Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

单细胞基因表达利用多重RT-qPCR的表征罕见的淋巴人群的异质性

Published: January 19, 2017 doi: 10.3791/54858
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

Summary

这个协议描述如何评估在克隆水平大阵列的基因的表达。单细胞RT-qPCR的产生与数百个样品和基因的敏感性较强高度可靠的结果。

Abstract

基因表达的异质性是一个有趣的功能在淋巴人群进行调查。在这些细胞中的基因表达细胞活化，应力，或刺激过程中变化。单细胞多路复用基因表达使几十基因1，2，3的的同时评估。在单细胞水平，多重基因表达的确定群体异质4,5。它允许人口异质性通过确定双方的成熟细胞中不同的前体阶段的可能搭配，也是细胞对刺激的多样性的区别。

先天淋巴样细胞（ILC）最近已描述为免疫应答6,7的固有效应的群体。在这个协议中，国际劳工大会，他的细胞的异质性稳态期间patic隔室进行了研究。

目前，最广泛使用的技术来评估基因表达，RT-qPCR的。这种方法的措施的基因表达在一个时间只有一个基因。此外，这种方法不能估计的基因表达的异质性，因为需要一个测试多个小区。这导致了人口的平均基因表达的测量。当评估大量基因，RT-qPCR的变成了时间，试剂 - 和样品消耗的方法。因此，折衷限制了可以被评估的基因或细胞群体的数量，增加丢失全局图像的风险。

该原稿描述单细胞多重RT-qPCR的如何可以被用来克服这些限制。这项技术已经从最近的微流控技术的进步1,2受益。在多重RT-qPCR的芯片发生的反应不EXCEED纳升一级。因此，单细胞基因表达，以及同时多个基因的表达，可以以试剂 - 进行的，样品 - 和成本效益的方式。有可能在不同的发育阶段，或在不同条件4下，5群内的细胞亚群之间的克隆水平检验细胞基因标记的异质性。在罕见的人群拥有大量的在单细胞水平的条件下工作不再是一种限制。

Introduction

在过去的几年中，先天淋巴样细胞（劳工公约）已经被越来越多的研究。尽管他们缺乏抗原特异性受体，它们都属于淋巴谱系和代表组织稳态和炎症的重要哨兵。目前国际劳工公约分为基于他们的特异性转录因子组合，表达对他们产生细胞因子6,7能力三组。

国际劳工公约向众多稳态和病理情况在通过特定的细胞因子产生8,9多样器官。为了能够理解这些细胞的作用，重要的是要确定每个器官的各种ILC亚群，并确定其发展的关系。此外，不同的子集之间的可塑性现象已涉及。通过研究异质性存在于一个器官的细胞，有可能来分隔它们的成熟的阶段，并区分其特定的功能。

为了说明单细胞多重RT-qPCR的的技术，肝国际劳工公约被选择，特别强调他们的异质同ILC组（1型ILC）10中。首先，通过使用流式细胞仪的，三种不同的ILC种群特征肝脏。组1 ILC代表约80％的固有效应，而其他两个群体是罕见的肝ILC种群（先天效应小于5％）。这些人群采用ILC人群的广泛表达的细胞表面标记来分类的。其结果，排序在肝脏ILC种群看大致类似一个到另一个。

单细胞多重RT-qPCR的已经成为最好的技术之一迅速调查这些人群11的异质性

接着，通过排序具有全球ILC表型的所有细胞中，获得了肝ILC种群的多基因表达的广泛概述，即使它们代表极为罕见的人群。基于微流控芯片允许实验与连少量的细胞材料。作为结果，可以得到稀有细胞群的基因表达图谱。采用在线基因签名分析软件，细胞群簇和潜在细胞关系可以进行调查。因此，功能性测试可以被执行以验证在体内水平聚类数据。

基因表达的几十可能伴随在同一芯片3，11，12在数百或更多的单细胞进行评估。该测定的设计是在实验的最长的和最重要的部分。相关的假设要测试的基因的确定是非常重要的，以获得相关的结果。其次，需要内部控制（例如用于排序已知的表面标记）和具体的控制。这是至关重要的，以测试引物扩增特异性，扩增的效率，和叔他没有底漆的竞争。因此，与单细胞多重RT-qPCR的工作是一个省时的技术中，作为一个单元的多基因表达的同时进行评估。

使用试剂的相同的芯片和混合所有单元限制操作的可能的错误，并允许样品之间的再现性。总之，单细胞多重RT-qPCR的不同方面允许在克隆水平生产高度可靠的结果，具有灵敏度的为各种各样的样品和基因的大的水平。所得结果提供生物统计学测试功能强大且可靠的数据。

这可以是由于该方法，其允许在非常少量的物质的工作，并导致详尽结果的微流体方面来实现。最后，使用在线软件，它可以比较所需的人口。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有的动物实验是由巴斯德研究所安全委员会根据法国农业部和欧盟的指导方针批准。

1.准备96孔的单细胞分选板

  1. 通过加入5.0微升特定复古转录缓冲液，1.3微升低乙二胺四乙酸（EDTA）的TE缓冲液（10mM TE溶液，pH为8，和0.1mM EDTA的溶液的制备在1.5ml管扩增前混合; 0.2μM过滤），以及0.2微升Taq DNA聚合酶，每孔（ 图1a）的。
  2. 在一个96孔板，分发6.5微升预扩增混合物的每孔中（最多48个孔）。该板是96-孔的单细胞分选板。
    注意：使用电子移液器推荐此协议。它允许精确和可重复的体积测量并节省了时间。

图1
（a）在96孔的单细胞分选板，该预放大混合物第一分配，随后是0.2×测定混合物。 （ 二 ）每个单格位置的记录应保存在一个电子表格。良好无细胞被称为“无输入”好，并且可以作为对照。两行可以幸免于控制用cDNA稀释（顺序一个在十从10 5个细胞的相当于一个小区稀释）引物效率。 （c）在96孔测定板中，测定装载试剂第一分配，接着加入的引物。不要忘记保持每个引物位置的布局。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 通过加入1.4微升的每种引物的制备在1.5ml管中的0.2×测定混合物（引物20倍;多达48个不同的探针; 见表1）。调节最终体积至140微升的低EDTA TE缓冲液。
  2. 分发2.5微升0.2×测定混合物的对48孔中含有扩增前混合物中的96孔的单细胞分选板。
    注：在96孔样品板的每个孔中的终体积应为9微升。
  3. 密封用覆盖膜的板。涡板和自旋下来在280 XG 45秒。在-20℃保存96孔的单细胞分选板或立即使用。

2.单细胞分离

  1. 使用CO 2输送系统，由缺氧安乐死的小鼠。固定在夹层板鼠标和纵向打开腹腔用剪刀。
  2. 从恢复肝脏的国际劳工公约。
    1. 此前肝脏隔离，同花顺的LIVER-循环细胞。
      1. 带出的门静脉，移动小和大肠到鼠标的左侧;门静脉出现在腹膜腔最大静脉。
      2. 用10毫升注射器和0.45毫针刺，冲洗通过门静脉用磷酸盐缓冲的盐水中（PBS）的肝脏。为了促进肝冲洗，用剪刀剪断胃动脉。
      3. 切除胆囊，捏钳胆囊的基部，它从用剪刀肝脏分离。
      4. 为了分离肝脏，捏肝脏的基带钳，并用剪刀，肝脏从腹膜腔的其余部分分开。
      5. 用5毫升罗斯韦尔园区纪念研究所培养基（RPMI）2％胎牛血清（FCS）的转移肝脏在波特管中。
  3. 分离用杵技工分离肝脏。培养基转移到15毫升管。使总体积至14毫升的RPMI 2％FCS中。离开在冰上将细胞悬浮液15-20分钟到滗肝细胞。
  4. 使用1毫升吸管回收在一个新的15ml试管上清液（无肝细胞）（12毫升上清液可以预期）。降速，在120×g离心7分钟，在10℃。丢弃离心后上清。
  5. 悬浮于14ml密度梯度介质的在步骤2.4中得到的粒料（ 如，珀40％）。降速在600×g离心20分钟，在20℃。通过抽吸除去上清液。
  6. 重悬在1ml的醋酸钾（ACK）沉淀。留在室温下1分钟。 1分钟后，使总体积至14毫升，汉克氏平衡盐渍溶液（HBSS）2％FCS中。降速，在120×g离心7分钟，在10℃。弃去上清液。
  7. 细胞染色。
    1. 重悬300μl的生物素化抗体混合物（见材料表的沉淀;添加的所有生物素化抗体提编）和转移的细胞在1.5毫升的试管。离开它在黑暗中进行20分钟，4℃。
    2. 使总体积为1毫升HBSS 2％FCS中。降速，在120×g离心7分钟，在10℃。重悬300微升荧光偶联抗体混合物和荧光标记的链霉的粒料（见材料表 ;增加所提到的所有荧光染料耦合抗体）。离开它在黑暗中进行20分钟，4℃。
  8. 使总体积为1毫升HBSS 2％FCS中。降速，在120×g离心7分钟，在10℃。使用1毫升吸管除去上清液。重悬在1毫升HBSS和碘化丙啶颗粒（PI; 1：4000）。
    注：当使用广泛表达ILC细胞表面标记，3个种群的定义：NKP46 + IL-7Rα - ，+ NKP46 IL-7Rα+和NKP46 - IL-7Rα+。所有人群进行排序血统- CD3 - CD4 - CD45.2 +。

3.单细胞荧光激活细胞分选（FACS）

  1. 使用流式细胞仪对单个细胞13进行排序。
    注意：不同的细胞类型可以在相同的96孔的单细胞分选板进行排序（ 图2）。
    1. 使用流式细胞仪对每孔含有0.2×测定混合物并在96孔的单细胞分选板的前置放大混音一个小区进行排序。使用新鲜制备的96孔的单细胞分选板或解冻，如果储存在-20℃。
      1. 把一个密封96孔板上的FACS板固定器。使用空96孔板进行测试。该板与位置A1孔的左侧和朝向实验者。
      2. 调整板固定器，以获得在A1孔的中心与验证珠的下降。
      3. 重复步骤3.1.1.2用线A.所有井
      4. 除去从96孔板的密封件和每孔排序100验证珠。检查ðROP形成在孔的中央。
      5. 当适当调整，放置在板夹持器96孔的单细胞分选板。绘制板布局和每孔排序1细胞。
        注：在96孔的单细胞分选板每个小区的正确定位是必不可少的。 A板布局应保持在一个电子表格软件。板布局将在接下来的几个步骤（ 图1b）14一起使用。留一个孔含有0.2×测定混合物和扩增前混合于96孔样品板没有细胞。此井用作无输入控制。离开6个孔的两行的cDNA稀释。这些孔被用作引物效率（ 图1b）的控制。
      6. 在-20℃保存96孔的单细胞分选板或立即使用。

4.预扩增

  1. 使用新鲜或解冻的96孔的单细胞分选板OBTained步骤3.1.1.6。涡板和自旋下来（280 XG 45秒）。
  2. 放置在热循环仪96孔的单细胞分选板。在图3和表2进行反转录和扩增前根据所提到的程序。

图3
图3：预扩增程序。为了有足够的材料，需要的对已排序单细胞特异性靶基因预扩增。 96孔的单细胞分选板被装载在热循环跟随前置放大方案。前置放大产物，然后用低EDTA TE缓冲液稀释，并可以立即使用或在-20℃冷冻。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 稀前置放大器通过加入36微升低EDTA TE缓冲液到每个孔lified样品。
  2. 密封用覆盖膜的板。涡板和自旋下来（280克45秒）。在-20℃下储存的预扩增，96孔的单细胞分选板或立即使用它。

5.准备96孔样品盘

  1. 通过添加定量PCR预混175微升和17.5微升样品装载试剂准备191μl反应混合液。
  2. 上一个新的96孔板，分发3.6微升主混合物的各孔（最多48个孔）。这是在96孔样品板。
  3. 从96孔样品盘传送2.9微升预扩增的cDNA的新96孔板中。保持相同的位置为96的单细胞分选板和96孔样品板之间的每个样品。
  4. 密封用覆盖膜的板。涡板和自旋下来（280 XG 45秒）。放置在冰上的新96孔板避光。存放96孔小号在-20℃充足板或立即使用它。

6.准备96孔测定板

  1. 上一个新的96孔板，分发3微升测定加载试剂的每个孔中（最多48个孔）。该板被称为96孔测定板。
  2. 加入3微升引物各孔中。保持在电子表格软件布局（ 图1c和表1;使用表1中列出的所有引物）。在96孔测定板的各引物的正确定位是在接下来的步骤是必不可少的。
    1. 如果采样的数目是低于48，加水代替的引物对未使用的孔中。
  3. 密封用覆盖膜的板。涡板和自旋下来（280 XG 45秒）。在-20存储96孔测定板℃或立即使用它。
    注意：为了避免引物反复冻融，对于预放大混合分发的引物和用于96 WEL在同一时间L测定板。

7.单细胞基因表达芯片

  1. 放置在板凳上集成微流体通路（IFC），并使用帽注射器检查阀门。打开注射器，把它垂直于阀门，然后用力按压。 O形圈应该移动。填写与控制线流体芯片（0.3毫升结核菌素）。
  2. 重复步骤7.1与第二阀。
    注：没有液体应在芯片泻。
  3. 从芯片的底部卸下蓝膜。加载芯片进入IFC控制器。在IFC控制器屏幕上，选择“素”，然后选择“运行”。微流体线路中的控制持续10分钟。
  4. 弹出芯片和重新密封在芯片的底部的蓝色膜。

图4
图4：单细胞多重基因表达芯片加载。这些步骤需要摹REAT精度，尤其是在96孔板转移到单元多路复用基因表达芯片。为了避免加载错误和错位，强烈建议按顺序工作。对各传输量应在移液过程进行控制。最后，为了避免任何气泡，并在形成的情况下将其移除是很重要的。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用8通道移液器，传递从芯片的A1侧（左侧）的96孔测定板5微升。填充在芯片的左侧， 如图4所示。小心总是吸引相同体积入提示。
    1. 不要产生气泡。如果出现气泡，用10微升的提示删除它们。更改提示芯片的每口井。
  2. 右侧o重复步骤7.5F使用5微升从96孔样品板的芯片。
  3. 从芯片的底部卸下蓝膜。加载芯片进入IFC控制器。在IFC控制器屏幕上，选择“运行脚本”，然后选择“运行”。微流体线路的负载持续45分钟。
  4. 弹出芯片和重新密封在芯片的底部的蓝色膜。

8.运行芯片

  1. 在微流控的qPCR电脑，选择“数据收集”软件。一旦开始，选择“新建运行”。
  2. 选择“弹出”，从芯片的底部取出蓝膜，并加载芯片。放置芯片，以获得A 1以及在左侧和朝向实验者。
  3. 在“项目设置”，选择“无”，然后“下一步”。
  4. 选择“新的芯片运行”，“新芯片目录”（创造实验的文件夹），和“下一步”。
  5. 在“基因表达”中选择“;被动引用= ROX“（羧基-X-罗丹明）和”单探头;“根据引物选择正确的过滤器，选择”下一步“。
  6. 选择“浏览”，并选择根据所用的引物的正确的程序。
    注：“默认-10分钟-Hotstart.pcl”为单细胞多重RT-qPCR的最常用的方案。
  7. 选择“开始→运行”。反应需要大约90分钟。
  8. 一旦完成后，选择“弹出完成任务。”

9.数据分析

  1. 打开“实时荧光定量PCR分析”软件，选择“文件”和“打开”，找到实验文件夹，选择“ChipRun.bml文件”。
  2. 点击“分析视图”，“成绩表”和“热图查看;”标有“X”的框是低于阈值检测水平和/或具有不良的扩增曲线。
  3. 命名样本。进入“样本设置”和SEL等“新SBS 96.”单击“映射”，然后选择“...”复制并粘贴从电子表格软件样本版式设计。定义粘贴布局为“样品名称”。
  4. 命名检测。重复步骤9.3与底漆的名字“探测器安装”。定义粘贴布局“探测器名称。”
  5. 点击“视图分析”和“分析;”样品和引物名称将被自动归因于样品和引物（ 图7）。
  6. 计算CT，三角洲CT和折叠每个样品变化。使用管家基因作为内部对照（这里，GAPDH）：
    ΔCT= 样品的Ct -的Ct 内部控制
    倍数变化= 2 - （ΔCtsample-ΔCtnegative控制）
    1. 点击“检测设定”，并选择与无输入控制阱（使用管家基因作为内部对照正常化的基因表达）。选择“Editor“，”定义参考“和”更新“。
    2. 选择到的上述定义的内部控制将被应用于所有孔中。选择“编辑”和“定义为测试”。选择合适的参照基因，然后单击“更新”。
    3. 选择“样本设置”，选择阴性对照好。选择“编辑”，并定义“参考”。点击“更新”。
    4. 选择“分析视图”和“分析;”三角洲CT和倍数变化会自动进行计算。
  7. 导出数据。选择“文件”和“导出，另存为”表的结果，“选择目标文件夹，并点击”保存“和”退出“。
  8. 重复步骤9.7，但不是“表的结果，”另存为“热图结果”。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

淋巴人群显示基因表达差异很大。在这个协议中，肝ILC室异质使用单细胞多重RT-qPCR的基因表达的影响。不像其他的基因表达技术，单细胞多重RT-qPCR的基因表达的允许工作在几个群体，甚至最稀有的，在同一时间。这种特异性，加上在克隆水平高灵敏度，允许对群体内的基因标记的差异调查和罕见群体之间。作为一个例子，从4周龄小鼠的肝脏中3 ILC种群的基因标记进行了评估。一个群体是足够频繁被容易地识别，而其它两个是罕见的（谱系阴性细胞少于1％），在肝脏中。

96孔的单细胞分选板和96孔测定板之前肝dissectio制备n及解离（ 图1）。每个混合物无菌罩下准备和音量的精度和可重复性的电子移液器分发。所有试剂移液，以保持同质化之前进行涡旋。制备后，将96孔细胞分选板可以被冻结，直到细胞分选，和96孔细胞测定板可以被冻结，直到IFC负载。

肝脏进行解剖，并解离成单细胞悬液。细胞染色和整理上解冻96孔的单细胞分选板。使用FACS，3 ILC种群排序基于广泛表达ILC标记（ 图2）。细胞分选后，合成cDNA，和具体的靶基因扩增（ 图3和表2）。在扩增前步骤之后，cDNA的低EDTA TE缓冲液稀释。从单细胞引物和cDNA被加载到IFC芯片（ 网络连接gures 4和5a）。所获得的结果（ 图7a）被简化为便于阅读和分析（ 图7b）。正确的或不正确加载芯片的例子所示（ 图5）。正确装载芯片（ 图6）以不同的放大信号的FAM图所示。

结果表明，适当的细胞分选，前置放大和装载之后，ILC人口出现异构用于成人的野生型小鼠的肝脏（ 图7）的基因表达。使用在线软件，细胞特异性基因表达的签名（ 图7和8）和细胞群的关系（ 图8）可以被识别。每个排序群体具有在基因表达的富含特定基因签名。例如，细胞分类为NKP46 - IL-7Rα+拥有电子RORC，第3组国际劳工公约的主要转录因子的表达nriched; RORA，一个RORC -homologous转录因子;和IL-23R和CXCR6，在肝脏组3 ILC肝标志物的两个重要受体。相同的观察结果可以与NKP46 + IL-7Rα制成-和NKP46 + IL-7Rα+群体。每个单元检查看家基因表达（HPRT，法 ，和GAPDH）排除无效井;至少有两个看家基因必须表示要考虑的值是有效的。

有趣的是，这个技术允许NKP46 + IL-7Rα的两个亚群的定义-基于基因签名。这两个签名之间的差异必须由其它组不同的功能的实验来验证。

图2 图2：FACS细胞的战略。图像是代表分离的肝细胞从4周龄的小鼠。 （ 一 ）FSC-A / SSC-A门，（B）FSC-H / FSC-W双重歧视，（C，D和E）活着，谱系阴性CD45.2 + CD4 - CD3 -细胞门控。 （ 六 ）使用广泛表达ILC细胞表面标记，我们定义了3个群体：NKP46 + IL-7Rα - ，+ NKP46 IL-7Rα+和NKP46 - IL-7Rα+。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5：正确ROX数字（ 一）和不正确（B）装芯片。 （ 一 ）正确装入单细胞多重基因表达芯片应出现直线和行。每个反应室被填充并具有相同的尺寸。 （ 二 ）正确装载单细胞多重基因表达芯片。空行和反应室中的行出现（绿色方块），以及弯曲线（蓝方）。这些特征可能是由于不正确的“素”或“LOAD”的步骤，以及在IFC井残留气泡。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6：FAM正确装载芯片（亚酰胺荧光素）的身影。几个周期后（取决于样品和上底漆 s ^评估），在反应室的亮度差异应该会出现。与放大信号的反应室应该比没有或低放大信号（绿色方块）反应室显得更亮（蓝方）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
图7：（a）之前和（b）后的修改获得的热图。 （a）没有分析或测定/样品订单的修改获得直接热图。 （ 二 ）样本制备和分析的名称定义后的改性热图。如果没有发生放大无输入孔（蓝色方块）获得。低效的引物（绿色方块）。基因稀释试验（紫色广场）。 e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图8
图8：单细胞群簇。数据分析软件来确定种群之间的聚类。免费的集群软件可在网上。通过评估单个细胞的全基因表达谱，该软件可以显示基因签名和细胞群的关系。每个方块代表一个单元格：蓝色是NKP46 + IL-7Rα -红都NKP46 + IL-7Rα+，和绿色是NKp46- IL-7Rα+。每个群体具有特定的基因标记。内NKP46 + IL-7Rα -人口，两个签名可以看出，证明人口异质性。4858 / 54858fig8large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

引
ACTB IL-23R
AES 伊尔2RA
阿尔 伊尔2RB
BCL2 II-7RA
c-myc的 Klr5
CBFB LEF1
CD27 NCR1
Cd49a Nfil3
Cd49b Notch1的
CXCR5 的Notch2
CXCR6 RORA
EOMES RORC
ETS1 RUNX3
FOXO1 TBX21
GAPDH TCF3
GATA3 TCF7
GM-CSF TLE1
HES1 Tle3
HPRT Tsc22d3
ID2 Tnfrsf11a
伊尔12rb2 弓形体
伊尔18r1 ZBTB16
伊尔1rl1 Zbtb7b
IL-22

表1：引物列表。

表2
表2：预扩增程序。前置放大程序的每一个步骤被示出具有关于时间，温度，和循环次数的完整的信息。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

本协议描述了如何获取在克隆层面详尽的基因表达信息。在这里，我们调查了肝ILC车厢异质性。不同ILC种群（基于广​​泛表达ILC表面标记）的单细胞分选后，将样品预扩增特定预先选择的基因。然后，将得到的cDNA和引物装载到多重RT-qPCR的微流体芯片。最后，我们从48个单细胞获得的48个不同基因的表达。基因表达结果通过在线软件研究基因标记和细胞群的关系进行分析。

该技术的主要优点是能够同时评估多个基因表达的能力。它还允许在克隆水平和非常罕见的人口工作。不同于传统的RT-qPCR的方法中，单细胞多重RT-qPCR的不具有平均化效果，由于基因的表达是在克隆水平评估。从而，一个群体内的异质性可以被检测和分析。单细胞RT-qPCR的表达允许在非常罕见的群体工作，因为只需要很少的细胞，以获得对基因表达范围内的信息。此外，细胞的不同群体可以在相同的板进行测试。这使在人群之间基因签名的差异的检测，并与在线数据工具，细胞群关系的评估。该技术提出了其他优点。单细胞多重RT-qPCR的具有最近微流体进展的益处。在IFC室所需的体积不超过纳升级。因此，使用较低量的试剂，减少实验的成本。最后，吸移步骤的总体数量减少，从而限制了移液误差的可能性。的步骤是同时进行的所有单元，并且可以用多道移液器来完成，从而使在一个快速和节省时间的方式工作。在得到的结果克隆水平是可再现的，可靠的，并且可以用于执行稳定的数据进行分析。

单细胞多重RT-qPCR的确实，但是，存在一些限制。第一，这种技术就必须昂贵和特殊的设备，如微流体芯片，微流体芯片的控制器，和一个特定的热循环。不同于传统的RT-qPCR的方法，这种技术是节省时间和试剂，因为，与常规RT-qPCR的，需要大量的研究，以获得统计学显著比较。在这个协议中，我们提出了一个程序，以获得48种基因的基因表达。 96-96多重RT-qPCR的微流控芯片可供选择。这些芯片可以评估基因表达为从96细胞96种基因同时。在细胞分选，需要开始细胞的最小数目，由于精确度和细胞纯度必须最大。然而，即使具有小数目的细胞，它仍然是可能的排序为单小区多重RT-qPCR的基因EXPression（步骤3）。最后，单细胞多重RT-qPCR的是一个灵敏的方法。不同的测试必须在开始这种实验之前进行。例如，对于引物靶特异性引物应为扩增效率和目标的相对竞争测试。

该协议的几个步骤必须谨慎进行。小体积与同时大量样品和测定的结合增加的移液失误的风险的操作（步骤1，4，5，6，和7）。所有的试剂和混合应该移液前，以确保均匀的溶液进行涡旋。在预扩增（步骤4）的蒸发也可能影响最终结果。该板块应该始终用适当的覆盖膜密封好。排序的策略必须非常精确（步骤3），以避免死细胞或多个细胞在板内的孔中。现在FACS分拣机都配备了单细胞分选INDEX软件，可以记录哪些特定的细胞在每一个分类好。这个新的工具将用于基因签名是否相关细胞表面标记物强度的判定的兴趣。在芯片上的样品和测定的位置必须精心组织，因为这是在实验必要的（步骤1，图5和6）。最后，引物（步骤1和6）的选择是关键的一步。每个引物必须基于先前描述的结果或期望的结果来选择。的引物组中的评估基因的随机选择可能影响了实验的最后读数。此外，与用于细胞分选细胞表面标记物相关引物具有用作与持家基因控制。

在克隆水平评估多重基因表达提供了肝脏ILC异构舱更好的表征比以前的研究。该技术中，通过在线软件提供，描述了更精确地对d在稳态比仅使用细胞表面标记研究肝脏ILC的ifferent子集。此外，也可以考虑的细胞群的关系，并建立分化的网络。该基因签名，基于单细胞基因表达，也都辨别细胞群的特点和研究的潜在作用的重要工具。单细胞多重RT-qPCR的是对基因表达检测，以获得可靠数据的最佳技术之一。这些数据与生物信息学软件15便于管理。相对于其它技术用于基因表达研究，如微阵列或RNA测序，单细胞多重RT-qPCR的具有高灵敏度。到单细胞分析的其它方法已经描述和可以用作互补的技术为单细胞多重RT-qPCR的15，16。此外，该技术可以用任何底漆组合来执行，allowin3G用户看的个性化基因签名。许多其它的应用程序可以使用该技术可以使用。例如，在整个发育细胞的经时的基因表达可以做到在开发过程中，以评估分子轮廓的修饰。对细胞的药物效果也可以用药物稀释调查，以确定的药物的效率对基因表达的阈值。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Direct One Step qRT-PCR kit Applied Biosystems  11753100 Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme.
Low TE EDTA Buffer Affymetrix 75793 100ML
96-well plates Thermofisher Scientific AB 1100 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
Cover film Dominique Dutscher 106570 aluminium cover film; avoid contamination and evaporation
Actb Thermofisher Scientific Mm00607939_s1 20x primer
Aes Thermofisher Scientific Mm01148854_s1 20x primer
Ahr Thermofisher Scientific Mm00478932_s1 20x primer
Bcl2 Thermofisher Scientific Mm00477631_s1 20x primer
c-myc Thermofisher Scientific Mm00487804_s1 20x primer
Cbfb Thermofisher Scientific Mm01251026_s1 20x primer
Cd27 Thermofisher Scientific Mm01185212_s1 20x primer
Cd49a Thermofisher Scientific Mm01306375_s1 20x primer
CD49b Thermofisher Scientific Mm00434371_s1 20x primer
Cxcr5 Thermofisher Scientific Mm00432086_s1 20x primer
Cxcr6 Thermofisher Scientific Mm02620517_s1 20x primer
Eomes Thermofisher Scientific Mm01351985_s1 20x primer
Ets1 Thermofisher Scientific Mm01175819_s1 20x primer
Foxo1 Thermofisher Scientific Mm00490672_s1 20x primer
Gapdh Thermofisher Scientific Mm03302249_s1 20x primer
Gata3 Thermofisher Scientific Mm00484683_s1 20x primer
Gm-csf Thermofisher Scientific Mm01136644_s1 20x primer
Hes1 Thermofisher Scientific Mm01342805_s1 20x primer
Hprt Thermofisher Scientific Mm00446968_s1 20x primer
Id2 Thermofisher Scientific Mm01293217_s1 20x primer
Il-12rb2 Thermofisher Scientific Mm00711781_s1 20x primer
Il-18r1 Thermofisher Scientific Mm00515178_s1 20x primer
Il-1rl1 Thermofisher Scientific Mm00434237_s1 20x primer
Il-22 Thermofisher Scientific Mm001226722_s1 20x primer
Il-23r Thermofisher Scientific Mm00519943_s1 20x primer
Il-2ra Thermofisher Scientific Mm01340213_s1 20x primer
Il-2rb Thermofisher Scientific Mm01195267_s1 20x primer
IL-7r Thermofisher Scientific Mm00434295_s1 20x primer
Klr5 Thermofisher Scientific Mm04207528_s1 20x primer
Lef1 Thermofisher Scientific Mm00550265_s1 20x primer
Ncr1 Thermofisher Scientific Mm01337324_s1 20x primer
Nfil3 Thermofisher Scientific Mm01339838_s1 20x primer
Notch1 Thermofisher Scientific Mm00435249_s1 20x primer
Notch2 Thermofisher Scientific Mm00803069_s1 20x primer
Rora Thermofisher Scientific Mm01173766_s1 20x primer
Rorc Thermofisher Scientific Mm01261022_s1 20x primer
Runx3 Thermofisher Scientific Mm00490666_s1 20x primer
Tbx21 Thermofisher Scientific Mm01299453_s1 20x primer
Tcf3 Thermofisher Scientific Mm01175588_s1 20x primer
Tcf7 Thermofisher Scientific Mm00493445_s1 20x primer
Tle1 Thermofisher Scientific Mm00495643_s1 20x primer
Tle3 Thermofisher Scientific Mm00437097_s1 20x primer
Tsc22d3 Thermofisher Scientific Mm01306210_s1 20x primer
Tnfrsf11a Thermofisher Scientific Mm00437132_s1 20x primer
Tox Thermofisher Scientific Mm00455231_s1 20x primer
Zbtb16 Thermofisher Scientific Mm01176868_s1 20x primer
Zbtb7b Thermofisher Scientific Mm00784709_s1 20x primer
qPCR Master mix  Applied BioSystems P/N 4304437
2x Assay Loading Reagent Fluidigm P/N 85000736 Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. 
2x Sample Loading Reagent Fluidigm P/N 85000735 Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. 
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip Fluidigm BMK-M-48.48 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller Fluidigm 89000020 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers
mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler Fluidigm GE48.48 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler
96-well plates Thermofisher Scientific AB 1100 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
C57Bl/6 mice Janvier C57Bl/6 miceJ@RJ
10 ml syringe BD Biosciences 309639
PBS Life Technologies 14040174
HBSS Life Technologies 24020133
RPMI Life Technologies 61870044
FCS CVFSVF000U Eurobio Abcys Standard fetal calf serum
Potter tube N/A
15 ml tube Corning 352097
1.5 ml tube Sigma-Aldrich T9661-1000EA
FACS machine N/A
centrifuge  Thermofisher Scientific 75004538
1,000 µl tips Fisher Scientific 10313272
P1000  Gilson F123602
Percoll Dominique Dutscher 17-0891-01
Facs tube Falcon 352235
anti-CD8 Biotin mouse antibody Sony 1103520 lineage antibody
anti-CD19 Biotin mouse antibody Sony 1177520 lineage antibody
anti-TCRab Biotin mouse antibody BioLegend 109204 lineage antibody
anti-TCRgd Biotin mouse antibody BD Biosciences 553176 lineage antibody
anti-Ter119 Biotin mouse antibody BD Biosciences 553672 lineage antibody
anti-Gr1 Biotin mouse antibody BD Biosciences 553125 lineage antibody
anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody BioLegend 109828
anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody ebioSciences 25-1271-82
anti-CD3 BV510 mouse antibody BD Biosciences 563024
anti-CD4 BV786 mouse antibody BD Biosciences 563727
anti-NKp46 PE mouse antibody ebioSciences 12-3351-82
Streptavidin Sony 2626025
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML
Electronic pipette Eppendorf 4986000017
Combitips 0.1 ml Eppendorf 30089405
Multichannel pipette Rainin L8-10XLS+
Accudrop BD Biosciences 345249 verification beads for FACS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

Tags

遗传学，第119，单细胞，基因表达，表达模式，细胞的异质性，微流控，先天淋巴样细胞（ILC）
单细胞基因表达利用多重RT-qPCR的表征罕见的淋巴人群的异质性
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perchet, T., Chea, S., Hasan, M.,… More

Perchet, T., Chea, S., Hasan, M., Cumano, A., Golub, R. Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations. J. Vis. Exp. (119), e54858, doi:10.3791/54858 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter