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Biology

Analisi cinematica di divisione cellulare e di espansione: Quantificare la base cellulare della crescita e dello sviluppo di campionamento zone in Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

analisi della crescita dipende da una serie di strumenti che vengono comunemente utilizzati dagli scienziati vegetali per descrivere genotipo determinato differenze di crescita e / o risposte fenotipiche a fattori ambientali. Essi comprendono dimensione e peso misurazioni di tutta la pianta o di un organo e calcoli dei tassi di crescita per esplorare i meccanismi alla base della crescita. Crescita degli organi è determinata dalla divisione cellulare e l'espansione a livello cellulare. Pertanto, compresa la quantificazione di questi due processi in crescita analizza è la chiave per comprendere le differenze nella crescita dell'intero organo-1. Pertanto, è fondamentale disporre di un metodo adeguato per determinare i parametri di crescita cellulare che è relativamente facile da usare da laboratori non specializzati.

Analisi cinematica è già stato stabilito come un approccio che fornisce un quadro potente per lo sviluppo di modelli di crescita di organi 2. La tecnica è stata ottimizzata per sistemi lineari,come radici Arabidopsis thaliana e foglie monocotiledoni, ma anche per i sistemi non lineari, come foglie dicotiledoni 3. Al giorno d'oggi, questa metodologia è sempre più utilizzato per studiare come genetici, ormonali, dello sviluppo e fattori ambientali influenzano la divisione cellulare e di espansione in vari organi (Tabella 1). Inoltre, fornisce anche un quadro di collegare processi cellulari ai loro regolamenti biochimici, molecolari e fisiologici sottostanti (Tabella 2), anche se le limitazioni possono essere imposte in base alle dimensioni degli organi e l'organizzazione spaziale per tecniche che richiedono una maggiore quantità di materiale vegetale (ad esempio, di metaboliti misurazioni, proteomica, etc.).

Foglie monocotyledonous, come il mais (Zea mays) foglie, rappresentano sistemi lineari in cui le cellule si spostano dalla base della foglia verso la punta, sequenzialmente passando attraverso il meristema e l'allungamento zona per raggiungere la maturitàzona. Questo lo rende un sistema modello ideale per studi quantitativi dei modelli spaziali di crescita del 4. Inoltre, foglie di mais hanno zone di forte crescita (meristema e zona di allungamento che abbracciano diversi centimetri 5) e forniscono possibilità per gli studi ad altri livelli organizzativi. Questo permette la ricerca dei (presunti) meccanismi regolatori che controllano la divisione cellulare e di espansione, quantificato da analisi cinematica attraverso una serie di tecniche molecolari, misurazioni fisiologiche, e approcci di biologia cellulare (Tabella 2).

Qui, forniamo un protocollo per l'esecuzione di una analisi cinematica in foglie monocot. In primo luogo, spieghiamo come condurre una corretta analisi sia di divisione cellulare e l'allungamento delle cellule in funzione della posizione lungo l'asse foglia e come calcolare i parametri cinematici. In secondo luogo, mostriamo anche come questo può essere utilizzato come base per il disegno di campionamento. Qui, discutiamo due casi: ad alta risoluzione di campionamento di und focalizzata campionamento, consentendo una migliore interpretazione dei dati e il risparmio di tempo / denaro, rispettivamente.

Tabella 1. Panoramica di cinematica analizza i metodi per la quantificazione della divisione cellulare e di espansione in vari organi.

organo riferimento
foglie monocotiledoni 16, 20, 21, 22
apici radicali 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
foglie dicotiledoni 21, 30, 31
sparare meristema apicale 32

Tabella 1. Panoramica di cinematica analizza i metodi per la quantificazione della divisione cellulare e di espansione in vari organi.

Tabella 2. Collegamento tra processi cellulari quantificati dall'analisi cinematica per la loro regolamentazione a livello molecolare. I riferimenti ai vari studi che collegano la quantificazione dei processi cellulari ai risultati di saggi biochimici e molecolari di varie specie e organi. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdeide (MDA), chinasi ciclina-dipendenti (CDK). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

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Protocol

NOTA: il seguente protocollo per l'analisi cinematica è valida solo per le foglie durante la crescita di stato stazionario. Questo implica un tasso foglio di allungamento stabile e modelli spaziali di largo cellulare e l'espansione in una foglia durante un periodo di diversi giorni 6.

1. crescita delle piante e misure di Leaf Allungamento Rate (LER)

  1. Scegli una foglia nella crescita di stato stazionario e uno stadio di sviluppo di interesse.
    NOTA: C'è una differenza tra la crescita di stato stazionario e la crescita ripetitivo, il che implica modelli spaziali simili sulle foglie successive sullo stesso asse. Durante le prime fasi di crescita delle piantine, foglie successive tipicamente crescono sempre più velocemente a causa della crescente dimensione della zona di crescita 7. Anche se un paio di posizioni più elevate foglia possono avere un modello di crescita simile 8, questa è una fase transitoria che possono essere interessati da trattamenti sotto inchiesta. È quindi importante confrontare linee e tr eatments strettamente dalla stessa posizione del foglio, anche se può essere lo sviluppo in un momento diverso. Anche ad una velocità di allungamento costante, il profilo tasso di crescita non è necessariamente la stessa a differenti stadi di sviluppo. Pertanto, è importante analizzare foglie allo stesso stadio di sviluppo 8, tipicamente definito dal numero di giorni dopo la nascita.
  2. Per eseguire una completa analisi cinematica di crescita delle foglie in monocotiledoni, crescerà almeno 15 piante per ogni trattamento e il genotipo in condizioni controllate in una stanza di crescita.
  3. Al momento in cui il foglio di interesse appare (uscita dalla spirale di foglie circostanti), avviare la misurazione della lunghezza del foglio giorno con un righello finché la foglia è completamente espansa (Figura 1i). lunghezza Leaf implica la lunghezza dalla livello del terreno alla punta della foglia. Fare attenzione a non rompere o danneggiare la foglia, dal momento che questo potrebbe alterare la sua crescita.

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Figura 1:. Schema di una analisi cinematica di foglie di mais La foglia di interesse è misurata con un righello per tre giorni consecutivi per calcolare la foglia di allungamento Rate (LER). Successivamente, il foglio viene raccolto e un segmento di tre centimetri è utilizzato per la determinazione delle dimensioni meristema. Questo viene fatto misurando la lunghezza dalla base fino alla figura mitotica più distale dopo colorazione DAPI. (A) Esempi di figure mitotiche proliferative e (b) figure mitotiche formativi. I primi undici centimetri dalla base foglio sull'altro lato della metà venosa sono usati per tagliare dieci segmenti di un centimetro per misure di lunghezza cellule. Queste misurazioni forniscono la base per creare il profilo lunghezza cellule, che serve a determinare la lunghezza maturo cella (l mat) e la lunghezza delle cellule lasciando il meristema (l div). Il el stuoia sono utilizzati per calcolare il tasso di produzione di cellule (P), mentre l div e L mer vengono utilizzati per calcolare il numero di cellule nel meristema (mer N). A sua volta, P e N mer sono utilizzati per calcolare il tasso medio di divisione cellulare (D), che è l'inverso della durata del ciclo cellulare (T c). Frecce dello stesso colore indicano parametri utilizzati per calcolare il parametro seguente su queste frecce. Barre di scala = 40 micron. Numeri romani sono utilizzati per riferirsi a procedure sperimentali specifici descritti nel protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Fare la raccolta

  1. Nella fase di sviluppo di interesse (ad esempio, il terzo giorno dopo la nascita), scegliere almeno cinque rappresentante plants del lotto su cui condurre l'analisi cinematica. Continua a misurare il resto delle piante come spiegato al punto 1.3 per determinare la lunghezza del foglio finale.
  2. Tagliare la parte fuori terra della pianta. Per mantenere la parte meristematica intatto, tagliare il più vicino possibile alle radici (Figura 1ii).
  3. Partendo dalle foglie esterne, rimuovere tutte le foglie fino alla foglia di interesse srotolando delicatamente uno per uno. Se necessario, rimuovere alcuni millimetri supplementari dalla base staccare le foglie. Rimuovere anche le foglie apicali e piccoli racchiusi dalla foglia di interesse (Figura 1iii).
  4. Tagliare un segmento 3 cm partendo dalla base su un lato della metà della vena, e memorizzarlo in una provetta da 1,5 ml di prova riempito con 3: 1 (v: v) etanolo assoluto: soluzione di acido acetico (ATTENZIONE: indossare guanti) a 4 ° C per 24 ore fino a diversi mesi (Figura 1iv). Questo segmento verrà successivamente utilizzato per determinare la lunghezza del meristema.
  5. DalDall'altra parte della vena, tagliare un segmento 11 centimetri dalla base (Figura 1 v) e collocarlo in una provetta da 15 ml riempito con etanolo assoluto a 4 ° C per almeno 6 ore per rimuovere i pigmenti (Figura 1 vi).
    NOTA: In seguito, utilizzare solo i primi 10 cm per determinare il profilo di lunghezza cella (vedi la discussione).
  6. Rinnova l'etanolo assoluto per un altro giro di pulizia a 4 ° C per almeno 24 ore (Figura 1vi).
  7. Infine, sostituire il etanolo assoluto con acido lattico puro (ATTENZIONE: indossare guanti) per la pulizia e la conservazione a 4 ° C per 24 ore o fino a quando un ulteriore uso (Figura 1vi).

3. meristem delle misure di lunghezza

  1. Preparare un tampone di risciacquo contenente 50 mM di cloruro di sodio (NaCl), 5 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; ATTENZIONE: indossare guanti) e 10 mM Tris (idrossimetil) Acido aminomethane-cloridrico (Tris-HCl, pH 7).
  2. Prendere il segmento 3 centimetri dalla sezione 2.4 e cosìak nel buffer per 20 min (Figura 1vii).
  3. Durante l'attesa, utilizzare il buffer di risciacquo per preparare una soluzione colorante 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) di 1 ug / ml, mantenendolo su ghiaccio e al buio.
  4. Colorare i nuclei ponendo il segmento meristema per 2-5 minuti nella soluzione di colorazione DAPI. Lavorare su ghiaccio e al buio (Figura 1vii).
  5. Controllare segnale di fluorescenza montando rapidamente il segmento su un vetro microscopia e coprendolo con un vetro di copertura. Le cellule epidermiche dovrebbero mostrare fluorescenza, mentre gli strati cellulari sottostanti non dovrebbe.
  6. Se la colorazione non è sufficiente, mettere il segmento posteriore nella soluzione colorante DAPI per alcuni minuti supplementari.
  7. Per interrompere la colorazione, montare i segmenti in una goccia di risciacquo tampone su un vetrino al microscopio e coprire con un vetro di copertura.
  8. Utilizzare un microscopio dotato di UV-fluorescenza a un ingrandimento 20X, permettendo la visualizzazione di circa 1.000 epidermcellule di Al in una volta. Scorrere in tutto il segmento e cercare per le figure mitotiche proliferative (metafase, anafase, telofase e citocinesi), ma evitare formativo divisione cellulare della sviluppare stomi (Figura 1viii) 9. Definire in cui si trova la figura mitotico più distale.
  9. Determinare la lunghezza del meristema misurando la distanza tra la base della foglia e la più distale epidermica mitotico figura. Utilizzare un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) per misurare la lunghezza del frame dell'immagine.
    1. Contare il numero di fotogrammi che coprono la lunghezza meristema completo (dalla base del foglio alla figura mitotica più distale) e moltiplicare questo numero per la lunghezza di un frame per ottenere la lunghezza meristema completo (Figura 1ix).

4. cella intera Profilo

  1. Prendere il segmento che viene memorizzato in acido lattico (passo 2.5) e posizionarla con cautela in panchina. Tagliare la segmenti ingegnoha bisturi in 10 segmenti da 1 cm ciascuno (Figura 1x).
  2. Montare i segmenti successivi foglia su una diapositiva microscopio in una piccola goccia di acido lattico. Assicurati di affrontare in modo coerente sia la adaxial o abaxial verso l'alto. In linea di principio, non vi è alcuna preferenza per un particolare lato.
  3. Utilizzare un microscopio dotato di contrasto interferenziale differenziale (DIC) ottiche per analizzare i segmenti, partendo dalla base foglia. Misurate con un software di analisi di immagine della lunghezza di almeno 20 cellule epidermiche replica nel file direttamente adiacenti ai file stomatiche al fine di selezionare sempre lo stesso tipo di cellula.
    1. Fate questo in posizioni equidistanti lungo ciascuno dei segmenti (4 posizioni per segmento sufficiente), e assicurarsi di annotare la posizione corrispondente per ogni misura per tutta la foglia (Figura 1xi).
  4. Determinare la lunghezza media delle cellule in ogni mm lungo l'asse del foglio utilizzando un locale polinomiale levigante pROCEDURA, implementato in un R-script (Figura 1xii; file supplementare 1).
    NOTA: L'R-script fornisce una serie di dati con l'aumentare lisciatura. La quantità di smoothing richiesto è un po 'arbitraria e idealmente dovrebbe solo togliere il disturbo locale, ma non influenzerà la curva complessiva. Assicurarsi di utilizzare la stessa quantità di smoothing per tutti i campioni all'interno di un esperimento.
  5. Media lunghezza cellule in ciascuna posizione tra piante e calcolare l'errore standard per creare un profilo lunghezza cella lungo l'asse del foglio.

5. I calcoli di cinematica parametri (Vedi file supplementare 2)

  1. Calcolare il LER prendendo la variazione di lunghezza del foglio tra due punti temporali successive (ad esempio, 24 h, come al punto 1.3) e dividendolo per l'intervallo di tempo.
  2. Calcolare la lunghezza della zona di crescita (L gz) corrispondente alla posizione distale dalla base dove cellule raggiungono il 95% del loro ce maturalunghezza ll sul profilo lunghezza delle cellule lisciato.
    1. Prendiamo ad ogni posizione sulla lisciato profilo lunghezza cella 95% della media di tutte le lunghezze cellulari seguenti tale posizione (figura 2).
    2. Confrontare le lunghezze delle cellule levigati (passo 4,4) con la calcolata lunghezza delle cellule del 95% per ogni posizione. Partendo dalla base della foglia, la zona di crescita termina nella posizione in cui la lunghezza cella effettiva è pari al 95% delle seguenti lunghezze cellulari (Figura 2; vedere integrativa dati 2).

figura 2
Figura 2:. Determinazione della fine della zona di crescita Meristem: Nella posizione indicata con una stella rossa, la dimensione cella effettiva è inferiore al 95% (linea rossa tratteggiata) della dimensione media delle cellule di tutte le cellule che seguono questa posizione (rosso fisso linea). La fine della zona di crescita (L gz, indicata con ablue stella) si trova in cui il 95% (linea blu tratteggiata) della dimensione media delle cellule di tutte le cellule che seguono questa posizione (solido linea blu) pari alla dimensione cella effettiva. zona Division (D), zona di allungamento (E), e la zona matura (M). Frecce tratteggiate indicano la convergenza tra la dimensione locale e il 95% della dimensione media sopra la porzione distale della foglia quando si spostano dalle posizioni basali alla punta della foglia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Calcolare la lunghezza della zona di allungamento (L el) come differenza tra la lunghezza della zona di crescita (L gz) e la dimensione meristema (L mer, determinato nel passaggio 3).
  2. Calcolare la lunghezza cellula matura (l mat) come lunghezza media delle cellule nella zona maturo.
  3. Dividere il LER per l tappetino per ottenere latasso di produzione di cellule (P).
  4. Calcolare il numero di cellule nella zona di allungamento (N el) come differenza tra N e N gz mer. Il numero di cellule nel meristema (mer N) è uguale al numero cumulativo di cellule situate negli intervalli corrispondenti al meristema. Il numero di cellule nella zona di crescita (N gz) è uguale al numero cumulativo di cellule situate negli intervalli corrispondenti alla zona di crescita.
  5. Calcolare il tasso di divisione cellulare medio (D) come P / N mer. La durata del ciclo cellulare (T c) uguale ln (2) / D.
  6. Calcolare il tempo nella zona di allungamento (T el) dividendo N el da P. Il tempo nella zona di divisione è pari a log 2 (N mer) * T c. La lunghezza delle cellule lasciando il meristema (l div)uguale alla lunghezza cella dal profilo lunghezza cellule lisciato alla fine del meristema.
  7. Calcolare il tasso medio di espansione delle cellule (R el) utilizzando la formula seguente: ln (l mat) -ln (l div)] / T el.

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Representative Results

Qui, si mostra un confronto tra le piante ben irrigate (controllo, contenuto idrico del suolo 54%, (SWC)) e le piante sottoposte a condizioni di stress siccità (siccità, 34% SWC) in termini di crescita delle foglie. Tutte le piante sono state coltivate in una camera di crescita in condizioni controllate (16 ore al giorno / notte 8 ore, 25 ° C / 18 ° C giorno / notte, 300-400 μEm -2 sec -1 fotosinteticamente radiazione attiva (PAR). Le condizioni di siccità sono stati stabiliti trattenendo acqua fino alla corretta SWC è stato raggiunto e poi ulteriormente mantenuta. In uno studio preliminare, è stato stabilito che la quinta foglia è il primo ad emergere e sviluppare in questa condizione di stress. Pertanto, è stato scelto come il foglio di interessi. la lunghezza Leaf finale (LL) delle piante alla siccità sottolineato è stato inferiore del 40% rispetto a quello delle piante ben irrigati, che era a causa di un LER inferiore (Tabella 3). per capire la base cellulare della learisposta di crescita f, abbiamo effettuato una analisi cinematica. Nel complesso, il tasso di allungamento del foglio è funzione della produzione cellulare nel meristema e dimensioni cellula matura determinata zona allungamento (Figura 3). Pertanto, l'accorciamento della foglia deve essere dovuta agli effetti di uno o entrambi questi parametri. I nostri risultati mostrano che mentre la lunghezza cellula matura (l mat) non è stata influenzata, il tasso di produzione di cellule (P) è stato ridotto del 71% (Tabella 3). L mat dipende dalla lunghezza delle cellule lasciando il meristema (l div) , il tempo di queste cellule passano nella zona di allungamento (T el), e il tasso di espansione cella relativa (R el). Nessun effetto è stato osservato per l div, mentre R EL è stato ridotto del 67% in condizioni di siccità. Questo effetto è stato compensato dalla quasi triplicazione delle T el, che ha provocato la stessa l tappetino </ Sub> come nelle condizioni di controllo. La diminuzione del tasso di produzione di celle è stato, a sua volta, causato sia da un tasso più basso di cellule media divisione (D) e un minor numero di cellule nel meristema (mer N). La durata del meristema (L mer) è stato ridotto in contrasto con la lunghezza della zona di crescita (L gz), che non è stata significativamente influenzata. In conclusione, questi risultati mostrano che in questo caso, il numero di cellule, a differenza di dimensione delle celle, ha avuto un ruolo importante nel determinare le dimensioni del foglio.

parametri cinematici C D % CD cambiamento p-value
LL 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (mm / h) 2.8 ± 0.1 0.8 ± 0.0 -73 0.000
l mat (micron) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
P (cellule / h) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (cellule · cella -1 · h -1) 0,028 ± 0,003 0,010 ± 0,001 -63 0.000
T c (HR) 26 ± 3 71 ± 7 173 0.000
T div (HR) 249 ± 27 656 ± 71 164 0.000
L mer (mm) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0,010
N mer 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R EL (micron · micron -1) 0,043 ± 0,002 0,014 ± 0,001 -67 0.000
l div (micron) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
T EL (HR) 42 ± 2 125 ± 11 +199 0.000
N el 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L g z (mm) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N g z 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0,010

Tabella 3. Analisi cinematica sulla divisione cellulare ed espansione cellulare durante la crescita di stato della quinta foglia. impianti irrigui e le piante sottoposte a stress dovuto a siccità dati sono medie ± SE (n = 5, per LL: n = 10). test t è stato utilizzato come analisi statistica. Parametri: lunghezza del foglio (LL), foglia di tasso di allungamento (LER), di lunghezza cellula matura (l mat), tasso di produzione di cellule (P), tasso di divisione cellulare (D), la durata del ciclo cellulare (T c), del tempo nella zona di divisione ( T div), lunghezza del meristema (L mer), il numero di cellule nel meristema (mer N), il tasso di allungamento di cella relativa (R el), la lunghezza delle cellule lasciando il meristema (l div), il tempo nella zona di allungamento (T el), il numero di celle nella zona di allungamento (N el), la lunghezza della zona di crescita (L gz), il numero di celle nella zona di crescita (N gz), condizioni irrigui (C), stress idrico ( D), un D non significativa (NS).

Figura 3
Figura 3:. Relazione tra i parametri cinematici La lunghezza finale del foglio (LL) dipende dalla foglia Allungamento Rate (LER), che a sua volta dipende dalla produzione di cellule (P) e la lunghezza cellula matura (l mat). Il numero di cellule nel meristema (mer N) e il tasso di divisione cellulare (D) determinano insieme P, con una durata del ciclo cellulare (T c) come l'inverso D. Tempo nella zona allungamento (T el), lunghezza cellule lasciando il meristema (l div), e il tasso di espansione cella relativa (R el) determinare la lunghezza cellula matura (l mat). Il numero di cellule nella zona di allungamento (N el)..jove.com / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Oltre alla sua applicazione come un'analisi dettagliata della crescita organo, analisi cinematica fornisce una mappa di localizzazione zona di crescita delle foglie e permette campionamento con risoluzione subzonal per molecolare e analisi biochimiche 4,10,11. Come esempio, la Figura 4A mostra malondialdeide (MDA) quantificazione lungo la zona di crescita della foglia di mais in piante sottoposte alle stesse condizioni di cui sopra. MDA è un metabolita secondario formatosi durante perossidazione lipidica da ROS e riflette i livelli di danno ossidativo 12. MDA è stato misurato in ogni centimetro della foglia, partendo dalla sua base, che permetteva analisi delle variazioni di concentrazione lungo il gradiente di crescita 11. Poiché il trattamento siccità causato 40% leaf accorciamento, la lunghezza delle zone di sviluppo (merigambo, zone allungamento e zona mature) nelle piante di controllo non corrisponde alla lunghezza delle stesse zone nella siccità piante sottolineato (Figura 4B). Come visto in Figura 4B, il meristema nelle piante di controllo era lunga circa 1,5 cm e la zona di allungamento attraversato da 1,5 e 6,8 cm dalla base della foglia. Nelle piante stressate, il meristema è stato localizzato da 0 a 1,1 cm e la zona di allungamento da 1,1 a 6,1 centimetri. livelli di MDA e tutta la zona di crescita sono state aumentate negli impianti di siccità ha sottolineato rispetto al trattamento di controllo. Con l'aiuto dell'analisi cinematica, potremmo concludere che il contenuto MDA è stato particolarmente aumentata nella zona mature sia per trattamenti di controllo e siccità. Senza conoscere le dimensioni delle zone di sviluppo, vorremmo concludere che, sotto stress da siccità, i contenuti aumenti MDA in uno stadio di sviluppo prima che in piante di controllo, che sarebbe sbagliato in quanto non tiene conto lo spostamento delle zone dovuti a tegli foglia accorciamento. Pertanto, l'esecuzione di analisi cinematica prima delle misurazioni biochimiche era di cruciale importanza al fine di interpretare correttamente i dati.

Figura 4
Figura 4: Esempio di alta risoluzione misurazioni biochimiche e di campionamento per l'analisi mirata malonaldeide (MDA) concentrazioni (A) misurati lungo la zona di crescita foglia di mais (suddiviso in dieci segmenti) delle piante coltivate condizione in ben irrigato e le piante sottoposte a siccità. trattamento 10. I dati sono medie ± SE (n = 5). ANOVA a due vie è stato utilizzato come analisi statistica, e valori di p sono rappresentati accanto al pannello del grafico (fattori: siccità (d) ed il segmento (s)); FW: peso fresco. (B) Visualizzazione delle diverse zone di crescita nel controllo e le piante siccità-ha sottolineato. zona Division (D), zona di allungamento (E), ezona matura (M). Le cellule sono ingrandite 125 volte. (C) il profilo delle cellule lunghezza di controllo e di piante siccità-trattata. I dati sono medie ± SE (n = 5). (D) Le differenze di campionamento mirato sia il controllo e le piante siccità-trattati. Le caselle blu indicano la posizione di campionamento per confrontare lo stesso stadio di sviluppo in entrambi i trattamenti. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Oltre a fornire la possibilità di confrontare le stesse zone di sviluppo in studi ad alta risoluzione, l'analisi cinematica potrebbe anche essere usato come base per analisi più mirati, in cui sono prese soltanto campioni di specifiche zone contenenti cellule allo stesso stadio di sviluppo. Abbiamo confrontato i profili lunghezza cella forniti dalla livellamento delle misure di lunghezza cellule microscopiche, nei primi dieci centimeters dalla base foglia di controllo e di piante siccità-ha sottolineato. La figura 4C mostra che, utilizzando il profilo lunghezza delle cellule, si potrebbe determinare la lunghezza delle zone di sviluppo e potrebbe anche seguire la dinamica dei tassi di crescita sia di controllo e le piante siccità-ha sottolineato. Questo ha permesso di campionamento specifico di cellule proliferanti nel meristema (prima del forte aumento), espandendo le cellule nella zona di allungamento (nel mezzo del forte incremento) e giovani cellule mature nella zona matura (inizio del plateau). I nostri risultati mostrano che, a causa della riduzione foglia in risposta alla siccità, queste zone non corrispondevano nel controllo e nelle piante stressate. Al fine di campionare proliferanti, in espansione, e giovani cellule mature in piante di controllo, che ci serviva il primo, quinto, nono e centimetri dalla base foglia, rispettivamente. Tuttavia, nelle piante stressate, questi segmenti corrispondono alla prima, la quarta e ottava centimetri rispettivamente. Questo tipo di più miratacampionamento ha dimostrato di essere utile nel caso di più laboriose, costose, o dispendioso studi, come RNA-sequenziamento, proteomica, metabolomica, etc.

File supplementare. 1: R-script per la procedura di smoothing polinomiale Si prega di fare clic destro per scaricare il file.

File integrativa 2:. I calcoli dei parametri cinematici Si prega di fare clic destro per scaricare il file.

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Discussion

Una completa analisi cinematica sulle foglie di mais consente la determinazione della base cellulare della crescita delle foglie e consente la progettazione di strategie di campionamento efficienti. Anche se il protocollo è relativamente semplice, una certa cautela è raccomandata nei seguenti passaggi critici: (1) E 'importante staccare le foglie più giovani chiusi (punto 2.3) senza danneggiare il meristema, dal momento che la determinazione lunghezza meristema (fase 3) richiede la completa meristem di essere presenti. Alcuni pratica in anticipo potrebbe essere necessario. (2) la determinazione di lunghezza meristematici si basa sull'interpretazione di figure mitotiche. Pertanto, si informa che, nel termine di un esperimento, la stessa persona conduce queste misure per ridurre la varianza causa l'esecutore. (3) Anche se solo dieci centimetri è utilizzato per le misure reali lunghezza cellule, è importante includere undici centimetri durante la raccolta del segmento di misura della lunghezza di cella (passo 2.5), perché il bordo del segmento non fat sempre pienamente immergere in etanolo e / o acido lattico. Pertanto, questa centimetro supplementare assicura compensazione delle prime dieci centimetri della zona di crescita. (4) Alla fine, è utile esaminare l'esito di tutti i parametri cinematici per confermare che siano corrette. In Tabella 3, per esempio, il tasso di produzione di cellule (P) delle piante siccità sottolineato è diminuita del 71%, o, in altre parole, P siccità è 0,29 controllo P. Dal momento che la produzione delle cellule dipende dalla media dei tassi divisione cellulare (D; -63%) e il numero di cellule nel meristema (N mer; -20%; Figura 3), il seguente può essere utilizzato per convalidare l'output: P (0.29) ≈ N mer (0,8) x D (0.37). Lo stesso può essere applicato per LER = P x I mat.

A seconda delle possibilità, il protocollo può essere modificato in alcuni passaggi. (1) A più di undvanced alternativa per le misure di lunghezza foglia manuali quotidiane (punto 1.3) si basa sulla velocità di spostamento lineare trasduttori (LVDT) 13. Il suo vantaggio è che permette misure alla risoluzione temporale molto più alta, che vanno da minuti a secondi. (2) E 'fondamentale per includere la zona di crescita completa durante il campionamento. Tuttavia, le condizioni ambientali, genotipo, specie e lo stadio di sviluppo esaminato potrebbero alterare la lunghezza della zona di crescita. Pertanto, è utile fare una prima stima della lunghezza della zona di crescita in risposta al trattamento esperimento. Questo protocollo si basa sulla linea consanguinea B73 coltivate a 25 ° C / 18 ° C (giorno / notte) a 300-400 μEm -2 s -1 (fotosintetica Radiation attivo - PAR). (3) Per visualizzare le figure mitotiche (passo 3,8) senza l'utilizzo di fluorescenza, una macchia Fuelgen può essere applicata 14. (4) Il livellamento dei dati può essere effettuata anche in MS Excel, invece di R utilizzando un qua cinque puntidratic raccordo con la funzione "REGR.LIN" 15.

Un importante limite di questa tecnica è che l'intera zona di crescita deve essere raccolto durante la crescita di stato stazionario. Al fine di garantire una crescita di stato stazionario, le piante devono idealmente essere coltivate in condizioni di crescita controllate, perché le fluttuazioni di intensità della luce, la temperatura, l'umidità o influenzano il tasso di allungamento foglia 16. Per questo motivo, l'analisi cinematica è meno adatto per le piante coltivate in condizioni di campo. Un altro inconveniente è che le foglie devono essere emerso, che rende impossibile esaminare foglie che sono ancora racchiusi dalle foglie più vecchie. Infine, il protocollo è adatto per le specie monocotiledoni con ampie zone di crescita che comprende almeno alcuni centimetri. Una analisi cinematica su monocotiledoni piccoli (ad esempio, Poa, riso), tuttavia, è possibile, ma richiede alcune modifiche nella preparazione del campione 17,18.

Un altro uso frequented approccio per analizzare fenotipi crescita differenziali è l'analisi di crescita classica. Questa analisi quantifica pianta intera tassi di crescita relativi e determina l'assegnazione sottostante fotosintetico carbonica proveniente in una nuova area fotosintetica e in altre parti della pianta 19. L'analisi cinematica, tuttavia, consente una comprensione più dettagliata dei processi cellulari sottostanti che sono accoppiati a fenotipi crescita basate sulla quantificazione divisione cellulare ed espansione. Inoltre, la possibilità di determinare la lunghezza di ogni zona di crescita consente la correlazione delle misurazioni molecolari lungo l'asse del foglio allo specifico stadio di sviluppo che è influenzato dal trattamento in esame. Questo è fondamentale per l'interpretazione dei dati. Quando limitata nel tempo o budget o quando interessati a specifici stadi di sviluppo, il risultato di questa analisi permette di campionamento mirato, riducendo il numero di campioni necessari per l'analisi. In conclusione, l'analisi cinematica abilitaziones la determinazione dei parametri cellulari alla base risposte allo stress e la variazione genetica in crescita delle foglie e in grado di collegarli a monte processi di regolamentazione (Tabella 2).

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di dottorato di ricerca presso l'Università di Anversa a VA; una borsa di dottorato di ricerca dal fiammingo Science Foundation (FWO, 11ZI916N) di KS; sovvenzioni per progetti dal FWO (G0D0514N); una borsa di attività di ricerca concertata (GOA) la ricerca, "Un Systems Biology Approach di Leaf morfogenesi" dal Consiglio di ricerca dell'Università di Anversa; e il Interuniversitario di attrazione Poli (IUAP VII / 29, MARS), "mais e Arabidopsis radice e sparare crescita" dal Science Policy Ufficio federale belga (BELSPO) per GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani e Hamada AbdElgawad tutti hanno contribuito al video .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

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Analisi cinematica di divisione cellulare e di espansione: Quantificare la base cellulare della crescita e dello sviluppo di campionamento zone in<em&gt; Zea mays</em&gt; Foglie
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