Summary
Este protocolo descreve a forma de avaliar a expressão de uma grande variedade de genes ao nível clonal. De uma única célula RT-qPCR produz resultados altamente confiáveis, com uma forte sensibilidade para centenas de amostras e genes.
Abstract
a expressão do gene heterogeneidade é uma característica interessante para investigar em populações linfóides. A expressão de genes nestas células varia durante a activação celular, stress, ou a estimulação. Unicelular expressão do gene multiplex permite a avaliação simultânea de dezenas de genes 1, 2, 3. Ao nível de uma única célula, a expressão do gene multiplex determina população heterogeneidade 4, 5. Ele permite a distinção de heterogeneidade da população determinando tanto a mistura provável de diversas fases precursoras entre células maduras, e também a diversidade de respostas celulares a estímulos.
Células linfóides inatos (ILC) foram recentemente descritas como uma população de efectores inatos da resposta imunitária 6, 7. Neste protocolo, a heterogeneidade célula do ILC elecompartimento Patic é investigada durante a homeostase.
Atualmente, a técnica mais utilizada para avaliar a expressão do gene é RT-qPCR. Esta expressão do gene método mede apenas um gene de cada vez. Além disso, este método não é possível estimar a heterogeneidade de expressão de gene, uma vez que várias células são necessários para um teste. Isto leva-se à medição da expressão do gene da média da população. Ao avaliar um grande número de genes, RT-qPCR torna-se um, e método de tempo- reagent-, consumindo-amostra. Assim, os trade-offs limitar o número de genes ou populações de células que podem ser avaliados, aumentando o risco de perder a imagem global.
Este manuscrito descreve como multiplex de uma única célula de RT-qPCR pode ser utilizada para ultrapassar estas limitações. Esta técnica tem se beneficiado da recente microfluidics avanços tecnológicos 1, 2. Reações que ocorrem no multiplex chips de RT-qPCR não exceed o nível de nanoliter. Assim, a expressão do gene de uma única célula, bem como a expressão de genes múltiplos em simultâneo, pode ser realizada num reagent-, de amostra, e forma rentável. É possível testar génica em células de assinatura heterogeneidade ao nível clonal entre subconjuntos de células dentro de uma população em diferentes estágios de desenvolvimento ou sob diferentes condições de 4, 5. Trabalhando em populações raras com um grande número de condições do nível de uma única célula não é uma restrição.
Introduction
Ao longo dos últimos anos, as células linfóides inatas (CIT) têm sido cada vez mais investigada. Apesar da sua falta de receptores específicos para o antigénio, eles pertencem à linhagem linfóide e representam sentinelas importantes para a homeostase do tecido e inflamação. CIT está dividida em três grupos com base na sua expressão de combinações específicas do factor de transcrição e na sua capacidade para produzir citocinas 6, 7.
ILCs contribuir para inúmeras situações homeostáticos e fisiopatológicos em diversos órgãos através da produção de citocinas específicas 8, 9. Para ser capaz de compreender o papel destas células, é importante para determinar as várias subpopulações ILC por órgãos e identificar as suas relações de desenvolvimento. Além disso, os fenómenos de plasticidade entre os diferentes subconjuntos foram relacionados. Ao estudar a heterogeneidadedas células presentes em um órgão, é possível delimitar o seu estádio de maturação e de distinguir as suas funções específicas.
Para ilustrar a técnica de multiplex de uma única célula RT-qPCR, ILCs hepáticas foram escolhidos, com especial ênfase na sua heterogeneidade dentro do mesmo grupo ILC (tipo 1 ILC) 10. Em primeiro lugar, através do uso de citometria de fluxo, três populações distintas ILC foram caracterizados no fígado. Grupo 1 ILC representa cerca de 80% dos efectores inatos, enquanto as duas outras populações são raras populações ILC hepáticas (menos do que 5% do efectores inatos). Essas populações foram classificados usando marcadores da superfície celular amplamente expressos das populações ILC. Como resultado, as populações classificadas ILC no fígado um olhar muito semelhante a outro.
Multiplex de uma única célula RT-qPCR tem emergido como uma das melhores técnicas para investigar imediatamente a heterogeneidade dessas populações 11
Em seguida, classificando todas as células com um fenótipo ILC global, uma ampla visão geral da expressão de múltiplos genes das populações ILC fígado é obtido, apesar de representarem populações extremamente raros. Um chip à base de microfluídica permite a experimentação com aindauma pequena quantidade de material celular. Como consequência, os perfis de populações de células raras de expressão de genes pode ser obtida. Usando o software on-line assinatura gene análise, aglomerados populacionais celular e relações celulares potenciais podem ser investigadas. Consequentemente, testes de funcionamento podem ser realizados para validar os dados de agrupamento no nível in vivo.
Dezenas de expressão dos genes poderia ser avaliado concomitantemente em centenas ou mais células individuais no mesmo chip 3, 11, 12. Projeto do ensaio é a parte mais longa e mais importante do experimento. A determinação dos genes relevantes para a hipótese de ser testado é fundamental para obter resultados relevantes. Em segundo lugar, são necessários controles internos (como marcadores de superfície conhecidos utilizados para a classificação) e controles específicos. Este aspecto é crucial para testar a especificidade do iniciador de amplificação, a eficiência da amplificação, e tele ausência de concorrência primer. Por conseguinte, o trabalho com multiplex de uma única célula de RT-qPCR é uma técnica que economiza tempo, como a expressão de vários genes de uma célula é avaliado ao mesmo tempo.
Usando o mesmo chip e mistura de reagentes para todas as células limita os possíveis erros de manipulação e permite uma reprodutibilidade entre as amostras. No seu conjunto, os diferentes aspectos do multiplex de uma única célula de RT-qPCR permite a produção de resultados altamente fiáveis ao nível clonal, com um grande nível de sensibilidade para uma ampla variedade de amostras e genes. Os resultados obtidos oferecem dados poderosa e robusta para testes biostatistical.
Isto pode ser conseguido devido ao aspecto do método de microfluidos, que permite que o trabalho em muito pequenas quantidades de material e leva a resultados exaustivos. Finalmente, utilizando software de linha, é possível comparar as populações desejados.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comité de Segurança do Instituto Pasteur, de acordo com o Ministério da Agricultura francês e as orientações da UE.
1. Prepare uma placa de classificação de célula única de 96 poços
- Prepare a mistura de pré-amplificação em um tubo de 1,5 ml por adição de 5,0 mL de tampão de retro-transcrição específica, 1,3 ul de baixa ácido etilenodiaminotetracético tampão (EDTA) de TE (10 solução TE mM, pH 8, e EDTA 0,1 mM; 0,2 uM filtrada ), e 0,2 jil de polimerase de ADN de Taq por poço (Figura 1A).
- Numa placa de 96 poços, distribuir 6,5 ul de mistura de pré-amplificação em cada poço (até 48 poços). Esta placa é a placa de 96 poços a triagem de uma única célula.
NOTA: Usando uma pipeta electrónica é recomendado para este protocolo. Ele permite medições precisas e reprodutíveis de volume e economiza tempo.
2. A dissociação celular standard 3. uma única célula de células activadas por fluorescência (FACS) 4. Pré-amplificação 5. Preparar uma placa de amostra de 96 poços 6. Prepara-se uma placa de ensaio de 96 poços 7. células Single Chip Gene-expressão 8. Execute o Chip 9. Análise de Dados 
NOTA: O volume final em cada poço da placa de amostra de 96 poços devem ser de 9 ul.
NOTA: Quando utilizar os marcadores de superfície celular ILC amplamente expressas, 3 populações são definidas: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + e NKp46 - IL-7Rα +. Todas as populações são classificadas linhagem - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
NOTA: Diferentes tipos de células podem ser classificados na mesma placa de 96 poços a triagem de uma única célula (Figura 2).
NOTA: O posicionamento correcto de cada célula na placa de triagem de uma única célula de 96 poços é essencial. A disposição da placa deve ser mantido em um software de planilha. A disposição da placa será utilizado no próximo vários passos (Figura 1B) 14. Deixar um bem mistura de ensaio contendo 0,2x e mistura de pré-amplificação na placa de amostra de 96 poços sem células. Esta cavidade é utilizado como um controlo não-entrada. Deixar duas filas de 6 poços por uma diluição de ADNc. Estes poços são utilizados como controlos para a eficiência do iniciador (Figura 1b). 
Figura 3: programa de pré-amplificação. A fim de ter material suficiente, é necessário pré-amplificação de genes-alvo específicos nas células individuais ordenadas. A placa de 96 poços a triagem de uma única célula é carregada no termociclador a seguir o programa de pré-amplificação. Os produtos pré-amplificação são então diluídas com tampão TE baixo EDTA e podem ser utilizadas imediatamente ou congeladas a -20 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NOTA: Para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento dos primers, distribuir os primers para a mistura de pré-amplificação e para a 96-well placa de ensaio, ao mesmo tempo.
NOTA: Nenhum líquido deve ser derramado sobre o chip. 
Figura 4: uma única célula multiplex gene-expressão chip de carregamento. Estes passos requerem great precisão, especialmente durante a transferência da placa de 96 poços para o chip de gene-expressão múltipla de uma única célula. Para evitar erros de carregamento e extravios, é altamente recomendável para trabalhar sequencialmente. O volume necessário para cada transferência deve ser controlada durante o processo de pipetagem. Finalmente, é importante para evitar as bolhas de e para removê-los, no caso de formação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NOTA: "Default-10min-Hotstart.pcl" é o programa mais comumente usado para multiplex de uma única célula RT-qPCR.
ΔCt = amostra Ct - controle interno Ct
Dobre Alterar = 2 - (controle ΔCtsample-ΔCtnegative)
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Representative Results
populações linfóides exibir grande diversidade de expressão do gene. Neste protocolo, a heterogeneidade do fígado compartimento ILC foi investigado utilizando multiplex de uma única célula RT-qPCR expressão do gene. Ao contrário de outras técnicas de expressão de genes, de uma única célula em multiplex RT-qPCR permite a expressão do gene de trabalho em várias populações, mesmo o mais raro, ao mesmo tempo. Esta especificidade, juntamente com uma elevada sensibilidade ao nível clonal, permite a investigação de diferenças de assinaturas de genes dentro de uma população e entre populações raras. Como um exemplo, as assinaturas de gene de 3 populações ILC a partir de fígados de ratos com 4 semanas de idade foram avaliadas. Uma população é suficientemente frequentes para ser facilmente identificados, enquanto que os outros dois são raros (menos de 1% das células de linhagem negativa) no fígado.
Uma placa de triagem de uma única célula de 96 cavidades e uma placa de 96 poços de ensaio foram preparados antes da dissectio fígadon e de dissociação (Figura 1). Cada mistura foi preparado sob um capuz estéril e distribuída com uma pipeta electrónica de precisão volume e reprodutibilidade. Todos os reagentes foram agitadas antes de pipetar para manter a homogeneidade. Depois da preparação, a placa de separação de células de 96 poços pode ser congeladas até separação de células, e a placa de ensaio de células de 96 poços pode ser congelada até IFC carregamento.
Os fígados foram dissecados e dissociados em uma única célula suspensões. As células foram coradas e ordenados em placas de triagem de uma única célula de 96 poços descongelados. Utilizando FACS, 3 ILC populações foram classificados com base em marcadores ILC amplamente expressos (Figura 2). Após a separação de células, o cDNA foi sintetizado, e genes alvo específicos foram amplificados (Figura 3 e Tabela 2). Após o passo de pré-amplificação, o ADNc foi diluída num tampão de baixa EDTA TE. Os iniciadores e ADNc a partir de células isoladas foram carregados no chip IFC (Figuras 4 e 5A). Os resultados obtidos (Figura 7a) foram simplificadas para a leitura e análise (Figura 7b) mais fácil. Exemplos de fichas correctamente ou incorrectamente carregadas estão apresentados (Figura 5). A figura FAM de um chip adequadamente carregado (Figura 6), com sinais de amplificação diferentes é mostrado.
Os resultados mostram que, após separação adequada celular, a pré-amplificação e a carga, a população heterogénea ILC aparece para a expressão do gene no fígado de murganhos adultos de tipo selvagem (Figura 7). Utilizando o software on-line, assinaturas de expressão de genes específicos de células (Figuras 7 e 8) e as relações população de células (Figura 8) puderam ser identificados. Cada população classificados tem uma assinatura gene específico enriquecido na expressão do gene. Por exemplo, as células classificadas como NKp46 - IL-7Rα + tem eexpressão nriched de RORC, o fator de transcrição principal do grupo 3 CIT; Rora, um fator de transcrição -homologous RORC; e IL-23R e Cxcr6, dois receptores importantes do grupo 3 marcadores hepáticos ILC no fígado. As mesmas observações podem ser feitas com NKp46 + IL-7Rα - e NKp46 + IL-7Rα + populações. Cada célula está marcada para a expressão do gene housekeeping (o HPRT, agir e GAPDH) para excluir poços inválidos; pelo menos dois genes de manutenção deve ser expresso para considerar os valores como válido.
Curiosamente, esta técnica permite a definição de duas subpopulações de NKp46 + IL-7Rα - baseado em assinaturas de gene. As diferenças entre essas duas assinaturas tem que ser validado por outros conjuntos de diferentes experiências funcionais.
![Figura 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Figura 2: Estratégia de células FACS. As imagens são representativos de células isoladas de fígado de ratos com 4 semanas de idade. (A) FSC-A / SSC-A gating, (b) FSC-H / FSC-W discriminação gibão, (c, d, e e) vivo, CD45.2 linhagem negativa + CD4 - CD3 - células gating. (F) utilizando marcadores da superfície celular ILC amplamente expressas, definimos 3 populações: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + e NKp46 - IL-7Rα +. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: figuras ROX de adequadamente (a) E impropriamente (b) carregado fichas. (A) de células único chip multiplex gene-expressão carregada corretamente deve aparecer com linhas retas e linhas. Cada câmara de reacção é cheia e tem a mesma dimensão. (B) chip de gene-expressão Indevidamente carregado de uma única célula multiplex. Linhas vazias e filas de câmaras de reação aparecer (quadrado verde), bem como linhas de dobra (quadrado azul). Esses recursos podem ser devido a "PRIME" imprópria ou passos "Load", bem como a bolhas residuais nos poços da IFC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: FAM (Fluoresceína amidite) figura de um chip carregado corretamente. Após alguns ciclos (dependendo das amostras e no iniciador s avaliada), as diferenças de luminosidade câmara de reação deve aparecer. câmaras de reação com um sinal de amplificação deve aparecer mais brilhante (quadrado azul) do que câmaras de reação sem ou com sinais de amplificação de baixos (quadrado verde). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Mapa de calor obtido antes (A) e após (b) modificações. (A) mapa de calor direto obtido sem análise ou modificação de fim de ensaio / sample. (B) mapa de calor modificado obtido após a amostra e ensaio de definição de nome. Não há poços de entrada (quadrado azul) são obtidos se nenhuma amplificação ocorre. primers ineficientes (quadrados verdes). teste de diluição cDNA (quadrado roxo). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: célula única população clustering. Um software de análise de dados é utilizada para determinar o agrupamento entre as populações. software de clustering estão disponíveis gratuitamente on-line. Ao avaliar o perfil de expressão inteiro de uma única célula, o software pode exibir assinaturas de gene e relações população de células. Cada quadrado representa uma célula: azul são NKp46 + IL-7Rα -, vermelho são NKp46 + IL-7Rα +, e verde são NKp46- IL-7Rα +. Cada população tem uma assinatura genética específica. Dentro do NKp46 + IL-7Rα - população, duas assinaturas pode ser visto, atestando a heterogeneidade da população.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| primers | |
| ACTB | IL-23R |
| Aes | Il-2RA |
| Ahr | Il-2RB |
| Bcl2 | II-7RA |
| c-myc | Klr5 |
| Cbfb | LEF1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| CD49b | Notch1 |
| CXCR5 | Notch2 |
| Cxcr6 | Rora |
| Eomes | RORC |
| ETS1 | RUNX3 |
| FoxO1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| GATA3 | Tcf7 |
| GM-CSF | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| HPRT | Tsc22d3 |
| ID2 | Tnfrsf11a |
| Il-12rb2 | Tox |
| Il-18r1 | Zbtb16 |
| Il-1rl1 | Zbtb7b |
| IL-22 | |
Tabela 1: lista de Primer.
Tabela 2: Programa de Pré-amplificação. Cada passo do programa de pré-amplificação é mostrado com a informação completa em relação ao tempo, temperatura, e o número de ciclos.
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Discussion
Este protocolo descreve como obter a expressão do gene de informação exaustiva ao nível clonal. Aqui, nós investigamos fígado ILC heterogeneidade compartimento. Após a triagem de uma única célula de diferentes populações ILC (com base em marcadores de superfície ILC amplamente expressas), as amostras foram pré-amplificada para genes pré-selecionados específicos. Em seguida, o ADNc e os iniciadores obtidos foram carregados num chip de microfluidos de RT-qPCR multiplex. Finalmente, obteve-se a expressão de 48 genes diferentes a partir de 48 células individuais. resultados de expressão de genes foram analisados por meio de um software on-line para investigar gene assinatura e população de células relações.
A principal vantagem desta técnica é a capacidade de avaliar a expressão de genes múltiplos simultaneamente. Ele também permite o trabalho a nível clonal e sobre as populações muito raros. Ao contrário dos métodos RT-qPCR convencionais, multiplex de uma única célula RT-qPCR não tem efeito média, uma vez que a expressão do gene é avaliado a nível clonal. Assim, Heterogeneidade dentro de uma população pode ser detectada e analisada. Unicelular expressão RT-qPCR permite o trabalho em populações muito raros, uma vez que só muito poucas células são necessários para obter ampla informação sobre a expressão do gene. Além disso, diferentes populações de células pode ser testada sobre a mesma placa. Isso permite a detecção de diferenças na assinatura de genes entre populações e, com ferramentas de dados on-line, a avaliação das relações população de células. Esta técnica apresenta outras vantagens também. multiplex de uma única célula RT-qPCR tem a vantagem de os recentes avanços microfluídicos. Volumes necessários nas câmaras IFC não excedam o nível de nanoliter. Assim, menores quantidades de reagentes são utilizados, reduzindo o custo de experiências. Finalmente, o número total de passos de pipetagem é reduzida, limitando assim a possibilidade de erros de pipetagem. Os passos são simultânea para todas as células e pode ser feito com uma pipeta de canais múltiplos, permitindo que o trabalho de um modo rápido e de economia de tempo. resultados obtidos emo nível clonal são reprodutíveis, de confiança, e pode ser utilizado para realizar análises de dados robusto.
multiplex de uma única célula RT-qPCR, no entanto, apresentam algumas limitações. Em primeiro lugar, esta técnica exige equipamento caro e específico, tal como um chip de microfluidos, um controlador de chip de microfluidos, e um termociclador específica. Ao contrário dos métodos convencionais de RT-qPCR, esta técnica é tempo e de poupança de reagente, uma vez que, com RT-qPCR convencional, são necessários numerosos estudos para obter as comparações estatisticamente significativas. Neste protocolo, apresentamos um procedimento para obter a expressão do gene por 48 genes. 96-96 multiplex RT-qPCR fichas microfluidicos estão disponíveis. Estes chips podem avaliar a expressão do gene por 96 genes de 96 células ao mesmo tempo. Durante separação de células, são necessários um número mínimo de células de partida, uma vez que a precisão e pureza célula deve ser máxima. No entanto, mesmo com um pequeno número de células, ainda é possível classificar em multiplex de uma única célula de RT-qPCR exp generession (passo 3). Finalmente, multiplex de uma única célula de RT-qPCR é um método sensível. Diferentes testes devem ser realizados antes de iniciar tais experiências. Por exemplo, para a especificidade de alvo do iniciador, os iniciadores devem ser testados quanto à eficiência de amplificação e para a competição em relação ao alvo.
Vários passos do protocolo deve ser realizado com cuidado. As manipulações de pequenos volumes combinados com um grande número de amostras e ensaios ao mesmo tempo aumentar o risco de erros de pipetagem (passos 1, 4, 5, 6, e 7). Todos os reagentes e as misturas devem ser agitadas antes de pipetar, a fim de assegurar uma solução homogénea. A evaporação durante a pré-amplificação (passo 4) também podem afetar os resultados finais. As placas devem sempre ser adequadamente selados com um filme de cobertura adequada. Triagem estratégia tem de ser muito preciso (passo 3) para evitar as células mortas ou várias células em cavidades no interior das placas. FACS máquinas de triagem estão agora equipados com uma única célula de triagem index software que pode gravar qual célula específica foi classificada em cada poço. Esta nova ferramenta vai ser de interesse para a determinação de se as assinaturas de genes estão relacionados com a intensidade do marcador da superfície celular. posições de amostragem e ensaio em chips deve ser organizado meticulosamente, pois isso é essencial para a experiência (etapas 1, 5 e 6). Finalmente, a selecção de iniciadores (etapa 1 e 6) é um passo crítico. Cada iniciador deve ser seleccionado com base nos resultados descritos anteriormente ou os resultados esperados. A escolha aleatória de primários no conjunto de genes avaliados poderia prejudicar a leitura final do experimento. Além disso, os iniciadores que se correlacionam com o marcador da superfície celular utilizada para a separação de células têm que ser utilizados como controlos com genes housekeeping.
Avaliar a expressão do gene multiplex ao nível clonal oferece uma melhor caracterização do fígado compartimento heterogêneo o ILC do que na pesquisa anterior. Esta técnica, fornecido pelo software online, descreve mais precisamente a dsubconjuntos IFERENTES de ILC no fígado na homeostase do que estudos utilizando apenas marcadores da superfície celular. Além disso, é possível considerar a relações população de células e para construir redes de diferenciação. As assinaturas genéticas, com base na expressão de genes de uma única célula, também são ferramentas importantes para discernir características populacionais celular e para examinar os papéis potenciais. multiplex de uma única célula de RT-qPCR é uma das melhores técnicas para um ensaio de expressão de genes para se obter dados fiáveis. Estes dados são facilmente gerenciáveis com bioinformática software 15. No que diz respeito a outras técnicas para estudos de expressão de genes, tais como micromatrizes ou sequenciação de ARN, de uma única célula em multiplex RT-qPCR oferece alta sensibilidade. Outras abordagens para a análise de uma única célula foram descritos e podem ser usadas técnicas como complementares do multiplex de uma única célula de RT-qPCR 15, 16. Além disso, a técnica pode ser realizada com qualquer combinação de iniciadores, allowinusuários g de olhar para as assinaturas genéticas personalizados. Muitos outros aplicativos podem ser usados com esta técnica. Por exemplo, o tempo-curso expressão de genes de células ao longo do desenvolvimento pode ser feito para avaliar a modificação do perfil molecular durante o desenvolvimento. efeitos de drogas sobre as células também podem ser investigadas com diluição de droga para determinar o limiar da eficiência de drogas sobre a expressão do gene.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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