. pneumophila och behandlades med en tvåfaldig spädningsserie av angivna antimikrobiella medel (laBeled som "intracellulära"). Parallellt lux operon-uttryckande, var Legionella utspäddes till samma slutkoncentration i ess jästextraktmedium (AYE) och behandlades med en identisk, två-faldig utspädningsserie (märkt som "axenisk '). Luminescence lästes två dagar efter bakteriell ympning och avsattes mot antimikrobiell koncentration. Panel A innehåller antimikrobiella medel som vanligtvis används för att behandla Legionella infektion. Panel B jämför aktiviteten hos olika makrolidantibiotika. Panel C innehåller flera olika klasser av antimikrobiella medel med varierande och ibland kontrasterande intracellulära och axenisk potens. Datapunkter representerar medelvärden och standardavvikelser för tre separata testbrunnar per tillstånd. Denna siffra har modifierats Chiaraviglio och Kirby 2015. ⁶ Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

Figur 4: Exempel på en dual-utläsning, dos-respons-experiment för att bestämma _{IC50, CC50} och selektivitet. Effekterna av doxycyklin på intracellulär tillväxt och J774A.1 cellcytotoxicitet bestämdes på dag 1 och 2 efter infektion. Datapunkter representerar medelvärden och standardavvikelser för tre separata testbrunnar per tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Exempel på tvådimensionella synergi analyser. Kombinato seriell dilutions av par av antibiotika testades för samverkan mot intracellulär tillväxt av Legionella i J774A.1 makrofager. Isocontours linjer ansluter punkter liknande procentuell inhibering. Den längst till höger isobologram ansluter kombinationer med fullständig intracellulära tillväxthämning (> 99% luminiscens minskning jämfört med obehandlade kontroller) och motsvarar standard isobologram tomt. Skuggning anger procent inhibition som avgränsas av färgkodade nyckeln i varje kurva. Isocontours från vänster till höger motsvarar 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 och 1% tillväxt i förhållande till obehandlade kontroller. Denna siffra har modifierats Chiaraviglio och Kirby 2015. ⁶ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Exempel på en tredimensionell synergi-analysen. De lägsta kombi koncentrationer av azitromycin, minocyklin och rifampicin som resulterade i> 99% tillväxthämning anslöts för att bilda ett isobologram yta tomt. Denna siffra har modifierats Chiaraviglio och Kirby 2015. ⁶ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi beskriver realtids analyser för samtidig detektion av intracellulära bakterietillväxt och värdcell cytotoxicitet. Det finns flera viktiga steg i protokollet. Först för robust analysprestanda, måste det finnas tillräckligt spektral separation mellan bakterie- och cytotoxicitet avläsning. En sådan separation är inneboende för kombinationer av luciferas Operon reportrar och fluorescerande DNA-bindande färgämnen. Baserat på vår erfarenhet (Tabell 1-3, Figur 2), användning av dubbla kräver fluorescerande avläsning icke-överlappande fluorescenssignaler (t.ex. användning av en långt röd fluorescerande protein reporter och grön nukleinsyra fläcken) för att få robust, lösningsbaserade data. Vidare från tidigare erfarenhet, eventuellt i samband med tillgängliga läsare optik eller lösning fluorescensegenskaper, endast DNA-fläckar med grön eller orange utsläpp gav användbara data för cytotoxicitet, dvs Z "är större än> 0,5, ett mått som indikerar strong analysens prestanda. ⁴ Därför lösningsbaserade, dubbla avläsningsanalyser något begränsad i termer av vad reportrar kan användas.

Ett annat kritiskt steg är förhållandet mellan infekterande bakterier till makrofager. Bakteriell infektion inducerar värd celldöd. Därför kan för hög ett inokulum leda till tidig värd celldöd, relativt låga nivåer av bakteriell replikation, och potentiell förvirring av direkta cytotoxiska effekterna av antimikrobiella medel som undersöks. Den lämpliga infekterande förhållandet kan bestämmas empiriskt och kan bero på virulens hos den särskilda bakteriestam som studeras. Ett lågt förhållande av ca 1: 1 är en bra startpunkt. Experiment som de som visas i figur 2 och tabellerna 1-3 utfördes med flera infektionsförhållanden gör att utvärdering och optimering av villkoren för användning i framtida analyser. Notera, för Legionella i synnerhet, användning av en stam bakgrund med nattivt lägre värdcell cytotoxicitet (en flagellin mutant) ⁸ i hög grad bidragit till den höga analys robusthet erhållas. Vidare översättning av dubbla avläsning teknik till andra intracellulära, patogen-värdsystem kan också kräva ytterligare justeringar av infektionsprotokollet. Legionella växer inte i vävnadsodlingsmedium, vilket tillåter oss att tillskriva ökad reporter signal till intracellulära tillväxt ensam. Men många intracellulära patogener (t.ex. Brucella) kan växa i varierande grad både intracellulärt och i vävnadsodlingsmedium. Därför kan ytterligare steg såsom gentamicin behandling och tvätt av värdceller efter initial infektion vara nödvändigt att minska extracellulär replikation och tillåta selektiv undersökning av intracellulär replikationskapacitet. ²²

Analys skala upp för användning i high-throughput screening och samverkan tester i samband med sin egen uppsättning utmaningar. mest särskiltly, fann vi att det stora antalet J774A.1 celler som behövs bäst kunde odlas i bakteriella snarare än traditionella kolvar för vävnadsodling (se figur 1). Emellertid, för att upprätthålla kulturen sterilitet, svamp skum eller andra filterlock för dessa kolvar befanns att föredra framför vanliga bakteriella kolvlock. Placering av en liten skakapparat plattform i en vanlig vävnadsodling inkubator möjligt för oss att utföra skala upp odling med utrustning till hands. Slutligen, användning av automatiserade dispenseringssystem (figurerna 1A, B) i hög grad underlättas analys installation och provning av kombispädningsserie.

Noterbart är tillräcklig detektering av bakteriell replikering bygger på förmågan att tillräckligt uttrycka antingen en lux-operon eller fluorescerande proteinet i bakteriestammen av intresse. För detta ändamål har vi skapat en uppsättning av fluorescerande och lux Operon reporter transposoner som drivs av en stark konstitutiv promotor som bör göra det möjligt facile märkning av olika typer av bakterier (Kang och Kirby, data visas ej). Alternativt, för patogener vars intracellulär replikering bevisar cytotoxiska för värdcellen, i realtid cytotoxicitet mätningar enbart kan användas som ett surrogat för intracellulär replikering. Men i det här fallet, cytotoxiska och inaktiva föreningar kan inte säkert skiljas i en enda analys.

Tillgängligheten i realtid avläsning ut ger särskild fördel för hög genomströmning screeningsanalyser. Specifikt undvikande av endpoint bedömning av bakterietillväxt (kolonibildande enhet bestämning) ⁷ och cytotoxicitet (tillägg av cellviabilitet reagens vid uppsägning av analys) ^23,24 eliminerar flera experimentella steg och tillhörande arbetskraft. Dessutom kan tidsförlopp lätt följas i samma analysbrunnar med minimal ökning i experimentell ansträngning. Viktigt är att tillgängligheten av två olika typer av bakteriella replikerings reportrar (bakterierl lux-operonet och fluorescerande protein) har särskild betydelse för high-throughput screening analysutveckling. Specifikt kan falskt positiva antimikrobiell avläsning till följd av falska störningar med lux-operon eller fluorescerande reporter utgång lösas genom användning av båda reportrar sekventiellt i kompletterande ortogonala analyser i primär och sekundär screening, respektive ^25. Noterbart fann vi att bakterie lux-operonet var känsligare reporter av bakterietillväxt med en ungefär 20-faldigt till 100 gånger lägre detektionsgränsen än våra fluorescerande protein reportrar. Dock är lux utgång sannolikt föremål för fler falska positiva baserat på flera genprodukter och steg som krävs för ljusflöde. ²⁶ Mer specifikt, i motsats till eukaryotiska enda gen luciferas reportrar, är den bakteriella lux-operonet en fem-genkluster som kodar både en två-komponent luciferas enzym och gener för endogen syntes av luciferas-substrat. Det skullevettigt därför använda lux operatören reporter i en primär skärm för att säkerställa tillräcklig känslighet, och det fluorescerande proteinet reportrar i sekundära analyser för att säkerställa specificitet.

Sammantaget den metod som beskrivs ger realtids, icke-destruktiva alternativ till slutpunkt analyser för att mäta bakteriell replikering och eukaryota cytotoxicitet och representerar en metod enkel och mångsidig metod för att bedöma antimikrobiella effekter på intracellulära patogener därför.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.