Summary
Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.
Abstract
Gen ifadesi heterojen lenfoid toplumlarda araştırmak için ilginç bir özelliktir. Bu hücrelerde gen ifadesi hücre aktivasyonu, stres veya uyarılması sırasında değişir. Tek hücreli çoklu gen sentezleme gen 1, 2, 3 onlarca aynı anda değerlendirilmesine olanak sağlar. Tek hücre düzeyinde, çoklu gen ekspresyonu popülasyon heterogenitesi 4, 5 belirler. Olgun hücreleri arasında farklı öncül aşamalarında olası karışımını ve aynı zamanda uyaranlara hücre yanıtlarının çeşitliliği hem de belirleyerek nüfus heterojenite ayrımı sağlar.
Doğuştan lenfoid hücreleri (LAK) en son bağışıklık tepkisi 6, 7 doğuştan efektörlerinin bir popülasyon olarak tarif edilmiştir. LAK kendisinden Bu protokolde, hücre heterojenlikhepatik bölme homeostazındaki sırasında incelenmiştir.
Şu anda, gen ekspresyonunu değerlendirmek için en yaygın olarak kullanılan bir teknik, RT-qPCR olup. Bu metot ölçümlerinin gen aynı anda yalnızca tek bir gen. birden çok hücre bir test için gerekli çünkü ek olarak, bu yöntem, gen ekspresyonunun heterojen tahmin edilemez. Bu popülasyonun ortalama gen ekspresyonunun ölçülmesi yol açar. gen çok sayıda değerlendirilirken, RT-qPCR bir zaman-, reagent- ve numune alıcı bir yöntemdir olur. Bu nedenle, ticaret-off küresel resim eksik riskini artıran değerlendirilebilir genler ya da hücre popülasyonlarının sayısını sınırlamak.
Bu yazının tek hücreli çoklu RT-qPCR bu sınırlamaları aşmak için nasıl kullanılabileceği anlatılmaktadır. Bu teknik son Mikroakiskan teknolojik gelişmeler 1, 2 yararlanmıştır. Multipleks RT-qPCR fiş meydana gelen reaksiyonlar tarifeler yoknanoliter düzeyi eed. Bu nedenle, tek bir hücre, gen ekspresyonu, hem de aynı anda birden fazla gen ekspresyonu, Örnek, bir reagent- uygulandı, ve maliyet-etkin bir şekilde olabilir. 5 farklı gelişim aşamalarında veya farklı koşullar altında 4 bir popülasyon içindeki hücre alt arasındaki klonal düzeyde hücre gen imza heterojenitesini test etmek mümkündür. tek hücre düzeyinde koşulları, çok sayıda nadir nüfus üzerinde çalışmak artık bir kısıtlamadır.
Introduction
Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, doğuştan lenfoid hücreler (Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar) giderek incelenmiştir. antijene spesifik reseptörlere karşı olmamasına rağmen, lenfoid soyuna aittir ve doku homeostazında ve iltihaplanma önemli sentineli temsil etmektedir. Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar şu transkripsiyon faktörü kombinasyonları kendi ifadesi ve sitokinler 6, 7 üretme yetenekleri göre üç gruba ayrılır.
Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar belirli sitokin üretimi 8, 9 vasıtasıyla çeşitli organlarda çok sayıda homeostatik ve patofizyolojik durumlara katkıda bulunur. Bu hücrelerin rolünü anlamak mümkün, organın başına çeşitli LAK alt popülasyonlar belirlemek ve bunların gelişim ilişkilerini belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, farklı alt arasındaki plastisite olayları ile ilgili edilmiştir. heterojenitesini inceleyerekBir organın içinde mevcut hücre, bunlann olgunlaşma aşamasına sınırlandırmak için ve özel fonksiyonları ayırt etmek mümkündür.
Tek hücreli çoklu RT-qPCR tekniğini göstermek için, karaciğer Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar aynı LAK grupta (tip 1 LAK) 10 içinde kendi heterojenite özel bir vurgu ile, seçildi. İlk olarak, akış sitometrisi kullanılarak, üç farklı LAK popülasyonları karaciğerde karakterize edilmiştir. iki nüfus az hepatik LAK popülasyonları (doğuştan efektörlerinin% 5'ten az) ise Grup 1 ILC doğuştan efektör yaklaşık% 80'ini oluşturmaktadır. Bu popülasyonlar LAK nüfusun yaygın olarak dile hücre yüzey belirteçleri kullanılarak dizildi. Sonuç olarak, karaciğerde LAK popülasyonları başka büyük oranda benzer bir bakmak sınıflandırılmaktadır.
Tek hücreli çoklu RT-qPCR derhal bu popülasyonların 11 heterojenitesini araştırmak için en iyi tekniklerden biri olarak ortaya çıkmıştır
Daha sonra, bir küresel ILC fenotipe sahip tüm hücreleri sıralayarak, karaciğer LAK popülasyonlarının çok gen ekspresyonu geniş bir genel son derece nadir popülasyonları temsil etse de, elde edilir. Bir Mikroakışkan tabanlı çip bile deney sağlarHücre maddesinin küçük bir miktar. Bunun bir sonucu olarak, nadir bir hücre popülasyonlarının gen ekspresyon profilleri elde edilebilir. Online gen imza analiz yazılımı, hücre popülasyonu kümeleri ve potansiyel hücre ilişkileri kullanılarak araştırılabilir. Sonuç olarak, fonksiyonel test in vivo düzeyde kümelenme verileri doğrulamak için gerçekleştirilebilir.
Genlerin onlarca aynı çip 3, 11, 12, yüzlerce ya da daha fazla tek hücreler üzerinde eş zamanlı olarak değerlendirilebilir. Deneyin tasarımı Deney en uzun ve en önemli parçasıdır. test edilecek hipoteze ilgili genlerin belirlenmesi, ilgili sonuçlar elde etmek için her şeyden önemlidir. İkincisi, ve özel kontroller (örneğin sıralama için kullanılan bilinen yüzey belirteçleri gibi) iç kontrol ihtiyaç vardır. Bu primer amplifikasyon özgüllük, amplifikasyon verimliliğini ve t test etmek çok önemlidirastar rekabet o yokluğu. Bir hücrenin birden çok gen ekspresyonu, aynı zamanda değerlendirilir Bu nedenle, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR ile çalışan bir zaman kazandıran bir tekniktir.
tüm hücreler için reaktiflerin aynı çip ve karışımı kullanılarak manipülasyon olası hataları sınırlar ve örnekler arasındaki tekrarlanabilirlik sağlar. Tamamen tek hücreli çoklu RT-qPCR farklı yönlerini örnekler ve genlerin çok çeşitli duyarlılık büyük bir seviyeye sahip, klonal düzeyde son derece güvenilir sonuçlar üretimine olanak sağlamaktadır. Elde edilen sonuçlar biyoistatistiksel testler için güçlü ve sağlam veri sunuyoruz.
Bunun nedeni, maddenin çok küçük miktarlarda çalışma sağlar ve ayrıntılı sonuçlara yol açar yöntemin mikroakışkan yönüne elde edilebilir. Son olarak, çevrimiçi yazılım kullanarak, istenilen popülasyonları karşılaştırmak mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Fransız Tarım Bakanlığı ve AB kurallarına uygun olarak Pasteur Enstitüsü Güvenliği Komitesi tarafından onaylanan bulundu.
1. Bir 96-yuvalı Tek hücreli Sıralama Plaka Hazırlama
- Belirli bir retro transkripsiyon tamponu 5.0 ul, düşük etilendiamintetraasetik asit (EDTA) TE tamponu (10 mM TE çözeltisi, pH 8, ve 0.1 mM EDTA solüsyonu, 1.3 ul ekleyerek 1.5 ml bir tüp içinde ön amplifikasyon karışımı hazırlanması 0.2 uM filtre ) ve Taq DNA polimeraz oyuk başına (Şekil 1a, 0.2 ul).
- 96 oyuklu bir plaka üzerinde, her bir (en fazla 48 kuyu) 'de ön amplifikasyon karışımı 6.5 ul dağıtın. Bu plaka, 96 gözlü, tek-hücre sıralama levhasıdır.
NOT: Bir elektronik pipet kullanarak bu protokol için tavsiye edilir. Bu hassas ve tekrarlanabilir hacim ölçümleri sağlar ve zaman kazandırır.
2. Tek Hücre Ayrılma 3. Tek hücreli floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) 4. Ön amplifikasyon 5. 96-çukurlu bir numune plakası hazırlayın 6. 96 oyuklu bir deney plakasının hazırlanması 7. Tek hücreli Gen-ifadesi Chip 8. Çalışma Chip 9. Veri analizi 
Not: 9 ul olmalıdır 96 gözlü numune plakasının her çukuruna son hacim.
NOT: yaygın ifade LAK hücre yüzey belirteçleri kullanırken, 3 popülasyonları tanımlanmıştır: NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα + ve NKp46 - IL-7Rα +. Tüm popülasyonları soy sıralanır - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
Not: Farklı hücre tipleri, aynı 96-yuvalı, tek hücreli ayırma plakasında sıralanabilir (Şekil 2).
Not: 96 oyuklu bir hücre ayırma plakası üzerinde, her hücrenin doğru yerleştirilmesi gereklidir. Bir plaka düzeni bir elektronik tablo yazılımı üzerinde tutulmalıdır. Plaka düzeni sonraki birkaç adımda (Şekil 1b) 14 kullanılır. hücreleri olmadan 96-kuyu örnek plaka üzerinde bir de içeren 0.2x tahlil karışımı ve Preamplıfikasyon karışımı bırakın. Bu da, bir No-girişli kontrol olarak kullanılır. bir cDNA seyreltme için 6 kuyu iki sıra boş. Bu kuyular, primer etkinlik (Şekil 1b) için kontrol olarak kullanılır. 
Şekil 3: Ön amplifikasyon programı. yeterli malzeme elde edebilmek için, sıralanmış tek hücreler üzerinde olduğundan belirli hedef genlerinin ön amplifikasyon gerekir. 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakası ön amplifikasyon programı izlemek için bir ısıl üzerine yüklenir. Ön amplifikasyon ürünleri daha sonra, düşük EDTA TE tamponu ile seyreltildi ve hemen kullanılır veya -20 ° C de dondurulabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NOT: primerler tekrarlanan donma ve çözülme önlemek Preamplıfikasyon karışımı için primerler dağıtmak ve 96-wel için içinAynı zamanda L deney plakası.
NOT: Hiçbir sıvı çip dökülen edilmelidir. 
Şekil 4: Tek hücreli multipleks gen ifadesi çip yükleme. Bu adımlar g gerektirirÖzellikle, tek hücreli çoklu gen sentezleme çip 96 oyuklu plakanın aktarım sırasında reat hassasiyet,. yükleme hataları ve hatalara önlemek için, son derece seri bir şekilde çalışarak tavsiye edilir. Her bir transfer için alınan ses pipetleme işlemi sırasında kontrol edilmelidir. Son olarak, kabarcıkları önlemek ve oluşması halinde, bunları çıkarmak için önemlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NOT: "Varsayılan-10dk-Hotstart.pcl" tek hücreli çoklu RT-qPCR için en sık kullanılan programdır.
ACt = Ct örnek - Ct iç kontrol
(ΔCtsample-ΔCtnegative kontrolü) - Değişim = 2 Fold
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lenfoid popülasyonları gen ekspresyonunda büyük bir çeşitlilik gösterir. Bu protokol, karaciğer LAK bölmesi heterojenite tek hücreli çoklu RT-qPCR gen ekspresyonunu kullanılarak araştırılmıştır. Diğer gen sentezleme tekniklerinin aksine, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR gen ekspresyonu, aynı zamanda, daha nadir, birkaç popülasyonda ilgili bir çalışma sağlar. klonal düzeyde yüksek hassasiyet ile birleştiğinde Bu özgüllük, bir popülasyon içindeki gen imzaları farklılıkların incelenmesi için ve nadir popülasyonları arasında sağlar. Bir örnek olarak, 4-haftalık farenin karaciğerlerinden 3 LAK popülasyonlarının gen imzaları değerlendirildi. Diğer iki karaciğerde (soy-negatif hücrelerin% 1'den daha az) nadir ise bir popülasyon, kolayca tespit edilebilecek kadar sıktır.
96 oyuklu bir hücre ayırma plakası ve 96 oyuklu bir deney plakası, karaciğer dissectio önce hazırlandın ve ayrışma (Şekil 1). Her karışım steril bir başlık altında hazırlanan ve hacim hassas ve tekrarlanabilirlik için bir elektronik pipet ile dağıtıldı. Tüm reaktifler homojenliğini korumak için pipetleme önce vortekslenmiştir. hazırlandıktan sonra, 96-gözlü hücre ayırma plakası hücre sıralama kadar dondurulabilir ve 96 gözlü hücre deney plakası IFC yüklenene kadar dondurulabilir.
Karaciğerleri disseke ve tek hücre süspansiyonları içine ayrışmış edildi. Hücreler, lekeli ve çözülmüş 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakaları üzerinde dizildi. FACS kullanılarak, 3 LAK popülasyonları yaygın olarak ifade LAK işaretçileri göre (Şekil 2) kriteri edildi. Hücre Ayırma işleminden sonra cDNA sentezlendi, ve spesifik hedef genler (Şekil 3 ve Tablo 2) amplifiye edilmiştir. Ön amplifikasyon aşamasından sonra, cDNA, düşük EDTA TE tamponunda seyreltildi. Tek hücrelerden Topraklar ve cDNA Fi (IFC çip üzerine yüklendirakamları 4 ve 5A). Elde edilen sonuçlar (Şekil 7) daha kolay okuma ve analiz (Şekil 7b) için basitleştirilmiştir. Düzgün ya da yanlış yüklenmiş fiş örnekleri (Şekil 5) gösterilmektedir. Farklı yükseltme sinyalleri ile uygun şekilde yüklenebilir çip (Şekil 6) içinde bir FAM şekli gösterilmektedir.
Sonuçlar, uygun hücre sıralama, ön amplifikasyon ve yüklemeden sonra, LAK popülasyon yetişkin vahşi tip farelerin karaciğerinde gen ekspresyonu (Şekil 7), heterojen görünür olduğunu göstermektedir. Çevrimiçi yazılım, hücreye özel bir gen ekspresyon profili (Şekil 7 ve 8) ve hücre popülasyonu ilişkileri (Şekil 8) kullanılarak tespit edilebilir. Her sıralanmış nüfus gen ifadesinde zenginleştirilmiş spesifik bir gen imzası vardır. Örneğin, hücreler NKp46 olarak sıralanır - IL-7Rα + e sahipRORC, grup 3 LAK ana transkripsiyon faktörünün nriched ekspresyonu; Rora bir RORC -homologous transkripsiyon faktörü; ve IL-23R ve Cxcr6, karaciğerde grup 3 LAK hepatik markerlerin iki önemli reseptörleri. Aynı gözlemler NKp46 + IL-7Rα yapılabilir - ve NKp46 + IL-7Rα + popülasyonlan üzerinde izlenmiştir. Her hücre geçersiz kuyu dışlamak için temizlik gen ifadesi (HPRT, Kanun ve GAPDH) kontrol edilir; en az iki temizlik genler geçerli gibi değerleri dikkate ifade edilmelidir.
İlginçtir, bu teknik NKp46 + IL-7Rα iki alt popülasyonlar olarak tanımlanmasını sağlar - gen imzaları dayalı. Bu iki imza arasındaki farklar farklı fonksiyonel deneyler diğer setleri tarafından onaylanmış olması gerekir.
![şekil 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Şekil 2: FACS hücre stratejisi. Çıkan 4 haftalık farelerden izole edilmiş karaciğer hücrelerinin temsilidir. (A) FSC-A / SSC-A yolluk, (b) FSC-H / FSC-W çiftli ayrımcılık, (c, d ve e) canlı, soy-negatif CD45.2 + CD4 - CD3 - hücreleri yolluk. -, NKp46 + IL-7Rα + ve NKp46 - IL-7Rα + NKp46 + IL-7Rα: (f) yaygın şekilde eksprese LAK hücre yüzeyi işaretçileri kullanarak, 3 popülasyonları tanımlandığı gibidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: düzgün ROX rakamları (a) Ve yanlış (b) cips yüklendi. (A) Düzgün yüklü tek hücreli multipleks gen ifadesi yonga düz çizgiler ve satırlarla görünmelidir. Her bir tepkime haznesi doldurulmuş ve aynı boyuta sahiptir. (B) Yanlış yüklenen tek hücreli multipleks gen ifadesi çip. Boş satırlar ve reaksiyon odaları satır (yeşil kare) yanı sıra, bükme hatları (mavi kare) görünür. Bu özellikler uygunsuz "PRIME" veya "LOAD" adımlar nedeniyle, hem de IFC kuyularında kalan kabarcıklar olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: FAM düzgün yüklenmiş çip (Floresein amidite) figür. Birkaç döngüden sonra (numuneler üzerinde ve astar bağlı ) Değerlendirildi s, tepkime haznesi parlaklık farklılıklar görünmelidir. amplifikasyon sinyali ile reaksiyon odaları sıfır veya düşük büyütme sinyalleri (yeşil kare) ile reaksiyon odaları daha parlak (mavi kare) görünmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7 (a) ve sonra (b) bu değişikliklerin önce elde edilen ısı haritası. (A) Doğrudan ısı haritası analizi veya tahlil / numune sipariş değişiklik olmadan elde edilmiştir. (B) Değiştirilmiş ısı haritası örnek ve tahlil adı tanımından sonra elde edildi. hiçbir amplifikasyon oluşursa hiçbir giriş kuyuları (mavi kare) elde edilir. Verimsiz primerler (yeşil kare). cDNA seyreltme testi (mor kare). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8: Tek hücre popülasyonu kümeleme. Bir veri analiz yazılımı popülasyonları arasındaki kümeleme belirlemek için kullanılır. Ücretsiz kümeleme yazılımı online olarak mevcuttur. Tek bir hücrenin bütün ifade profilini değerlendirerek, yazılım gen imzaları ve hücre popülasyonu ilişkileri görüntüleyebilirsiniz. Kırmızı NKp46 + IL-7Rα +, ve yeşil NKp46- IL-7Rα + vardır - mavi NKp46 + IL-7Rα şunlardır: Her kare bir hücreyi temsil eder. Her nüfus spesifik bir gen imzası vardır. NKp46 + IL-7Rα içinde - nüfusun, iki imza nüfus heterojenite doğrulayan, görülebilir.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Astarlar | |
| Actb | Il-23R |
| Aes | Il-2RA |
| Ahr | Il-2RB |
| Bcl2 | II-7RA |
| c-myc | Klr5 |
| Cbfb | Lef1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| Cd49b | Notch1 |
| CXCR5 | Notch2 |
| Cxcr6 | Rora |
| Eomes | RORC |
| Ets1 | Runx3 |
| Foxo1 | Tbx21 |
| GAPDH | t-CF3 |
| Gata3 | Tcf7 |
| GM-CSF | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| hprt | Tsc22d3 |
| id2 | Tnfrsf11a |
| Il-12rb2 | Toksikoloji |
| Il-18r1 | Zbtb16 |
| Il-1rl1 | Zbtb7b |
| IL-22 | |
Tablo 1: Primer listesi.
Tablo 2: Ön amplifikasyon programı. Preamplıfikasyon programının her adım döngülerinin zaman, sıcaklık ve sayı konusunda tam bilgi ile gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol klonal düzeyde ayrıntılı gen ifadesi bilgilerini nasıl elde edileceği anlatılır. Burada, karaciğer LAK bölme heterojenite araştırdık. (Yaygın olarak dile LAK yüzey belirteçleri göre) farklı LAK popülasyonlarının tek hücreli sıralama sonra, numuneler belirli önceden seçilen genler için önceden çoğaltılmıştır. Daha sonra elde edilen cDNA'sı ve primerler A çoklu RT-qPCR mikroakışkan çip üzerine yüklendi. Son olarak, 48 tek hücre 48 farklı gen ekspresyonunu elde etti. Gen ifadesi sonuçları gen imzası ve hücre popülasyonu ilişkilerini araştırmak için bir online yazılım üzerinden analiz edilmiştir.
Bu tekniğin başlıca avantajı, aynı anda birden fazla gen ekspresyonunu değerlendirmek için yeteneğidir. Aynı zamanda klonal düzeyde ve çok nadir popülasyonlar üzerinde çalışmaya olanak sağlar. gen ifadesi klonal düzeyde değerlendirilir beri geleneksel RT-qPCR yöntemlerinin aksine, tek hücreli çoklu RT-qPCR, hiçbir ortalama bir etkiye sahiptir. BöyleceBir popülasyon içindeki heterojen tespit ve analiz edilebilir. Sadece çok az sayıda hücre gen ifadesi üzerinde geniş bilgi elde etmek için gerekli beri tek hücreli RT-qPCR ifadesi, çok nadir popülasyonlar üzerinde çalışmaya olanak sağlar. Ayrıca, farklı hücre popülasyonu aynı plaka üzerinde test edilebilir. Bu online veri araçları, hücre popülasyonu ilişkileri değerlendirilmesi ile, popülasyonlar arasındaki gen imza farklılıkların tespit edilmesini sağlar ve. Bu teknik, aynı zamanda diğer avantajlar sağlar. Tek hücreli çoklu RT-qPCR son mikroakışkan avans yararı vardır. IFC odalarında gerekli Ciltler nanoliter düzeyi aşmamaktadır. Böylece, reaktifler, az miktarlarda deney maliyetini azaltarak, kullanılır. Son olarak, pipetle çalışma aşamasına toplam sayısı bu şekilde pipetleme hata olasılığını kısıtlanmaktadır. adımları tüm hücreler için eş zamanlı olarak ve hızlı ve zaman tasarrufu sağlayan bir şekilde çalışmasına imkan vermektedir, çok kanallı bir pipet ile yapılabilir. elde edilen sonuçlarklonal düzeyde güvenilir ve tekrarlanabilir, ve sağlam veri analizi gerçekleştirmek için de kullanılabilir.
Tek hücreli çoklu RT-qPCR, ancak, bazı sınırlamalar getirmekte etmez. İlk olarak, bu teknik, bir mikroakışkan çip mikroakışkan çip kontrol ve belirli bir ısıl olarak pahalı ve özel ekipman gerektirmektedir. Geleneksel RT-qPCR ile, çok sayıda çalışma istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar elde etmek için gerekli beri geleneksel RT-qPCR yöntemlerinin aksine, bu teknik, zaman ve reaktif tasarrufu olduğunu. Bu protokol, 48 gen için gen ekspresyonunu elde etmek için bir yöntem sunmaktadır. 96-96 multipleks RT qPCR mikroakışkan cips mevcuttur. Bu yongalar, aynı zamanda 96 hücrelerinden 96 gen için gen ekspresyonunu değerlendirmek. Hassas ve hücre saflık maksimal olması gerektiğinden hücre sıralama sırasında, başlangıç hücre az sayıda ihtiyaç vardır. Ancak, daha küçük bir hücre sayısı ile, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR geni exp sıralamak mümkün olduğunudışarı yansıması (aşama 3) hazırlandı. Son olarak, tek hücreli çoklu RT-qPCR hassas bir yöntemdir. Farklı testler, deneyler başlamadan önce yapılmalıdır. Örneğin, primer hedef özgüllük için, primerler yükseltme verimliliği için ve hedef için görece rekabet test edilmelidir.
protokolün birkaç adım dikkatle yapılmalıdır. Pipetleme hata riskini arttırabilir, aynı zamanda örnekler ve deneyler bir sayıda bir araya getirildiğinde küçük hacimlerde manipülasyonlar (Adım 1, 4, 5, 6, ve 7). Bütün reaktifler ve karışımlar homojen bir çözelti sağlamak için önceden pipetleme için vortekslendi edilmelidir. Ön amplifikasyon (adım 4) esnasında buharlaşma aynı zamanda nihai sonuçlar etkileyebilir. Plakalar her zaman düzgün, uygun bir kapak film ile kapatılmalıdır. strateji sıralama plakalar içinde kuyu ölü hücreleri veya birden çok hücre önlemek için çok hassas (adım 3) olması gerekir. istifleme makineleri FACS artık tek hücreli sıralama ind ile donatılmıştıriyi her sıralı spesifik hangi hücre kaydedebilirsiniz eski yazılım. Bu yeni araç, gen imzalar hücre yüzey işaretleyici yoğunluğu korelasyon olup olmadığını belirlenmesi için ilgi olacaktır. cips örnek ve tahlil pozisyonları bu deney için gerekli olduğu gibi, titizlikle organize (1 adım 5 ve 6) olmalıdır. Son olarak, astar (adım 1 ve 6) seçimi kritik bir adımdır. Her astar daha önce açıklanan sonuçların ya da beklenen sonuçlara göre seçilmelidir. değerlendirilen genlerin kümesindeki primerlerin rastgele seçim deney nihai okuma bozabilir. Bundan başka, hücre sıralama için kullanılan hücre yüzey işaretleyici ile ilişkili primerler hazırlık geninin olan kontrol olarak kullanılması gerekir.
klonal düzeyde multipleks gen ifadesini değerlendirirken, önceki araştırmalarda daha karaciğer LAK heterojen bölmenin daha iyi karakterizasyonu sunmaktadır. Online yazılım tarafından sağlanan bu teknik, daha doğrusu d açıklarSadece hücre yüzey işaretlerini kullanarak çalışmalara göre homeostasis karaciğerde ILC'nin ifferent alt kümeler. Ayrıca, hücre popülasyonu ilişkilerini değerlendirmek ve farklılaşma ağları inşa etmek mümkündür. tek hücreli gen ifadesinin dayalı gen imzaları, aynı zamanda hücre popülasyonu özelliklerini ayırt etmek ve potansiyel rolleri incelemek için önemli araçlardır. Tek hücreli çoklu RT-qPCR güvenilir veri elde etmek için bir gen ekspresyon analizi için iyi tekniklerden biridir. Bu veriler biyoinformatik yazılımı 15 ile kolayca yönetilebilir. Bu mikrodizileri veya RNA sekansları gibi gen ekspresyon çalışmaları için diğer teknikler, ile ilgili olarak, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR yüksek hassasiyet mevcuttur. Tek hücre analizi diğer yaklaşımlar anlatılmıştır ve tek hücreli çoklu RT-qPCR 15, 16 birbirini tamamlayan teknikler kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik allowin, bir primer kombinasyonu ile yapılabilirg kullanıcıları kişiselleştirilmiş gen imzaları bakmak için. Bir çok diğer uygulamalar bu teknik ile kullanılabilir. Örneğin, gelişim boyunca hücrelerin zaman akışı gen ekspresyonu geliştirme sırasında molekül profilinin değiştirilmesi değerlendirmek için yapılabilir. hücreler üzerindeki ilaç etkileri de gen ekspresyonu üzerindeki ilaç etkinliğini eşiğini belirlemek için bir ilaç seyreltmesi ile araştırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
