Genetics

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Published: January 19, 2017 doi: 10.3791/54858

Thibaut Perchet¹, Sylvestre Chea¹, Milena Hasan², Ana Cumano¹, Rachel Golub¹

¹Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, ²Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

Summary

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。

Abstract

遺伝子発現の不均一性は、リンパ集団で調査する興味深い特徴です。これらの細胞における遺伝子発現は、細胞活性化、ストレス、又は刺激中に変化します。単一セルマルチプレックス遺伝子発現は遺伝子^{^{^{^{^1、2、3}}}}の数十の同時評価を可能にします。単一細胞レベルでは、多重遺伝子発現は、集団の不均一^{^{^4,5}}判定する。これは、成熟した細胞間の多様な前駆段階の可能性ミックスとも刺激に対する細胞応答の多様性の両方を決定することにより、人口の異質性の区別を可能にします。

先天性リンパ系細胞（ILC）は最近、免疫応答^{^{^6、7}}の生来のエフェクターの集団として記載されています。 ILC彼のこのプロトコルでは、細胞の不均一paticコンパートメントは恒常性の間に検討されています。

現在、遺伝子発現を評価するための最も広く使用される技術は、RT-qPCRのです。この方法は、一度に遺伝子発現1つの遺伝子のみを測定します。複数のセルを1つのテストのために必要とされるのでさらに、この方法は、遺伝子発現の不均一性を推定することができません。これは、集団の平均遺伝子発現の測定をもたらします。多数の遺伝子を評価する場合、RT-qPCRのは、時間、reagent-、およびサンプルのかかる方法になります。したがって、トレードオフがグローバル画像を欠落するリスクを増大させる、評価することができる遺伝子または細胞集団の数を制限します。

この原稿は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRには、これらの制限を克服するために使用することができる方法を記載しています。この技術は、最近のマイクロフルイディクス技術の進歩^{^{^1、2}}から恩恵を受けています。マルチプレックスRT-qPCRをチップに起こる反応はEXCありませんナノリットルレベルをEED。したがって、単一細胞遺伝子発現、ならびに同時に複数の遺伝子の発現、reagent-、試料 - 、および費用対効果の高い方法で行うことができます。異なる発達段階で、または異なる条件^{^{^4,5}}の下で集団内の細胞のサブセット間クローンレベルでの細胞遺伝子シグネチャーの不均一性をテストすることができます。単一細胞レベルでの条件の数が多い希少な集団での作業はもはや制限ではありません。

Introduction

過去数年間、先天性リンパ系細胞（ILCS）は、ますます研究されてきました。抗原特異的受容体の欠如にもかかわらず、彼らはリンパ系統に属し、組織の恒常性や炎症のための重要な番兵を表します。 ILCSは、現在、特定の転写因子の組合せの発現におよびサイトカイン^{^{^6,7}を}産生する能力に基づいて3つのグループに分けています。

ILCSは、特定のサイトカイン産生^{^{^8、9}を}介して多様な器官における数多くの恒常性および病態生理学的状況に貢献しています。これらの細胞の役割を理解することができるためには、臓器ごとに様々なILC亜集団を決定し、それらの発達の関係を識別することが重要です。また、異なるサブセット間の可塑性の現象が関連しています。異質性を研究することによって1つの器官に存在する細胞では、成熟のその段階を区切るために、それらの特定の機能を区別することが可能です。

単一セルの多重RT-qPCRの技術を説明するために、肝ILCSは同じILCグループ（タイプ1 ^ILC）10内に、その異質性に特に重点を置いて、選択されました。まず、フローサイトメトリーを使用することによって、三つの異なるILC集団は、肝臓中で特徴づけました。他の二つの集団が、稀な肝ILC集団（先天性エフェクターの5％未満）でありながら、グループ1 ILCは、生来のエフェクターの約80％を占めています。これらの集団は、ILC集団の広く発現される細胞表面マーカーを用いて選別しました。その結果、肝臓におけるILC集団が別に広く同様のものを見て選別しました。

シングルセル多重RT-qPCRを速やかにこれらの集団¹¹の不均一性を調査するための最良の手法の一つとして浮上しています

次に、グローバルILC表現型を有するすべての細胞を選別することにより、肝臓ILC集団の複数の遺伝子の発現の広範な概要は、それらが非常にまれな集団を表していても、得られます。マイクロ流体ベースのチップもで実験を可能にします細胞物質の少量。その結果、希少細胞集団の遺伝子発現プロファイルを得ることができます。オンライン遺伝子特性分析ソフトウェアを用いて、細胞集団のクラスタと電位セルとの関係を調べることができます。これにより、機能テストは、in vivoレベルでクラスタリングデータを検証するために行うことができます。

遺伝子発現の十同じチップ^{^{^{^{^3、11、12}}}}の数百以上の単一の細胞に同時に評価することができます。アッセイの設計は、実験の最長かつ最も重要な部分です。試験されるべき仮説に関連する遺伝子の決意は、適切な結果を得るために最も重要です。（そのようなソートに使用される公知の表面マーカーなど）第二に、内部統制および特定のコントロールが必要とされています。これは、プライマー増幅特異性、増幅効率、およびtをテストすることが重要ですプライマー競争の彼が不在。セルの複数の遺伝子発現を同時に評価されるようにそのため、単一セル多重RT-qPCRをでの作業は、時間節約テクニックです。

すべてのセルのための試薬の同じチップとミックスを使用すると、操作のエラーの可能性を制限し、サンプル間の再現を可能にします。要するに、単一セル多重RT-qPCRをのさまざまな側面は、サンプルや遺伝子の幅広い感度の偉大なレベルで、クローンレベルでの信頼性の高い結果の生成を可能にします。得られた結果は、生物統計学的試験のための強力かつ堅牢なデータを提供しています。

これは、材料の非常に少量の作業を可能にし、徹底的な結果をもたらす方法のマイクロ流体態様に達成することができます。最後に、オンラインソフトウェアを使用して、所望の集団を比較することができます。

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Protocol

全ての動物実験は、フランス農業省とEUのガイドラインに従ってパスツール研究所安全委員会の承認されました。

1. 96ウェルシングルセルソーティングプレートを準備します

特定のレトロ転写緩衝液5.0μlを、低エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、TE緩衝液（10mMのTE溶液を、pHが8、および0.1mM EDTA溶液の1.3μLを添加することによって、1.5mlチューブ中でプレ増幅ミックスを調製し、0.2μM濾過）、そしてウェル当たりのTaq DNAポリメラーゼ0.2μlの（ 図1a）。
96ウェルプレートに、各ウェル（最大48ウエル）にプレ増幅混合物の6.5μLを配布します。このプレートを、96ウェルの単一細胞選別板です。
注：電子ピペットを用いて、このプロトコルのために推奨されます。これは、正確で再現性の体積測定を可能にし、時間を節約できます。

（a）は、96ウェルの単一細胞選別プレートに、前増幅ミックスは、0.2×アッセイ混合物、続いて最初に分配されます。 （b）は 、それぞれの単セル位置の記録は、スプレッドシート上で維持されるべきです。ウェルの細胞なしの「入力なし」ウェルと呼ばれ、コントロールとして使用することができます。 2つの行がcDNAの希釈（1セルに10 ⁵個^の細胞の等価からシーケンシャル1・イン・10希釈液）でプライマー効率を制御するために免れることができます。 （C）96ウェルアッセイプレートに、アッセイローディング試薬は、プライマーを添加し、最初に分配されます。各プライマーの位置のレイアウトを維持することを忘れないでください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

各プライマーの1.4μlの（; 48異なるプローブまで、 表1を参照のプライマー20倍）を添加することにより、1.5ミリリットルチューブで0.2×アッセイミックスを調製します。低EDTA TEバッファーで140μLへの最終的な音量を調整します。
プレ増幅混合物を含む96ウェルシングルセルソーティングプレート48ウェルに0.2×アッセイミックスの2.5μLを配布します。
注：96ウェルサンプルプレートの各ウェルの最終容量は9μlであるべきです。
カバーフィルムでプレートをシール。プレートをボルテックスし、45秒間280×gでスピンダウン。 -20℃で96ウェルシングルセルソーティングプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。

2.単一細胞解離

CO ₂の送達システムを使用して、低酸素によってマウスを安楽死させます。解剖プレートの上でマウスを修正し、ハサミを使って縦に腹腔を開きます。
肝臓からILCSを回復します。
1. 肝臓の分離に先立ち、フラッシュLIVER-循環細胞。
  1. 門脈を引き出すために、マウスの左側に小腸および大腸を移動します。門脈は、腹腔内の最大の静脈として表示されます。
  2. 10mLの注射器0.45ミリメートルの針を用いて、門脈を介してリン酸緩衝生理食塩水媒体（PBS）を用いて肝臓をフラッシュします。肝臓洗浄を容易にするために、ハサミで胃動脈を切りました。
  3. 胆嚢を削除するには、鉗子で胆嚢の底をつまんでハサミで肝臓から分離。
  4. 肝臓を単離するために、鉗子で肝臓のベースをピンチし、はさみを使用して、腹腔の残りの部分から肝臓を分離します。
  5. ロズウェルパーク記念研究所培地5mlの（RPMI）、2％ウシ胎児血清（FCS）でポッターチューブに肝臓を転送します。
乳棒を用いてメカニック解離で肝臓を解離。 15ミリリットルチューブにメディアを転送します。全量をRPMI、2％FCSを含む14ミリリットルに。肝細胞をデカントするために15〜20分間氷上で細胞懸濁液のままにしておきます。
1ミリリットルピペットを使用して、新しい15mlチューブ中（肝細胞なし）、上清を回収（上清の12ミリリットルを期待することができます）。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。遠心分離後、上清を捨てます。
密度勾配培地14 ml中の工程2.4で得られたペレットを再懸濁（ 例えば、パーコール40％）。 20℃で20分間、600×gでスピンダウン。吸引により上清を取り除きます。
酢酸カリウム（ACK）1mlにペレットを再懸濁します。 1分間室温のままにしておきます。 1分後、ハンクス平衡塩漬け溶液（HBSS）、2％FCSを含む14ミリリットルに全量を。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。上清を捨てます。
細胞を染色。
1. ビオチン化抗体混合物300μlの中にペレットを再懸濁（ 材料表を参照してください。すべてのビオチン化抗体を追加言及編）1.5 mlチューブに細胞を移します。 4℃で20分間、暗闇の中でそれを残します。
2. HBSS 2％FCSを1ミリリットルに全量を。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。（ 材料表を参照してください。上記のすべての蛍光色素結合抗体を追加）蛍光色素結合抗体混合物および蛍光標識ストレプトアビジン300μlの中にペレットを再懸濁。 4℃で20分間、暗闇の中でそれを残します。
HBSS 2％FCSを1ミリリットルに全量を。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。 1ミリリットルピペットを用いて上清を取り除きます。 1ミリリットルHBSSでペレットを再懸濁し、（PI; 1：4000）ヨウ化プロピジウム。
注：広く発現ILC細胞表面マーカーを使用する場合は、3集団が定義されています。NKp46の⁺ IL-7Rαを^- 、NKp46の⁺ ^IL-7Rα+、およびNKp46の^- ^IL-7Rα+。すべての集団は系統をソートされている^- CD3 ^- CD4 ^- CD45.2 ^+。

3.単一細胞蛍光活性化細胞選別（FACS）

単セル^13をソートするために、FACSを使用してください。
注：異なる細胞型は、同じ96ウェル単一細胞選別プレート上で選別することができる（ 図2）。
1. よく0.2×アッセイミックスし、96ウェルシングルセルソーティングプレート上のプレ増幅混合物を含むごとに1つのセルをソートするために、FACSを使用してください。新たに調製した96ウェルのシングルセルソーティングプレートを使用するか、-20℃で保存した場合、それを解凍。
  1. FACSプレートホルダーに密封された96ウェルプレートを置きます。テストとして、空の96ウェルプレートを使用してください。でプレートを置きA1ウェル左側にし、実験者の方へ。
  2. 検証ビーズでA1ウェルの中心の低下を得るために、プレートホルダーを調整します。
  3. ラインA内のすべてのウェルを有する繰り返し手順3.1.1.2
  4. 96ウェルプレートからシールを取り外して、ソートウェルあたり100検証ビーズ。 Dをチェック井戸の中心部にあるROP形成。
  5. 適切に調整すると、プレートホルダーに96ウェルのシングルセルソーティングプレートを配置します。プレートレイアウトやウェルあたりソート1セルを描画します。
    注：96ウェルシングルセルソーティングプレート上の各セルの適切な位置決めが不可欠です。プレートレイアウトは、表計算ソフト上で維持されるべきです。プレートレイアウトは、次のいくつかのステップ（ 図^1b）14で使用されます。細胞なしで96ウェルサンプルプレート上の1つのウェルを含む0.2×アッセイミックスとプレ増幅混合物を残します。このウェルは、無入力コントロールとして使用します。 cDNAの希釈のために6ウェルの2行を残します。これらのウェルは、プライマー効率（ 図1b）のためのコントロールとして使用されています。
  6. -20℃で96ウェルシングルセルソーティングプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。

4.プレ増幅

新鮮なまたは解凍した96ウェルのシングルセルソーティングプレートOBTを使用しますステップ3.1.1.6でained。（45秒間280 XG）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。
サーモサイクラー上の96ウェルシングルセルソーティングプレートを置きます。図3および表2に記載されたプログラムに従って逆転写およびプレ増幅を行います。

図3：プレ増幅プログラム。十分な材料を得るために、ソートされた単一の細胞に特異的な標的遺伝子のプレ増幅が必要です。 96ウェルの単一細胞選別板は、前増幅プログラムに従うことをサーモサイクラーにロードされています。前増幅産物は、その後、低EDTA TE緩衝液で希釈され、すぐに使用するか、または-20℃で凍結することができます。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プリアンプを希釈各ウェルに低いEDTAのTE緩衝液36μLを追加することにより、サンプルをlified。
カバーフィルムでプレートをシール。（45秒間280グラム）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。 -20℃で予備増幅し、96ウェルシングルセルソーティングプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。

5. 96ウェルサンプルプレートを準備

定量PCRマスターミックスとサンプルローディング試薬の17.5μlの175μlのを追加することによって、マスターミックスの191μLを準備します。
新しい96ウェルプレートに、各ウェル（最大48ウエル）にマスターミックスの3.6μLを配布します。これは、96ウェルサンプルプレートです。
新しい96ウェルプレートに96ウェルサンプルプレートからプレ増幅したcDNAの2.9μLを移します。 96単一細胞選別プレートと96ウェルサンプルプレート間の各サンプルに対して同じ位置にしてください。
カバーフィルムでプレートをシール。（45秒間280 XG）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。光から保護氷上で新しい96ウェルプレートを置きます。 96ウェルSを格納します-20℃で十分なプレートはすぐにそれを使用しますか。

6. 96ウェルアッセイプレートを準備します

新しい96ウェルプレートに、各ウェル（最大48のウェル）でアッセイローディング試薬の3μLを配布します。このプレートは、96ウェルアッセイプレートと呼ばれます。
各ウェルにプライマーの3μLを加えます。表計算ソフトでレイアウトを維持し（ 図1cおよび表1、 表1に記載されているすべてのプライマーを使用します）。 96ウェルアッセイプレート上の各プライマーの適切な位置決めは、次のいくつかのステップのために不可欠です。
1. サンプル数が48未満の場合、未使用のウェルに水の代わりにプライマーを加えます。
カバーフィルムでプレートをシール。（45秒間280 XG）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。 -20℃で96ウェルアッセイプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。
注：プライマーの凍結融解の繰り返しを避けるために、プレ増幅混合物のため、96 WELのためのプライマーを配布同時にリットルのアッセイプレート。

7.単一細胞遺伝子発現チップ

ベンチに統合されたマイクロ流体回路（IFC）を配置し、キャップされた注射器を使用してバルブを確認してください。、注射器を開き、バルブに垂直に置き、しっかりと押します。 Oリングが移動する必要があります。制御線流体（ツベルクリンの0.3ミリリットル）でチップを埋めます。
第二の弁で手順を繰り返し7.1。
注：いいえ液体がチップ上にこぼしてはなりません。
チップの底部から青いフィルムを削除します。 IFCコントローラにチップをロードします。 IFCコントローラの画面で、「PRIME」を選択し、「RUN」。マイクロ流体ラインの制御は、10分間続きます。
チップを取り出し、チップの底に青いフィルムを再密封します。

図4：単一細胞多重遺伝子発現チップ搭載。これらの手順は、グラムを必要とします特に、単一セルの多重遺伝子発現チップに96ウェルプレートの転送中reat精度、。ロードエラーとmisplacementsを回避するために、非常に順次動作することをお勧めします。各転送のためのボリュームは、ピペッティングプロセスの間に制御されなければなりません。最後に、気泡を回避し、形成した場合に、それらを除去することが重要です。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

8チャンネルピペット、転送チップのA1側（左側）に96ウェルアッセイプレートから5μLを使用しました。図4に示すように、チップの左側を埋めます。常に先端に同じボリュームを描画するように注意してください。
1. 泡を作成しないでください。泡が表示された場合は、10μlのヒントを使用してそれらを削除します。チップの各ウェルのためのヒントを変更します。
右側O上の繰り返し手順7.596ウェルサンプルプレートから5μLを使用してFチップ。
チップの底部から青いフィルムを削除します。 IFCコントローラにチップをロードします。 IFCコントローラの画面で、「RUN SCRIPT」を選択し、「RUN」。マイクロ流体ラインのロードは45分続きます。
チップを取り出し、チップの底に青いフィルムを再密封します。

8.チップを実行します。

マイクロ流体のqPCRコンピュータでは、「データ収集」ソフトウェアを選択します。それが開始されると、「新しいファイル名を指定して実行」を選択します。
「取り出し、「チップの底部から青い膜を除去し、チップのロードを選択します。左側に実験者に向かってA1ウェルを得るためにチップを置きます。
「プロジェクトの設定、 "その後" None "を選択し、上の「次へ」を
「新しいチップラン、「「新しいチップディレクトリ」（実験用のフォルダを作成）、および「Next]を選択します。」
「遺伝子発現」を選択し、「オン;パッシブリファレンス= ROX」（カルボキシ-X-ローダミン）および「単一プローブは、「プライマーに応じて適切なフィルタを選択選択します。「次へ」。
「ブラウズ」と使用するプライマーに応じて正しいプログラムを選択する]を選択します。
注：「デフォルト - 10分-Hotstart.pclは、「シングルセル多重RT-qPCRのための最も一般的に使用されるプログラムです。
「スタートファイル名を指定して実行」を選択します。反応は、約90分かかります。
いったん終了し、「取り出し-完了」を選択します。

9.データ解析

実験のフォルダを検索し、選択して "オープン"、 "リアルタイムPCR解析」ソフトウェアを開き、「ファイル」を選択し、「ChipRun.bmlファイルを。」
「分析ビュー」、「結果表」と「ヒートマップビューをクリックして、「 "X"でマークされたボックスは、閾値検出レベル未満であり、および/または不良な増幅曲線を有していました。
サンプルに名前を付けます。「サンプルの設定」に移動し、SEL電気ショック療法 "新SBS 96」「マッピング」をクリックして選択し、「...」をコピーして表計算ソフトからのサンプルレイアウト設計を貼り付けます。貼り付けレイアウトの定義」サンプル名。 "
アッセイに名前を付けます。繰り返しステップにおけるプライマーの名前を持つ9.3 "検出器のセットアップ。」貼り付けレイアウトの定義」を検出器の名前。 "
「分析ビュー」をクリックし、「分析; "サンプルおよびプライマー名は、サンプルおよびプライマー（ 図7）に自動的に関連付けられます。
CT、デルタのCtを計算し、各サンプルの変更を折ります。内部統制（ここでは、GAPDH）としてハウスキーピング遺伝子を使用します。
ΔCt= Ctを_サンプル - Ctを_内部統制
= 2倍変化^{- （ΔCtsample-ΔCtnegative制御）}
1. （遺伝子発現を正規化するための内部コントロールとしてハウスキーピング遺伝子を使用）」検出器のセットアップ」をクリックし、無入力コントロールとよくを選択します。選択して "Editor、 ""、参照を定義」と「更新」。
2. 上記に定義された内部統制が適用されると、すべてのウェルを選択します。「エディタ」を選択し、「テストとして定義しています。」適切なリファレンス遺伝子を選択し、クリックして「更新」を
3. よくネガティブコントロールを選択するには、「サンプルの設定」を選択します。「エディタ」を選択し、定義する「リファレンス」を参照してください。「更新」をクリックします。
4. 「分析ビュー」を選択し、「分析; "デルタCTおよび倍の変化を自動的に計算されます。
データをエクスポートします。、表の結果」として保存、エクスポート」「ファイル」と選択」先のフォルダを選択し、ヒット "保存"と "終了"。
繰り返しステップ9.7が、代わりの「表の結果、「名前を付けて保存」ヒートマップの結果。」

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Representative Results

リンパ系集団は、遺伝子発現に大きな多様性を示します。このプロトコルでは、肝臓ILC区画の不均一は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を用いて調べました。他の遺伝子発現技術とは異なり、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を同時に、さらに希少、いくつかの集団での作業を可能にします。クローンレベルで高感度に結合されたこの特異性は、集団内で希少な集団間の遺伝子特性の違いを調査することができます。一例として、4週齢のマウスの肝臓から3 ILC集団の遺伝子サインを評価しました。他の2つは肝臓で（系統陰性細胞の1％未満）はまれであるのに対し、一つの人口は、容易に識別するのに十分に頻繁です。

96ウェルシングルセルソーティングプレートと96ウェルアッセイプレートは、肝dissectio前に調製しましたnおよび解離（ 図1）。各ミックスは無菌フード下で調製し、ボリューム精度と再現性のための電子ピペットで配布されました。全ての試薬は、均質性を維持するために、ピペッティングの前にボルテックスしました。調製後、96ウェル細胞選別プレートを細胞選別まで凍結することができ、そして96ウェル細胞アッセイプレートを、IFC負荷まで凍結することができます。

肝臓を解剖し、単細胞懸濁液に解離しました。細胞を染色し、解凍した96ウェルのシングルセルソーティングプレート上で選別しました。 FACSを使用して、3 ILC集団は、広く発現ILCマーカー（ 図2）に基づいて分類しました。細胞選別の後、cDNAを合成し、そして特定の標的遺伝子は、（図3および表2）を増幅しました。前増幅ステップの後、cDNAを、低EDTA TE緩衝液中に希釈しました。単一細胞からのプライマーおよびcDNAは、IFCチップ（Fiの上にロードしました。gures 4及び図5a）。得られた結果（ 図7a）は 、簡単に読んだり解析（ 図7b）のために簡略化されました。適切または不適切にロードされたチップの例は、（ 図5）が示されています。異なる増幅信号に適切にロードされ、チップ（ 図6）のFAMの図が示されています。

結果は、適切な細胞を選別した後、前増幅、およびロードすることを示し、ILC集団は、成体野生型マウスの肝臓（ 図7）での遺伝子発現のために異種の表示します。オンラインソフトウェアを使用して、細胞特異的遺伝子発現シグネチャ（図7,8）と細胞集団との関係（ 図8）を同定することができました。各ソート人口は、遺伝子発現に富む特定の遺伝子特性を持っています。例えば、NKp46のように選別された細胞^- ^{IL-7Rα+は、}電子を持っていますRORC、グループ3 ILCSの主な転写因子のnriched発現; RORA、RORC -homologous転写因子;およびIL-23RとCXCR6、肝臓内のグループ3 ILC肝マーカーの二つの重要な受容体。同じ観察は、NKp46の⁺ IL-7Rαで作ることができる^-とNKp46の⁺ ^IL-7Rα+集団。各セルは、無効な井戸を除外するために、ハウスキーピング遺伝子の発現（HPRT、法律 、およびGAPDH）のためにチェックされています。少なくとも二つのハウスキーピング遺伝子は、有効なものとして値を考慮することが表現されなければなりません。

遺伝子シグネチャーに基づいて^-興味深いことに、この技術は、NKp46の⁺ IL-7Rαの2亜集団を定義することができます。これらの2つの署名間の差異は、異なる機能の実験の他のセットによって検証されなければなりません。

図2：FACS細胞戦略。画像は、4週齢のマウスから単離された肝細胞の代表です。 （a）は、FSC-A / SSC-ゲーティング、（b）は FSC-H / FSC-Wダブレット差別、（C、D、E）を生きている、系統陰性CD45.2 ⁺ CD4 ^- CD3 ^-細胞は、ゲーティング。 ^- 、NKp46の⁺ ^IL-7Rα+、およびNKp46の^- ^IL-7Rα+ NKp46の⁺ IL-7Rα：（f）は広範に発現ILC細胞表面マーカーを使用して、我々は3集団を定義しました。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：適切のROXの数字（A）と不適切に（b）のチップをロードしました。 （a）は、正しくロードされた単一細胞の多重遺伝子発現チップは直線と行で表示されます。各反応チャンバは、充填され、同じ寸法を有しています。 （b）は不適切ロード単一セルの多重遺伝子発現チップ。反応室の空行と行は（緑色の四角形）が表示され、同様に折り曲げ線（青い四角）。これらの機能は、不適切な「PRIME」または「LOAD」の手順にだけでなく、IFCウェル中の残留泡にすることができます。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6：正常にロードされたチップのFAM（フルオレセインアミダイト）の図。数サイクル後（サンプル上及びプライマーに応じて）を評価sが、反応室の明るさの違いが表示されます。増幅信号に反応チャンバはないか、または低増幅信号との反応室（緑色の四角形）よりも明るく（青い四角）を表示されます。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7（a） の前に、（b）は修正後に得られたヒートマップ。 （a）は、ダイレクトヒートマップは、分析や分析/サンプル順序を変更することなく得られます。 （b）は 、サンプルおよびアッセイ名定義した後に得られたヒートマップを変更しました。全く増幅が発生しなければ何も入力ウェル（青い四角）が得られません。非効率的なプライマー（緑の四角）。 cDNA希釈試験（紫色の四角）。 e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8：単一細胞集団のクラスタリング。データ解析ソフトウェアは、集団間のクラスタリングを決定するために使用されます。無料クラスタリングソフトウェアは、オンラインで入手できます。単一細胞の全発現プロファイルを評価することによって、ソフトウェアは、遺伝子署名と細胞集団との関係を表示することができます。各正方形は、セルを表します。青はNKp46の⁺ IL-7Rαある^{- 、}赤はNKp46の⁺ ^IL-7Rα+、および緑であるNKp46- ^IL-7Rα+です。各集団は、特定の遺伝子の署名を持っています。 NKp46の⁺ IL-7Rα内^-集団、2つの署名は、集団の不均一性を証明、見ることができます。4858 / 54858fig8large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プライマー
ACTB	IL-23R
AES	IL-2RA
アール	IL-2RB
BCL2	II-7RA
c-myc	Klr5
CBFB	LEF1
CD27	NCR1
Cd49a	Nfil3
Cd49b	Notch1
CXCR5	Notch2と
CXCR6	RORA
Eomes	RORC
ETS1	RUNX3
FOXO1	Tbx21
GAPDH	TCF3
GATA3	Tcf7
GM-CSF	Tle1
Hes1を	Tle3
HPRT	Tsc22d3
ID2	Tnfrsf11a
IL-12rb2	トックス
IL-18r1	Zbtb16
IL-1rl1	Zbtb7b
IL-22

表1：プライマーリスト。

表2：プレ増幅プログラム。前増幅プログラムの各ステップがサイクル時間、温度、および数に関する完全な情報を示しています。

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Discussion

このプロトコルは、クローンレベルでの網羅的な遺伝子発現情報を取得する方法について説明します。ここでは、肝臓ILCコンパートメントの不均一性を調べました。（広く発現ILC表面マーカーに基づいて）異なるILC集団の単一細胞選別後、サンプルを特定の予め選択された遺伝子のための予備増幅しました。次に、得られたcDNAおよびプライマーは、多重RT-qPCRをマイクロ流体チップにロードしました。最後に、我々は48の単一細胞からの48の異なる遺伝子の発現を得ました。遺伝子発現の結果は、遺伝子サイン及び細胞集団の関係を調査するためのオンラインソフトウェアによって分析しました。

この手法の主な利点は、同時に複数の遺伝子の発現を評価する能力です。また、クローンレベルで、非常にまれな集団での作業を可能にします。遺伝子発現は、クローンレベルで評価されているので、従来のRT-qPCRの方法とは異なり、単一セル多重RT-qPCRを、ない平均化効果がありません。このようにして、集団内の不均一性を検出し、分析することができます。ごく少数の細胞が遺伝子発現の全体の情報を得るために必要とされるので、単一細胞RT-qPCRの発現は、非常に稀な集団での作業を可能にします。また、細胞の異なる集団は、同じプレート上で試験することができます。これは、オンラインデータツール、細胞集団との関係を評価して、集団間の遺伝子特性の違いの検出を可能にし。この技術は、他の利点を提供します。シングルセル多重RT-qPCRを、最近のマイクロ流体の進歩の利点があります。 IFC室に必要なボリュームは、ナノリットルのレベルを超えないようにしてください。したがって、試薬のより少ない量は、実験のコストを低減すること、使用されます。最後に、分注工程の全体的な数は、それによってピペット誤差の可能性を制限し、減少されます。手順はすべてのセルの同時であり、高速かつ時間節約の方法で作業を可能にする、マルチチャンネルピペットを用いて行うことができます。得られた結果クローンレベルは、信頼性の高い、再現可能であり、かつ堅牢なデータ分析を実行するために使用することができます。

シングルセル多重RT-qPCRを、しかし、いくつかの制限を提示ありません。まず、この技術は、マイクロ流体チップ、マイクロ流体チップのコントローラ、および特定のサーモサイクラーとして、高価で特殊な設備を必要とします。従来のRT-qPCRを用いて、多数の研究が、統計的に有意な比較を得るために必要とされ、以来、従来のRT-qPCRの方法とは異なり、この技術は、時間と試薬を節約です。このプロトコルでは、我々は、48の遺伝子の遺伝子発現を得るための手順を提示します。 96から96マルチプレックスRT-qPCRをマイクロ流体チップが用意されています。これらのチップは、同時に96細胞からの96の遺伝子の遺伝子発現を評価することができます。精度及び細胞純度が最大でなければならないため、細胞選別の際に、出発細胞の最小数は、必要とされています。しかし、少数の細胞で、単一セル多重RT-qPCRの遺伝子のexpのためにソートすることも可能ですression（ステップ3）。最後に、単一セル多重RT-qPCRを、敏感な方法です。別のテストでは、そのような実験を開始する前に実行する必要があります。例えば、プライマーの標的特異性のために、プライマーは、増幅効率のために、ターゲットの相対競争のためにテストする必要があります。

プロトコルのいくつかのステップは、慎重に行わなければなりません。ピペット操作ミスの危険性を高めると同時に、試料および多数のアッセイと組み合わせて少量の操作は、（ステップ1、4、5、6、7）。すべての試薬およびミックスは均質な溶液を確保するために前にピペッティングにボルテックスする必要があります。プレ増幅（ステップ4）中の蒸発はまた、最終結果に影響を与えることができます。プレートは常に正しく、適切なカバーフィルムで密封する必要があります。戦略をソートするプレート内のウェル中の死細胞または複数のセルを避けるために（ステップ3）非常に正確でなければなりません。マシンをFACSソーティングは現在、シングルセルソーティングindが装備されています特定のセルを各ウェルにソートされた記録することができます元のソフトウェア。この新しいツールは、遺伝子サインは、細胞表面マーカーの強度に相関しているかどうかの決意の対象であろう。これは実験（ステップ1、5、および6）のために不可欠であるとして、チップ上のサンプルおよびアッセイ位置は、細心の注意を払って組織化されなければなりません。最後に、プライマー（ステップ1,6）の選択は重要なステップです。すべてのプライマーは、以前に記載された結果や期待される結果に基づいて選択する必要があります。評価された遺伝子のセット中のプライマーのランダムな選択は、実験の最終的な読み出しを損なう可能性があります。さらに、細胞選別に使用される細胞表面マーカーと相関するプライマーは、ハウスキーピング遺伝子と対照として使用しなければなりません。

クローンレベルでの多重遺伝子発現を評価することは、以前の研究に比べて肝臓ILC異種のコンパートメントの優れた特徴付けを提供しています。オンラインソフトウェアによって供給されたこの技術は、より正確にDを記載します唯一の細胞表面マーカーを用いた研究よりも恒常性で、肝臓におけるILCのifferentサブセット。また、細胞集団の関係を考慮すると、分化ネットワークを構築することが可能です。単一細胞の遺伝子発現に基づく遺伝子シグネチャーは、また、細胞集団の特徴を識別し、潜在的な役割を調べるための重要なツールです。単一セルマルチプレックスRT-qPCRを、信頼性の高いデータを得るために、遺伝子発現分析のための最高の技術の一つです。これらのデータは、バイオインフォマティクスソフトウェア¹⁵と容易に管理しています。このようなマイクロアレイまたはRNA配列決定のような遺伝子発現研究のための他の技術、に関しては、単一セルの多重RT-qPCRを、高感度を提供しています。単一細胞分析の他のアプローチが記載されており、単一セルマルチプレックスRT-qPCRを^{^{^15、16}}に相補的な手法として使用することができます。さらに、技術はallowin、任意のプライマーの組み合わせを用いて行うことができますグラムユーザーはパーソナライズされた遺伝子シグネチャーを見て。他の多くのアプリケーションは、この手法で使用することができます。例えば、開発全体の細胞の経時的遺伝子発現は、発達中の分子プロフィールの変更を評価するために行うことができます。細胞に対する薬剤の影響はまた、遺伝子発現に対する薬剤の効率のしきい値を決定するために、薬物希釈調べることができます。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells Direct One Step qRT-PCR kit	Applied Biosystems	11753100	Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme.
Low TE EDTA Buffer	Affymetrix	75793 100ML
96-well plates	Thermofisher Scientific	AB 1100	96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
Cover film	Dominique Dutscher	106570	aluminium cover film; avoid contamination and evaporation
Actb	Thermofisher Scientific	Mm00607939_s1	20x primer
Aes	Thermofisher Scientific	Mm01148854_s1	20x primer
Ahr	Thermofisher Scientific	Mm00478932_s1	20x primer
Bcl2	Thermofisher Scientific	Mm00477631_s1	20x primer
c-myc	Thermofisher Scientific	Mm00487804_s1	20x primer
Cbfb	Thermofisher Scientific	Mm01251026_s1	20x primer
Cd27	Thermofisher Scientific	Mm01185212_s1	20x primer
Cd49a	Thermofisher Scientific	Mm01306375_s1	20x primer
CD49b	Thermofisher Scientific	Mm00434371_s1	20x primer
Cxcr5	Thermofisher Scientific	Mm00432086_s1	20x primer
Cxcr6	Thermofisher Scientific	Mm02620517_s1	20x primer
Eomes	Thermofisher Scientific	Mm01351985_s1	20x primer
Ets1	Thermofisher Scientific	Mm01175819_s1	20x primer
Foxo1	Thermofisher Scientific	Mm00490672_s1	20x primer
Gapdh	Thermofisher Scientific	Mm03302249_s1	20x primer
Gata3	Thermofisher Scientific	Mm00484683_s1	20x primer
Gm-csf	Thermofisher Scientific	Mm01136644_s1	20x primer
Hes1	Thermofisher Scientific	Mm01342805_s1	20x primer
Hprt	Thermofisher Scientific	Mm00446968_s1	20x primer
Id2	Thermofisher Scientific	Mm01293217_s1	20x primer
Il-12rb2	Thermofisher Scientific	Mm00711781_s1	20x primer
Il-18r1	Thermofisher Scientific	Mm00515178_s1	20x primer
Il-1rl1	Thermofisher Scientific	Mm00434237_s1	20x primer
Il-22	Thermofisher Scientific	Mm001226722_s1	20x primer
Il-23r	Thermofisher Scientific	Mm00519943_s1	20x primer
Il-2ra	Thermofisher Scientific	Mm01340213_s1	20x primer
Il-2rb	Thermofisher Scientific	Mm01195267_s1	20x primer
IL-7r	Thermofisher Scientific	Mm00434295_s1	20x primer
Klr5	Thermofisher Scientific	Mm04207528_s1	20x primer
Lef1	Thermofisher Scientific	Mm00550265_s1	20x primer
Ncr1	Thermofisher Scientific	Mm01337324_s1	20x primer
Nfil3	Thermofisher Scientific	Mm01339838_s1	20x primer
Notch1	Thermofisher Scientific	Mm00435249_s1	20x primer
Notch2	Thermofisher Scientific	Mm00803069_s1	20x primer
Rora	Thermofisher Scientific	Mm01173766_s1	20x primer
Rorc	Thermofisher Scientific	Mm01261022_s1	20x primer
Runx3	Thermofisher Scientific	Mm00490666_s1	20x primer
Tbx21	Thermofisher Scientific	Mm01299453_s1	20x primer
Tcf3	Thermofisher Scientific	Mm01175588_s1	20x primer
Tcf7	Thermofisher Scientific	Mm00493445_s1	20x primer
Tle1	Thermofisher Scientific	Mm00495643_s1	20x primer
Tle3	Thermofisher Scientific	Mm00437097_s1	20x primer
Tsc22d3	Thermofisher Scientific	Mm01306210_s1	20x primer
Tnfrsf11a	Thermofisher Scientific	Mm00437132_s1	20x primer
Tox	Thermofisher Scientific	Mm00455231_s1	20x primer
Zbtb16	Thermofisher Scientific	Mm01176868_s1	20x primer
Zbtb7b	Thermofisher Scientific	Mm00784709_s1	20x primer
qPCR Master mix	Applied BioSystems	P/N 4304437
2x Assay Loading Reagent	Fluidigm	P/N 85000736	Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip.
2x Sample Loading Reagent	Fluidigm	P/N 85000735	Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip.
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip	Fluidigm	BMK-M-48.48	48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller	Fluidigm	89000020	48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers
mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler	Fluidigm	GE48.48	48.48 Dynamic Array IFC thermocycler
96-well plates	Thermofisher Scientific	AB 1100	96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
C57Bl/6 mice	Janvier	C57Bl/6 miceJ@RJ
10 ml syringe	BD Biosciences	309639
PBS	Life Technologies	14040174
HBSS	Life Technologies	24020133
RPMI	Life Technologies	61870044
FCS	CVFSVF000U	Eurobio Abcys	Standard fetal calf serum
Potter tube	N/A
15 ml tube	Corning	352097
1.5 ml tube	Sigma-Aldrich	T9661-1000EA
FACS machine	N/A
centrifuge	Thermofisher Scientific	75004538
1,000 µl tips	Fisher Scientific	10313272
P1000	Gilson	F123602
Percoll	Dominique Dutscher	17-0891-01
Facs tube	Falcon	352235
anti-CD8 Biotin mouse antibody	Sony	1103520	lineage antibody
anti-CD19 Biotin mouse antibody	Sony	1177520	lineage antibody
anti-TCRab Biotin mouse antibody	BioLegend	109204	lineage antibody
anti-TCRgd Biotin mouse antibody	BD Biosciences	553176	lineage antibody
anti-Ter119 Biotin mouse antibody	BD Biosciences	553672	lineage antibody
anti-Gr1 Biotin mouse antibody	BD Biosciences	553125	lineage antibody
anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody	BioLegend	109828
anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody	ebioSciences	25-1271-82
anti-CD3 BV510 mouse antibody	BD Biosciences	563024
anti-CD4 BV786 mouse antibody	BD Biosciences	563727
anti-NKp46 PE mouse antibody	ebioSciences	12-3351-82
Streptavidin	Sony	2626025
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Electronic pipette	Eppendorf	4986000017
Combitips 0.1 ml	Eppendorf	30089405
Multichannel pipette	Rainin	L8-10XLS+
Accudrop	BD Biosciences	345249	verification beads for FACS