قمنا بتطوير منهجية ل3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM) من دماغي اميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في نماذج القوارض من مرض الزهايمر. ويمكن تعميم هذه الطريقة لتحديد الكميات من أي بلعمة تقريبا في الجسم الحي.
يتم الاعتراف Neuroinflammation الآن باعتباره عاملا مسببا رئيسيا في الأمراض العصبية التنكسية. البالعات وحيدات النوى هي الخلايا المناعية الفطرية المسؤولة عن البلعمة وإزالة الأنقاض والمخلفات. وتشمل هذه الخلايا الضامة الجهاز العصبي المركزي المقيمين المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة، والبالعات وحيدات النوى التسلل من المحيط. وعموما استخدمت المجهر الضوئي لتصور البلعمة في القوارض أو عينات الدماغ البشري. ومع ذلك، لم تقدم الطرق النوعية دليل قاطع في الجسم الحي البلعمة. هنا، نحن تصف 3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM)، وسيلة قوية تسمح الكميات 3D الحقيقية للاميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في القوارض مرض الزهايمر (AD) نماذج. الطريقة ينطوي على fluorescently تصور Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي في أقسام الدماغ القوارض. مجموعات البيانات مبائر كبيرة زي الأبعاد ثم يتم بناؤها 3D لتحديد الكميات من A &# 946؛ colocalized مكانيا داخل يحلول يبلوعي. ونحن لشرح التطبيق الناجح لq3DISM إلى الماوس والفئران العقول، ولكن يمكن تمديد هذه المنهجية إلى أي بلعمة تقريبا في أي نوع من الأنسجة.
مرض الزهايمر (AD)، والأكثر شيوعا المرتبطة بالعمر الخرف 1، يتميز تراكم الدماغية اميلويد β (Aβ) كما ويحات "خرف"، β اميلويد، المزمن neuroinflammation على مستوى منخفض، tauopathy، وفقدان الخلايا العصبية، واضطراب الإدراك 2 . في ميلادي أدمغة المرضى، وخصصت neuroinflammation بواسطة الخلايا النجمية والبالعات وحيدات النوى رد الفعل (ويشار إلى الخلايا الدبقية الصغيرة، على الرغم من المركزية مقابل الأصل المحيطي يزال غير واضح بهم) المحيطة الودائع Aβ 3. كما رقيب المناعة الفطرية للجهاز العصبي المركزي، يتم وضع الخلايا الدبقية الصغيرة مركزيا لمسح الدماغ Aβ. ومع ذلك، ويرافق التوظيف دبقية لويحات Aβ بواسطة القليل جدا، إن وجدت، Aβ البلعمة 4،5. فرضية واحدة هي أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي اعصاب في البداية من قبل phagocytozing التجمعات الصغيرة من Aβ. ومع ذلك، في نهاية المطاف هذه الخلايا تصبح السمية العصبية كما عبء Aβ ساحق و / أو د الوظيفي المرتبط بالعمرecline، يثير الخلايا الدبقية الصغيرة في النمط الظاهري proinflammatory مختلة وظيفيا، والمساهمة في العصبية والمعرفية تراجع 6.
وقد حددت الدراسات رابطة الجينوم على نطاق الأخيرة (GWAS) مجموعة من الأليلات خطر م ينتمون إلى جوهر مسارات المناعية الفطرية 7 التي تعدل البلعمة 8-11. ونتيجة لذلك، أصبحت الاستجابة المناعية لترسب الأميلويد في الدماغ وهي منطقة رئيسية من الاهتمام، سواء من حيث فهم المسببات م ولتطوير أساليب علاجية جديدة 12-14. ومع ذلك، وهناك حاجة ماسة إلى منهجية لتقييم البلعمة Aβ في الجسم الحي. لتلبية هذه الحاجة غير الملباة، وقد وضعنا 3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM) لتمكين الحقيقية الكميات 3D من الدماغ البلعمة Aβ بواسطة البالعات وحيدات النوى في نماذج القوارض من مرض الزهايمر تشبه.
قلة فقط من المدى الذي ألخص المرض، والنماذج الحيوانية لهاثبت لا تقدر بثمن لفهم م pathoetiology ولتقييم العلاجات التجريبية. ونظرا لحقيقة أن الطفرات في الجينات Presenilin (PS) واميلويد السلائف البروتين (APP) يسبب بشكل مستقل وراثي جسمي م، وقد استخدمت هذه الجينات المحورة متحولة على نطاق واسع لتوليد نماذج القوارض المعدلة وراثيا. الفئران المعدلة وراثيا APP / PS1 coexpressing في وقت واحد "السويدي" متحولة APP البشري (سوي APP) وΔ اكسون 9 متحولة presenilin البشري 1 (PS1ΔE9) الحالي مع الداء النشواني الدماغي المتسارع وneuroinflammation 15،16. وعلاوة على ذلك، ونحن قد ولدت الفئران المعدلة وراثيا ثنائية coinjected مع APP سوي ويبني PS1ΔE9 (خط TgF344-AD، على خلفية فيشر 344). وخلافا للنماذج الماوس المعدلة وراثيا من الداء النشواني الدماغي والجرذان TgF344-AD تطوير اميلويد في الدماغ التي تسبق tauopathy، وفقدان أفكارك من الخلايا العصبية، وضعف السلوكي 17.
في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول للIMMunostaining الخلايا الدبقية الصغيرة، جسيم حال بلعمي ودائع Aβ في أقسام الدماغ من الفئران APP / PS1 والجرذان TgF344-AD، والحصول على الصور مبائر كبيرة زي الأبعاد. نحن من التفصيل في توليد وتحليل عمليات إعادة البناء 3D الحقيقية من مجموعات البيانات مبائر يسمح الكميات من Aβ امتصاص إلى جسيم حال بلعمي دبقية SILICO. وعلى نطاق أوسع، ومنهجية أننا التفاصيل هنا يمكن أن تستخدم لقياس تقريبا أي شكل من أشكال البلعمة في الجسم الحي.
البروتوكول الذي وصفنا في هذا التقرير لتحديد الكميات 3D الحقيقية للAβ البلعمة في الحي بواسطة البالعات وحيدات النوى يعتمد على وضع العلامات المحددة من المقصورات الخلوية والتحت خلوية وكذلك الودائع Aβ. على وجه التحديد، ونحن نستخدم Iba1 (مؤين الكالسيوم ملزم محول جزيء 1)،…
The authors have nothing to disclose.
M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer’s Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer’s Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer’s Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.
Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
Tweezers | VWR | 94024-408 | |
23G needle | VWR | BD305145 | |
peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
PBS 10X | Bioland Scientific | PBS01-02 | Working concentration 1X |
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
32% Paraformaldehyde aqueous solution | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration 4% in PBS |
Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
Target Retrieval Solution 10X | DAKO | S1699 | Working concentration 1X |
KimWipes | VWR | 21905-026 | |
Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Coverslips | VWR | 48393081 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
Beta-Amyloid, 17-24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
Beta-Amyloid, 1-16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1000 |
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1000 |
Immersion oil | Nikon | ||
A1 Confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. | |