Summary
Questo protocollo descrive come valutare l'espressione di una vasta gamma di geni a livello clonale. Single-cell RT-qPCR produce risultati altamente affidabili con una forte sensibilità per le centinaia di campioni e geni.
Abstract
Espressione genica eterogeneità è una caratteristica interessante per indagare nelle popolazioni linfoidi. Espressione genica in queste cellule varia durante l'attivazione delle cellule, stress, o la stimolazione. Single-cell espressione genica multiplex consente la valutazione simultanea di decine di geni 1, 2, 3. A livello di singola cellula, l'espressione genica multiplex determina popolazione eterogeneità 4, 5. Esso permette la distinzione di eterogeneità della popolazione per determinare sia la probabile mix di diversi stadi precursori tra cellule mature e anche la diversità delle risposte delle cellule agli stimoli.
Cellule linfoidi innate (ILC) Recentemente sono state descritte come una popolazione di effettori innate della risposta immunitaria 6, 7. In questo protocollo, l'eterogeneità delle cellule della ILC haVano Patic è indagato durante l'omeostasi.
Attualmente, la tecnica più utilizzata per valutare l'espressione genica è RT-qPCR. Questo metodo misura l'espressione genica solo un gene alla volta. Inoltre, questo metodo non può stimare eterogeneità di espressione genica, poiché più celle sono necessari per una prova. Questo porta alla misurazione dell'espressione genica media della popolazione. Nel valutare un gran numero di geni, RT-qPCR diventa un tempo-, e il metodo di campionamento che consumano reagent-. Quindi, i compromessi limitano il numero di geni o popolazioni di cellule che possono essere valutati, aumentando il rischio di perdere il quadro globale.
Questo manoscritto descrive come multiplex singola cellula RT-qPCR può essere utilizzato per superare queste limitazioni. Questa tecnica ha beneficiato di recente microfluidica progressi tecnologici 1, 2. Le reazioni che si verificano in multiplex chip RT-qPCR non lo fanno exceed il livello nanolitro. Quindi, l'espressione genica cella singola, nonché simultanea espressione genica multipla, possono essere eseguite in un reagent-, di prova e conveniente modo. È possibile testare genica firma eterogeneità a livello clonale tra sottogruppi di cellule in una popolazione a diversi stadi di sviluppo o in diverse condizioni 4, 5. Lavorando in rare popolazioni con un gran numero di condizioni a livello di singola cellula non è più una limitazione.
Introduction
Nel corso degli ultimi anni, le cellule linfoidi innate (ILCS) sono stati sempre più studiati. Nonostante la loro mancanza di recettori antigene-specifiche, essi appartengono al lignaggio linfoidi e rappresentano sentinelle importanti per l'omeostasi dei tessuti e l'infiammazione. ILCs sono attualmente divisi in tre gruppi in base alla loro espressione di specifiche combinazioni di fattori di trascrizione e sulla loro capacità di produrre citochine 6, 7.
ILC contribuiscono a numerose situazioni omeostatici e fisiopatologici in diversi organi attraverso la produzione di citochine specifiche 8, 9. Per essere in grado di comprendere il ruolo di queste cellule, è importante determinare le varie sottopopolazioni ILC per organo e per identificare le loro relazioni evolutive. Inoltre, fenomeni di plasticità tra i diversi sottoinsiemi sono stati correlati. Studiando l'eterogeneitàdelle cellule presenti in un organo, è possibile delimitare la loro fase di maturazione e distinguere le loro funzioni specifiche.
Per illustrare la tecnica di multiplex cella singola RT-qPCR, ILC epatici sono stati scelti, con una particolare attenzione per la loro eterogeneità all'interno dello stesso gruppo ILC (tipo 1 ILC) 10. Innanzitutto, attraverso l'uso di citometria a flusso, tre popolazioni ILC distinti stati caratterizzati nel fegato. Gruppo 1 ILC rappresenta circa il 80% degli effettori innati, mentre le altre due popolazioni sono rari popolazioni ILC epatiche (meno del 5% degli effettori innati). Quelle popolazioni sono stati ordinati utilizzando marcatori superficie cellulare ampiamente espresse delle popolazioni ILC. Come risultato, scelti popolazioni ILC nel fegato guardano uno sostanzialmente simile ad un altro.
Multiplex cella singola RT-qPCR è emerso come uno dei migliori tecniche per investigare prontamente l'eterogeneità di queste popolazioni 11
Avanti, di classificare tutte le cellule con un fenotipo ILC globale, un'ampia panoramica della espressione genica multiple del fegato popolazioni ILC si ottiene, anche se rappresentano popolazioni estremamente rari. Un chip microfluidica-based consente la sperimentazione con ancorauna piccola quantità di materiale cellulare. Di conseguenza, i profili di espressione genica di popolazioni di cellule rare possono essere ottenuti. Usando in linea gene firma software di analisi, i cluster di popolazione cellulare e potenziali relazioni di cellule può essere indagato. Di conseguenza, i test funzionali possono essere eseguiti per convalidare i dati di clustering al livello in vivo.
Decine di espressione genica può essere stabilita contemporaneamente su centinaia o più celle singole sullo stesso chip 3, 11, 12. Progettazione del saggio è la parte più lunga e più importante di questo esperimento. La determinazione dei geni rilevanti per l'ipotesi da testare è fondamentale per ottenere risultati rilevanti. In secondo luogo, sono necessari dei controlli interni (come marcatori di superficie noti utilizzati per l'ordinamento) e controlli specifici. Ciò è fondamentale per testare la specificità di primer di amplificazione, l'efficienza dell'amplificazione, e tegli assenza di concorrenza primer. Pertanto, lavorando con multiplex cella singola RT-qPCR è una tecnica risparmiare tempo, come espressione multipla gene di una cella è valutata allo stesso tempo.
Utilizzando lo stesso chip e miscelazione dei reagenti per tutte le celle limita i possibili errori di manipolazione e consente riproducibilità tra i campioni. Complessivamente, i diversi aspetti della multiplex singola cellula RT-qPCR consente la produzione di risultati altamente affidabili a livello clonale, con un grande livello di sensibilità per un'ampia varietà di campioni e geni. I risultati ottenuti offrono dati potenti e affidabili per i test di biostatistica.
Ciò può essere ottenuto grazie all'aspetto microfluidica del metodo, che consente di lavorare su piccolissime quantità di materiale e porta a risultati esaustivi. Infine, utilizzando software online, è possibile confrontare le popolazioni desiderati.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati del da parte del Comitato per la sicurezza dell'Istituto Pasteur in conformità con l'agricoltura Ministero francese e gli orientamenti UE.
1. Preparare un 96 pozzetti Ordinamento Piastra Single-cell
- Preparare mix pre-amplificazione in una provetta da 1,5 ml aggiungendo 5,0 ml di specifiche tampone retrotrascrizione, 1,3 ml di bassa dell'acido etilendiamminotetraacetico tampone (EDTA) TE (10 soluzione mM TE, pH 8, e la soluzione 0,1 mM EDTA, 0,2 mM filtrato ), e 0,2 ml di Taq DNA polimerasi per pozzetto (Figura 1a).
- Su una piastra a 96 pozzetti, distribuire 6,5 microlitri di miscela pre-amplificazione in ciascun pozzetto (fino a 48 pozzetti). Questa piastra è la piastra di ordinamento cella singola 96 pozzetti.
NOTA: L'utilizzo di un pipetta elettronica è consigliato per questo protocollo. Permette di misure precise e riproducibili del volume e fa risparmiare tempo.
2. La dissociazione Single Cell 3. Single-cell fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 4. Pre-amplificazione 5. preparare un campione piastra a 96 pozzetti 6. Preparare una piastra Assay ben 96 7. Single-cell gene-espressione Chip 8. Eseguire il Chip 9. Analisi dei dati 
NOTA: Il volume finale in ciascun pozzetto della piastra del campione 96 pozzetti dovrebbe essere 9 microlitri.
NOTA: Quando si usano i marcatori di superficie cellulare ILC ampiamente espressi, sono definiti 3 popolazioni: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, e NKp46 - IL-7Rα +. Tutte le popolazioni sono ordinati lignaggio - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
NOTA: tipi di cellule differenti possono essere scelti sulla stessa piastra a 96 pozzetti classificare singola cellula (Figura 2).
NOTA: Il corretto posizionamento di ogni cella sulla piastra di smistamento 96 pozzetti singola cellula è essenziale. Un layout piatto dovrebbe essere mantenuta su un foglio elettronico. Il layout piastra sarà utilizzato nei successivi passaggi (Figura 1b) 14. Lasciare un pozzetto contenente miscela test 0.2x e mix di pre-amplificazione sul piatto del campione a 96 pozzetti, senza cellule. Questo pozzetto viene usato come controllo non-input. Lasciare due file di 6 pozzetti per una diluizione cDNA. Questi pozzi sono utilizzati come controlli per l'efficienza di primer (Figura 1b). 
Figura 3: programma di pre-amplificazione. Per avere materiale sufficiente, è necessario pre-amplificazione specifici geni bersaglio su singole cellule ordinati. La piastra di ordinamento monocellulari 96 pozzetti è caricato su un termociclatore a seguire il programma pre-amplificazione. I prodotti pre-amplificazione vengono diluiti con bassa EDTA tampone TE e possono essere utilizzati immediatamente o congelati a -20 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
NOTA: per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento dei primer, distribuire i primer per il mix di pre-amplificazione e per il 96-WELl piastra di test allo stesso tempo.
NOTA: Nessun liquido deve essere versato sopra il chip. 
Figura 4: Single-cell multiplex di espressione genica di chip di carico. Questi passaggi richiedono gprecisione reat, in particolare durante il trasferimento della piastra a 96 pozzetti per il multiplex gene chip-espressione della singola cellula. Per evitare errori di carico e misplacements, si consiglia vivamente di lavorare in modo sequenziale. Il volume preso per ogni trasferimento deve essere controllata durante il processo di pipettaggio. Infine, è importante per evitare eventuali bolle e per rimuoverli in caso di formazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
NOTA: "Default-10min-Hotstart.pcl" è il programma più utilizzato per multiplex cella singola RT-qPCR.
ΔCt = Ct campione - controllo interno Ct
Piegare Change = 2 - (controllo ΔCtsample-ΔCtnegative)
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Representative Results
popolazioni linfoidi grandi differenze in termini di espressione genica. In questo protocollo, fegato vano ILC eterogeneità è stata studiata usando multiplex cella singola RT-qPCR espressione genica. A differenza di altre tecniche di espressione genica, multiplex cella singola RT-qPCR espressione genica permette lavori su varie popolazioni, anche i più rari, allo stesso tempo. Questa specificità, accoppiato con un elevata sensibilità a livello clonale, permette la ricerca di differenze di firme gene in una popolazione e tra le rare popolazioni. Come esempio, le firme gene di 3 popolazioni ILC dal fegato di 4 settimane di età topi sono stati valutati. Una popolazione è abbastanza frequente essere facilmente identificati, mentre gli altri due sono rari (meno dell'1% delle cellule della linea-negativo) nel fegato.
Un piatto di smistamento 96 pozzetti a cella singola e una piastra a 96 pozzetti test sono stati preparati prima dissectio fegaton e la dissociazione (Figura 1). Ogni miscela è stata preparata sotto cappa sterile e distribuito con una pipetta elettronica per la precisione il volume e riproducibilità. Tutti i reagenti sono stati in agitazione prima di pipettaggio per mantenere l'omogeneità. Dopo la preparazione, la piastra di ordinamento cella 96 pozzetti possono essere congelati fino classificare cellulare, e la piastra di dosaggio cella 96 pozzetti possono essere congelati fino IFC carico.
I fegati sono stati sezionati e dissociate in cella singola sospensioni. Le cellule sono state colorate e scelti sulla scongelati 96 pozzetti smistamento unicellulari. Utilizzando FACS, 3 popolazioni ILC sono stati ordinati in base a indicatori ILC ampiamente espressi (Figura 2). Dopo l'ordinamento delle cellule, cDNA è stato sintetizzato, e specifici geni bersaglio sono stati amplificati (Figura 3 e Tabella 2). Dopo la fase di pre-amplificazione, cDNA è stato diluito in tampone di EDTA partire TE. Fondi e cDNA da singole cellule sono stati caricati sul chip IFC (Fifigure 4 e 5 bis). I risultati ottenuti (Figura 7a) sono state semplificate per agevolare la lettura e analisi (figura 7b). Esempi di chip loro corretto caricati sono mostrati (Figura 5). Viene mostrata una figura FAM di un chip caricata correttamente (figura 6) con differenti segnali di amplificazione.
I risultati dimostrano che dopo opportuna selezione cellulare, pre-amplificazione, e il caricamento, la popolazione ILC appare eterogenea per l'espressione genica nel fegato di topi wild-type adulti (Figura 7). Utilizzando il software on-line, le firme di espressione genica specifica delle cellule (figure 7 e 8) e le relazioni di popolazione di cellule (Figura 8) potrebbe essere identificato. Ogni popolazione ordinato ha una firma gene specifico arricchito in espressione genica. Per esempio, le cellule ordinati come NKp46 - IL-7Rα + avere eespressione nriched del RORC, il fattore di trascrizione principale del gruppo 3 ILCs; Rora, un fattore di trascrizione -homologous RORC; e IL-23R e Cxcr6, due recettori importanti del gruppo 3 marcatori epatici ILC nel fegato. Le stesse osservazioni possono essere fatte con NKp46 + IL-7Rα - e le popolazioni NKp46 + IL-7Rα +. Ogni cella è controllato per l'espressione del gene housekeeping (HPRT, Act, e GAPDH) per escludere i pozzi non validi; almeno due geni housekeeping devono essere espressi a prendere in considerazione i valori come validi.
È interessante notare, questa tecnica permette la definizione di due sottopopolazioni di NKp46 + IL-7Rα - base alle firme del gene. Le differenze tra queste due firme devono essere convalidato da altri gruppi di differenti esperimenti funzionali.
![figura 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Figura 2: la strategia delle cellule FACS. Le immagini sono rappresentative delle cellule epatiche isolate da 4 settimane di età topi. (A) FSC-A / SSC-A gating, la discriminazione doppietto (b) FSC-H / FSC-W, (c, d, e) vivo, lignaggio negativo CD45.2 + CD4 - CD3 - cellule gating. (F) Utilizzo di marcatori superficie cellulare ILC ampiamente espresse, abbiamo definito 3 popolazioni: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, e NKp46 - IL-7Rα +. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: figure ROX di correttamente (un) E in modo improprio (b) caricati chip. (A) caricata correttamente cella singola chip di multiplex di espressione genica dovrebbe essere visualizzato con linee rette e righe. Ogni camera di reazione viene riempito e ha la stessa dimensione. (B) non correttamente caricata multiplex gene chip-espressione cella singola. linee e filari di camere di reazione vuoti appaiono (quadrato verde), così come le linee di piegatura (blu quadrati). Queste caratteristiche possono essere dovuti a impropria "PRIME" o passaggi "carico", così come per le bolle residue nei pozzetti IFC. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: FAM (fluoresceina amidite) figura di un chip caricata correttamente. Dopo pochi cicli (a seconda sui campioni e sul fondo s valutato), dovrebbero apparire differenze di luminosità camera di reazione. camere di reazione con un segnale di amplificazione dovrebbe apparire più luminoso (quadrato blu) di camere di reazione con nessuna o segnali di amplificazione bassi (quadrato verde). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: mappa di calore ottenuto prima (A) e dopo (b) delle modifiche. (A) mappa di calore diretto ottenuto senza l'analisi o la modifica del modo saggio / campione. (B) mappa di calore Modificato ottenuto dopo il campione e il dosaggio definizione nome. Non ci sono pozzi di ingresso (blu quadrati) si ottengono se si verifica nessuna amplificazione. primer inefficienti (quadrato verde). test di diluizione cDNA (piazza viola). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Single-cell popolazione clustering. Un software di analisi dei dati è utilizzato per determinare il raggruppamento tra le popolazioni. gratuito del software di clustering sono disponibili online. Valutando l'intero profilo di espressione di una singola cellula, il software in grado di visualizzare le firme genetiche e le relazioni popolazioni cellulari. Ogni quadrato rappresenta una cella: blu sono NKp46 + IL-7Rα -, rosso sono NKp46 + IL-7Rα +, e il verde sono NKp46- IL-7Rα +. Ogni popolazione ha una firma gene specifico. All'interno del NKp46 + IL-7Rα - popolazione, due firme possono essere visti, che attesta l'eterogeneità della popolazione.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| primer | |
| ACTB | Il-23R |
| Aes | Il-2RA |
| Ahr | Il-2RB |
| Bcl2 | II-7RA |
| c-myc | Klr5 |
| CBFB | LEF1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| Cd49b | Notch1 |
| CXCR5 | NOTCH2 |
| Cxcr6 | Rora |
| Eomes | RORC |
| ETS1 | RUNX3 |
| FOXO1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| GATA3 | Tcf7 |
| GM-CSF | Tle1 |
| HES1 | Tle3 |
| HPRT | Tsc22d3 |
| ID2 | Tnfrsf11a |
| Il-12rb2 | Tox |
| Il-18r1 | Zbtb16 |
| Il-1rl1 | Zbtb7b |
| Il-22 | |
Tabella 1: Lista Primer.
Tabella 2: programma di pre-amplificazione. Ogni passo del programma pre-amplificazione è mostrato con le informazioni complete relativamente al tempo, temperatura, e il numero di cicli.
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Discussion
Questo protocollo descrive come ottenere informazioni esaustive espressione genica a livello clonale. Qui, abbiamo studiato il fegato ILC eterogeneità vano. Dopo l'ordinamento cella singola di diverse popolazioni ILC (sulla base di marcatori di superficie ILC ampiamente espresse), i campioni sono stati pre-amplificati per specifici geni pre-selezionati. Poi, il cDNA ottenuto e primer sono stati caricati su un multiplex RT-qPCR chip microfluidico. Infine, abbiamo ottenuto l'espressione di 48 geni diversi dal 48 singole cellule. i risultati di espressione genica sono stati analizzati tramite un software online per indagare firma genica e della popolazione delle cellule relazioni.
Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di valutare l'espressione genica multiple simultaneamente. Consente inoltre il lavoro a livello clonale e in rarissimi popolazioni. A differenza dei tradizionali metodi RT-qPCR, multiplex cella singola RT-qPCR ha alcun effetto di media, dal momento che l'espressione genica è valutata a livello clonale. così, Eterogeneità all'interno di una popolazione può essere rilevato e analizzato. Single-cell RT-qPCR espressione consente di lavorare in rarissimi popolazioni, dal momento che solo pochissime cellule sono necessari per ottenere un'ampia informazioni sull'espressione genica. Inoltre, diverse popolazioni di cellule possono essere testati sulla stessa piastra. Ciò consente la rilevazione delle differenze di firma genetica tra le popolazioni e, con strumenti di dati on-line, la valutazione dei rapporti di popolazione cellulare. Questa tecnica presenta anche altri vantaggi. multiplex cella singola RT-qPCR ha il vantaggio di recenti progressi microfluidica. I volumi necessari nelle camere di IFC non superano il livello nanolitro. Così, minori quantità di reagenti vengono utilizzati, riducendo il costo degli esperimenti. Infine, il numero complessivo di fasi di pipettamento è ridotta, limitando così la possibilità di errori di pipettamento. I passaggi sono simultaneo per tutte le cellule e può essere fatto con una pipetta multicanale, consentendo lavoro in maniera rapida e risparmio di tempo. risultati ottenuti ail livello clonale sono riproducibili, affidabile, e può essere utilizzato per eseguire robusta analizza i dati.
multiplex cella singola RT-qPCR, tuttavia, presenta alcune limitazioni. In primo luogo, questa tecnica richiede attrezzature costose e specifico, ad esempio un chip microfluidico, un controller chip microfluidico, e un termociclatore specifica. A differenza dei tradizionali metodi RT-qPCR, questa tecnica richiede tempo e reagente risparmio, poiché, con convenzionale RT-qPCR, sono necessari numerosi studi per ottenere comparazioni statisticamente significative. In questo protocollo, vi presentiamo una procedura per ottenere l'espressione genica per 48 geni. 96-96 multiplex RT-qPCR chip microfluidica sono disponibili. Questi chip possono valutare l'espressione genica per 96 geni da 96 celle contemporaneamente. Durante separazione delle cellule, sono necessari un numero minimo di cellule di partenza, poiché la precisione e purezza cellule deve essere massimale. Tuttavia, anche con un piccolo numero di cellule, è ancora possibile ordinare per multiplex singola cellula RT-qPCR gene expression (fase 3). Infine, multiplex cella singola RT-qPCR è un metodo sensibile. diversi test devono essere eseguiti prima di iniziare tali esperimenti. Ad esempio, per la specificità di destinazione primer primer devono essere testati per efficienza di amplificazione e per la relativa competizione per il bersaglio.
Diverse fasi del protocollo devono essere eseguite con cautela. Le manipolazioni di piccoli volumi combinati con un gran numero di campioni e saggi allo stesso tempo aumentare il rischio di errori di pipettamento (passi 1, 4, 5, 6 e 7). Tutti i reagenti e miscele dovrebbero essere posti in agitazione prima pipettamento per garantire una soluzione omogenea. Evaporazione durante la pre-amplificazione (fase 4) si può anche avere un impatto i risultati finali. Le piastre devono sempre essere adeguatamente sigillati con un adeguato film di copertura. Ordinando strategia deve essere molto precisa (passaggio 3) per evitare le cellule morte o cellule multiple in pozzetti all'interno delle piastre. FACS ordinamento macchine sono ora equipaggiate con ind ordinamento cella singolaex software in grado di registrare quale cella specifica è stata ordinata in ogni pozzetto. Questo nuovo strumento sarà di interesse per determinare se le firme genetiche sono correlati all'intensità marcatore superficie cellulare. posizioni del campione e test sui chip devono essere organizzati meticolosamente, in quanto questo è essenziale per l'esperimento (punti 1, 5 e 6). Infine, la scelta di primer (step 1 e 6) è un passaggio fondamentale. Ogni fondo deve essere selezionata sulla base dei risultati precedentemente descritti o risultati attesi. Una scelta casuale di primer nel set di geni valutati potrebbe compromettere la lettura finale dell'esperimento. Inoltre, primer che correlano con il marcatore superficie cellulare utilizzato per l'ordinamento delle cellule devono essere utilizzati come controlli con geni housekeeping.
Valutare espressione genica multiplex a livello clonale offre una migliore caratterizzazione del fegato vano eterogenea ILC che nella ricerca precedente. Questa tecnica, fornita da software online, descrive più precisamente la dsottoinsiemi ifferent di ILC nel fegato in omeostasi di studi che utilizzano solo i marcatori di superficie cellulare. Inoltre, è possibile prendere in considerazione i rapporti di popolazione delle cellule e per costruire reti di differenziazione. Le firme genetiche, sulla base di espressione genica di singola cellula, sono anche strumenti importanti per discernere le caratteristiche demografiche delle cellule e per esaminare i ruoli potenziali. multiplex cella singola RT-qPCR è una delle migliori tecniche per un test di espressione genica per ottenere dati affidabili. Questi dati sono facilmente gestibili con la bioinformatica software 15. Rispetto ad altre tecniche per studi di espressione genica, come microarrays o RNA sequencing, multiplex cella singola RT-qPCR offre alta sensibilità. Altri approcci all'analisi singola cella sono stati descritti e possono essere utilizzate tecniche complementari alla multisala cella singola RT-qPCR 15, 16. Inoltre, la tecnica può essere eseguita con qualsiasi combinazione di primer, allowingli utenti g di guardare le firme genetiche personalizzati. Molte altre applicazioni possono essere utilizzate con questa tecnica. Per esempio, il tempo portate gene espressione di cellule in tutto sviluppo può essere fatto per valutare la modifica del profilo molecolare durante lo sviluppo. effetti dei farmaci sulle cellule possono anche essere studiate con diluizione del farmaco di determinare la soglia di efficacia del farmaco sulla espressione genica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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