Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الحركية من انقسام الخلايا والتوسع: تحديد مقدار الأساس الخلوي للمناطق التنموية النمو وأخذ العينات في Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

يعتمد تحليل النمو على مجموعة من الأدوات التي تستخدم عادة من قبل علماء النبات لوصف النمط الجيني تحديد الاختلافات النمو و / أو ردود المظهري للعوامل البيئية. وتشمل الحجم والوزن قياسات للنبات كامل أو جهازا وحسابات معدلات النمو إلى استكشاف الآليات الكامنة وراء النمو. يتم تحديد نمو الجهاز عن طريق انقسام الخلايا والتوسع على المستوى الخلوي. لذلك، بما في ذلك تقدير حجم هاتين العمليتين في النمو يحلل هو المفتاح لفهم الاختلافات في نمو كامل الجهاز 1. ونتيجة لذلك، من الأهمية بمكان أن يكون هناك منهجية ملائمة لتحديد معايير النمو الخلوية التي هي سهلة نسبيا للاستخدام من قبل مختبرات غير المتخصصة.

وقد تم بالفعل إنشاء تحليل الحركية كنهج توفير إطار قوي لتطوير نماذج نمو الجهاز 2. وقد تم تحسين تقنية للأنظمة الخطية،مثل جذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana والأوراق monocotyledonous و، ولكن أيضا لأنظمة غير الخطية، مثل أوراق ذوات الفلقتين 3. في الوقت الحاضر، يتزايد استخدام هذه المنهجية لدراسة كيفية الوراثية والهرمونية والتنموية، والعوامل البيئية تؤثر على انقسام الخلايا والتوسع في مختلف الأجهزة (الجدول 1). وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر أيضا إطارا لربط العمليات الخلوية للوائح الكيمياء الحيوية، والجزيئية، والفسيولوجية التي تقوم عليها (الجدول 2)، على الرغم من القيود يمكن أن يفرضها حجم الجهاز والتنظيم المكاني للتقنيات التي تتطلب كميات أكبر من المواد النباتية (على سبيل المثال، المستقلب القياسات، والبروتينات، وما إلى ذلك).

أوراق مونوكتلدونووس، مثل الذرة (ذرة شامية) ورقة، وتمثل النظم الخطية في الخلايا التي تتحرك من قاعدة ورقة نحو الطرف، ويمر بالتتابع من خلال منطقة النسيج الإنشائي واستطالة للوصول إلى النضجمنطقة. وهذا يجعل من نظام نموذج مثالي للدراسات الكمية من الأنماط المكانية للنمو 4. وعلاوة على ذلك، أوراق الذرة لها مناطق كبيرة النمو (النسيج الإنشائي ومنطقة الاستطالة تمتد عدة سنتيمترات 5) وتوفر إمكانيات للدراسات في المستويات التنظيمية الأخرى. وهذا يسمح للتحقيق في الآليات التنظيمية (المفترضة) السيطرة على انقسام الخلايا والتوسع، كميا عن طريق تحليل الحركية من خلال مجموعة من التقنيات الجزيئية، والقياسات الفسيولوجية، ونهج بيولوجيا الخلية (الجدول 2).

هنا، ونحن نقدم على بروتوكول لإجراء تحليل الحركية في أوراق monocot. أولا، نجد تفسيرا لكيفية إجراء تحليل سليم كل من انقسام الخلايا واستطالة الخلايا بوصفها وظيفة من موقف على طول محور ورقة وكيفية حساب المعلمات الحركية. ثانيا، وتبين لنا أيضا كيف يمكن استخدامها كأساس لتصميم العينات. هنا، نحن نناقش حالتين: عالية الدقة أخذ العينات ل د تركز أخذ العينات، وتمكن من تحسين فرص تفسير البيانات وتوفير الوقت / المال، على التوالي.

الجدول 1. نظرة عامة على الحركية تحليل أساليب القياس الكمي لانقسام الخلايا والتوسع في مختلف الأجهزة.

عضو مرجع
أوراق monocotyledonous و 16، 20، 21، 22
نصائح الجذر 2، 23، 24، 25، 26، 27، 28، 29
أوراق ذوات الفلقتين 21، 30، 31
تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي 32

الجدول 1. نظرة عامة على الحركية تحليل أساليب القياس الكمي لانقسام الخلايا والتوسع في مختلف الأجهزة.

ther.within الصفحات = "1"> الشكل (3)

الجدول 2. رابط بين العمليات الخلوية كميا عن طريق تحليل الحركية للتنظيم على المستوى الجزيئي. مراجع لمختلف الدراسات التي تربط بين تقدير من العمليات الخلوية إلى نتائج فحوصات الكيمياء الحيوية والجزيئية في مختلف الأنواع وأجهزة. endotransglucosylase Xyloglucan (XET)، malondialdehyde (MDA)، التي تعتمد على تحركات السيكلين (للمعلمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول التالي لتحليل الحركية هي صالحة فقط للأوراق خلال النمو المطرد للدولة. وهذا ينطوي على استقرار سعر ورقة استطالة والأنماط المكانية من طول الخلية والتوسع في ورقة خلال فترة تمتد لعدة أيام 6.

1. نمو النبات وقياسات ورقة الاستطالة معدل (لير)

  1. اختيار ورقة في النمو المطرد للدولة ومرحلة تنموية من الفائدة.
    ملاحظة: هناك فرق بين النمو المطرد للدولة والنمو المتكررة، مما يعني الأنماط المكانية مماثلة على أوراق متتالية على نفس المحور. خلال المراحل المبكرة من نمو البادرات والأوراق المتعاقبة تنمو عادة على نحو متزايد أسرع نظرا لزيادة حجم منطقة نمو 7. على الرغم من أن بعض المواقف ورقة أعلى يمكن أن يكون لها نمط نمو مماثل 8، وهذا هو مرحلة عابرة التي قد تتأثر العلاجات قيد التحقيق. ولذلك فمن المهم للمقارنة بين خطوط والنق eatments بشكل صارم على نفس الموقف ورقة، على الرغم من أنه قد يكون وضع في وقت مختلف. حتى في معدل استطالة المستمر، والوضع معدل النمو ليست بالضرورة هي نفسها في مراحل النمو المختلفة. وبالتالي، فمن المهم تحليل الأوراق في نفس المرحلة التنموية 8، الذي يعرف عادة من قبل عدد أيام بعد ظهور.
  2. لإجراء تحليل الحركية الكامل للنمو ورقة في ذوات الفلقة، وتنمو النباتات لا يقل عن 15 لكل معاملة وراثى تحت ظروف خاضعة للرقابة في غرفة النمو.
  3. في الوقت الذي رقة من مصلحة يظهر (ظهور كوكب من الأوراق المحيطة)، بدء قياس طول ورقة يوميا مع الحاكم حتى يتم توسيع بالكامل ورقة (الشكل 1I). طول الورقة يوحي طول من مستوى التربة لغيض من ورقة. يجب الحرص على عدم كسر أو تلف ورقة، لأن هذا قد يغير نموها.

إعادة 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg "/>
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي لتحليل الحركية من أوراق الذرة تقاس رقة في المصالح مع حاكم لمدة ثلاثة أيام متتالية لحساب الاستطالة أسعار ليف (لير). بعد ذلك، يتم حصاد الأوراق ويستخدم شريحة ثلاثة سنتيمترات لتحديد حجم النسيج الإنشائي. ويتم ذلك عن طريق قياس طول من قاعدة ما يصل الى الرقم الإنقسامية الأكثر البعيدة بعد تلطيخ دابي. (A) أمثلة على الأشكال الإنقسامية التكاثري و (ب) الشخصيات الإنقسامية التكوينية. يتم استخدام أول أحد عشر سم من قاعدة ورقة على الجانب الآخر من منتصف الوريد لخفض عشرة قطاعات سنتيمتر واحد لقياس طول الخلية. توفر هذه القياسات الأساس لخلق الشخصية طول الخلية، والذي يعمل على تحديد طول ناضجة خلية (ل حصيرة) وطول الخلايا وترك النسيج الإنشائي (ل شعبة). ال ول حصيرة لحساب معدل إنتاج خلايا (P)، بينما تستخدم ل شعبة وL مير لحساب عدد الخلايا في النسيج الإنشائي (N مير). في المقابل، تستخدم P و N مير لحساب متوسط معدل انقسام الخلايا (D)، الذي هو معكوس مدة دورة الخلية (T ج). السهام من نفس اللون تشير المعلمات التي يتم استخدامها لحساب المعلمة التالية على هذه الأسهم. الحانات النطاق = 40 ميكرون. وتستخدم الأرقام الرومانية للإشارة إلى الإجراءات التجريبية المحددة موضح في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. حصاد

  1. في هذه المرحلة التنموية التي تهم (على سبيل المثال، في اليوم الثالث بعد ظهور)، واختيار خمسة على الأقل ص تمثيليlants من الدفعة التي لإجراء تحليل الحركية. نستمر في قياس بقية النباتات كما هو موضح في الخطوة 1.3 لتحديد طول ورقة النهائي.
  2. قطع جزء من فوق الأرض من النبات. للحفاظ على جزء بارضي سليمة، وقطع في أقرب وقت ممكن إلى الجذور (الشكل 1ii).
  3. بدءا من الأوراق الخارجية، وإزالة كافة يترك حتى ورقة من الاهتمام من قبل الفتح بلطف واحدا تلو الآخر. إذا لزم الأمر، وإزالة بضعة ملليمترات اضافية من القاعدة إلى فصل الأوراق. أيضا إزالة الأوراق عليا وصغيرة محاطة ورقة من مصلحة (الشكل 1iii).
  4. قطع قطعة 3 سم، بدءا من القاعدة على جانب واحد من منتصف الوريد، وتخزينها في أنبوب 1.5 مل اختبار مليئة 3: 1 (ت: ت) الايثانول المطلق: محلول حمض الخليك (تنبيه: ارتداء القفازات) في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تصل إلى عدة أشهر (الشكل 1iv). وبعد أن تستخدم هذه الشريحة لتحديد طول النسيج الإنشائي.
  5. منالجانب الآخر من الوريد، وقطع شريحة 11 سم من قاعدة (الشكل 1 ت) ووضعه في أنبوب 15 مل مليئة الايثانول المطلق في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 ساعة لإزالة أصباغ (الشكل 1 السادس).
    ملاحظة: في وقت لاحق، استخدم فقط 10 سم الأولى لتحديد الشخصية طول الخلية (انظر مناقشة).
  6. تجديد الايثانول المطلق لجولة أخرى من تنظيف عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة (الشكل 1vi).
  7. وأخيرا، استبدل الايثانول المطلق مع حمض اللبنيك النقي (تنبيه: ارتداء القفازات) لتنظيف وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو حتى استخدامها مرة أخرى (الشكل 1vi).

3. النسيج الإنشائي قياسات الطول

  1. إعداد العازلة الشطف التي تحتوي على 50 ملي كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، 5 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA، تنبيه: ارتداء قفازات) و 10 ملي تريس (hydroxymethyl)، aminomethane الهيدروكلوريك حمض (تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7).
  2. خذ قطعة 3 سم من القسم 2.4 وهكذاحزب العدالة والتنمية في المخزن المؤقت لمدة 20 دقيقة (الشكل 1vii).
  3. في الوقت الذي تنتظر، استخدم عازلة الشطف لإعداد حل تلطيخ 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) من 1 ميكروغرام / مل، والحفاظ على الجليد وفي الظلام.
  4. وصمة عار على النوى عن طريق وضع قطعة النسيج الإنشائي لمدة 2-5 دقيقة في حل تلطيخ دابي. العمل على الجليد وفي الظلام (الشكل 1vii).
  5. تحقق من وجود إشارة مضان من تصاعد بسرعة الجزء المتعلق كوب المجهر وتغطية ذلك مع غطاء زجاجي. خلايا البشرة يجب أن تظهر مضان، في حين يجب على طبقات الخلايا الكامنة وراء ذلك.
  6. إذا كان تلطيخ ليست كافية، ووضع شريحة مرة أخرى في حل تلطيخ دابي لبعض دقائق إضافية.
  7. لوقف تلطيخ، تركيب شرائح في قطرة من الشطف عازلة على شريحة المجهر وغطاء مع غطاء زجاجي.
  8. استخدام المجهر مجهزة للأشعة فوق البنفسجية ومضان في التكبير 20X، مما يسمح لرؤية حول 1000 epidermخلايا القاعدة في مرة واحدة. انتقل في جميع أنحاء القطاع والبحث عن الأرقام التكاثري الإنقسامية (الطورية، طور الصعود، الطور النهائي، والانقسام السيتوبلازمي)، ولكن تجنب انقسام الخلايا التكويني للتطوير الثغور (الشكل 1viii) 9. تحديد حيث يقع الرقم الإنقسامية الأكثر البعيدة.
  9. تحديد طول النسيج الإنشائي من خلال قياس المسافة بين قاعدة ورقة ومعظم البشرة البعيدة الرقم الإنقسامية. استخدام البرمجيات صورة تحليل (على سبيل المثال، يماغيج) لقياس طول كامل من إطار الصورة.
    1. حساب عدد من الإطارات التي تغطي طول النسيج الإنشائي الكامل (من قاعدة ورقة إلى الرقم الإنقسامية الأكثر البعيدة) ومضاعفة هذا الرقم طول إطار واحد للحصول على طول النسيج الإنشائي الكامل (الشكل 1ix).

4. خلية الملف طول

  1. خذ القطعة التي يتم تخزينها في حامض اللبنيك (الخطوة 2.5) ووضعها بعناية على مقاعد البدلاء. قطع شرائح فيتها مشرط في 10 شرائح 1 سم كل (الشكل 1X).
  2. تركيب شرائح ورقة المتعاقبة على شريحة المجهر في قطرة صغيرة من حمض اللبنيك. تأكد من أن تواجه باستمرار إما متجه نحو المحور أو مجافي المحور حتى الجانب. من حيث المبدأ، ليس هناك تفضيل لجانب معين.
  3. استخدام المجهر مجهزة تدخل الفرق المقابل (DIC) البصريات لتحليل القطاعات، بدءا من قاعدة ورقة. قياس مع صورة برامج التحليل طول لا يقل عن 20 خلايا البشرة تكرار في ملفات المجاورة مباشرة إلى ملفات الثغور من أجل اختيار باستمرار نفس نوع من الخلايا.
    1. القيام بذلك في المواقف متباعدة بشكل متساو على طول كل من قطاعات (4 وظائف في القطاع تكفي)، وتأكد من أن أكتب موقف المقابلة لكل قياس في جميع أنحاء رقة (الشكل 1xi).
  4. تحديد متوسط ​​طول خلية في كل ملم على طول محور ورقة باستخدام المحلية متعدد الحدود تجانس صrocedure، نفذت في R-النصي (الشكل 1xii، الملف التكميلي 1).
    ملاحظة: يوفر البرنامج النصي R سلسلة من البيانات مع زيادة تجانس. كمية من التنعيم المطلوبة هو إجراء تعسفي إلى حد ما، وينبغي من الناحية المثالية إزالة مجرد ضجيج المحلي، ولكن لا تؤثر على منحنى العام. تأكد من استخدام نفس الكمية من تمهيد لجميع العينات في غضون تجربة واحدة.
  5. متوسط ​​طول خلية في كل موقف بين النباتات وحساب الخطأ المعياري لإنشاء ملف تعريف طول الخلية على طول محور ورقة.

5. حسابات الحركية المعلمات (انظر الملف التكميلي 2)

  1. حساب لير عن طريق أخذ التغير في طول الورقة بين اثنين من النقاط الزمنية المتعاقبة (على سبيل المثال، 24 ساعة، كما في الخطوة 1.3) وتقسيمه من قبل الفاصل الزمني.
  2. حساب طول منطقة نمو (L جي زد) المقابلة لالقاصي موقف من القاعدة حيث تصل الخلايا 95٪ من م على ناضجةطول ليرة لبنانية على طول الشخصي خلية مملس.
    1. خذ على كل موقف على مملس الشخصي طول الخلية 95٪ من متوسط جميع أطوال الخلية التالية هذا الموقف (الشكل 2).
    2. مقارنة أطوال خلية مملس (الخطوة 4.4) مع احتساب طول الخلية 95٪ في كل موقف. بدءا من قاعدة ورقة، وتنتهي منطقة النمو في موقف حيث يساوي طول الخلية الفعلي 95٪ من أطوال الخلية التالية (الشكل 2، وانظر التكميلية البيانات 2).

الشكل 2
الشكل 2: تحديد نهاية منطقة النمو النسيج الإنشائي: في الوضع المشار مع نجمة داود الحمراء، حجم الخلية الفعلي هو أصغر من 95٪ (الخط المنقط باللون الأحمر) من متوسط حجم الخلية من كل الخلايا التالية هذا الموقف (صلبة الأحمر خط). نهاية منطقة نمو (L جي زد؛ وأبان مع أبنجمة LUE) يقع فيها 95٪ (منقط الخط الأزرق) من متوسط ​​حجم الخلية من كل الخلايا التالية هذا الموقف (الخط الأزرق الصلبة) يساوي حجم الخلية الفعلي. منطقة تقسيم (D)، منطقة الاستطالة (E)، ومنطقة ناضجة (M). السهام متقطع تشير إلى التقارب بين حجم المحلي و 95٪ من متوسط الحجم على الجزء الأعلى من ورقة عند الانتقال من المواقف القاعدية إلى طرف ورقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. حساب طول منطقة الاستطالة (L ايل) على أنها الفرق بين طول منطقة نمو (L جي زد) وحجم النسيج الإنشائي (L مير. تحديدها في الخطوة 3).
  2. حساب طول خلية ناضجة (ل حصيرة)، ومتوسط طول الخلية في منطقة ناضجة.
  3. تقسيم لير التي كتبها l حصيرة للحصول علىمعدل إنتاج خلايا (P).
  4. حساب عدد الخلايا في منطقة الاستطالة (N ايل) بالفرق بين N جي زد وN مير. عدد الخلايا في النسيج الإنشائي (N مير) يساوي العدد التراكمي للخلايا الموجودة في فترات المقابلة لالنسيج الإنشائي. عدد الخلايا في منطقة نمو (N جي زد) يساوي العدد التراكمي للخلايا الموجودة في فترات المقابلة لمنطقة النمو.
  5. حساب متوسط معدل انقسام الخلايا (D) كما P / N مير. مدة دورة الخلية (T ج) تساوي قانون الجنسية (2) / د.
  6. حساب الوقت في منطقة الاستطالة (T ايل) بقسمة N شرم بواسطة P. الوقت في منطقة تقسيم يساوي سجل 2 (N مير) * T ج. طول الخلايا وترك النسيج الإنشائي (ل شعبة)يساوي طول خلية من التشكيل الجانبي طول الخلية مملس في نهاية النسيج الإنشائي.
  7. حساب متوسط معدل التوسع الخلية (R ايل) باستخدام الصيغة التالية: قانون الجنسية (ل حصيرة) -ln (ل شعبة)] / T ايل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، وتبين لنا المقارنة بين النباتات المروية جيدا (تحكم، و 54٪ المحتوى المائي للتربة، (SWC)) والنباتات تتعرض لظروف إجهاد الجفاف (الجفاف، و 34٪ SWC) من حيث النمو ورقة بها. وقد نمت جميع النباتات في غرفة النمو في ظل الظروف التي تسيطر عليها (16 ساعة يوم / ليلة 8 ساعة، 25 ° C / 18 ° C يوم / ليلة، 300-400 μEm -2 ثانية -1 الضوئي إشعاع نشط (PAR)، وظروف الجفاف أنشئت عن طريق حجب المياه حتى تم التوصل إلى SWC الصحيحة ومن ثم الحفاظ أبعد من ذلك. وفي دراسة أولية، وقد عرفت أن ورقة الخامسة هي الأولى في الظهور وتطوير تحت هذا الشرط الإجهاد. لذلك، تم اختيارها لتكون ورقة من وكانت الفائدة. ويبلغ طول ورقة النهائي (ليرة لبنانية) من النباتات وشدد الجفاف أقل من 40٪ من واحدة من النباتات المروية جيدا، والتي كانت نتيجة للير أقل (الجدول 3). ولكي نفهم الأساس الخلوي للليااستجابة نمو F، أجرينا تحليلا الحركية. عموما، معدل رقة استطالة هو وظيفة إنتاج خلايا في النسيج الإنشائي وحجم الخلية الناضجة المحددة في منطقة الاستطالة (الشكل 3). لذلك، يجب أن يكون راجعا إلى تأثيرات على واحد أو كل من هذه المعلمات تقصير من ورقة. نتائجنا تظهر أنه في حين لم يتأثر طول خلية ناضجة (ل حصيرة)، ومعدل إنتاج خلايا (P) تم تخفيض بنسبة 71٪ (الجدول 3). ل حصيرة يعتمد على طول الخلايا وترك النسيج الإنشائي (ل شعبة) وهي المرة هذه الخلايا تنفق في منطقة الاستطالة (T شرم)، والنسبي معدل توسع الخلية (R القاهرة). لم يلاحظ أي تأثير لل شعبة، في حين تم تخفيض R شرم بنسبة 67٪ في ظروف الجفاف. وقد تم تعويض هذا التأثير من قبل ما يقرب من ثلاثة أضعاف تي ايل، مما أدى في نفس ل حصيرة </ دون> كما هو الحال في الظروف السيطرة. وكان الانخفاض في معدل إنتاج خلايا، في المقابل، الناجمة عن كل من انخفاض معدل متوسط خلية قسم (D) وعدد أقل من الخلايا في النسيج الإنشائي (N مير). تم تخفيض طول النسيج الإنشائي (L مير) وعلى النقيض من طول منطقة نمو (L جي زد)، التي لم تتأثر بشكل كبير. في الختام، تظهر هذه النتائج أنه في هذه الحالة، عدد الخلايا، على عكس حجم الخلية، كان له دور كبير في تحديد حجم ورقة.

المعلمات الحركية C د النسبة المئوية للتغير CD ف قيمة
ليرة لبنانية 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
لير (مم / ساعة) 2.8 ± 0.1 0.8 ± 0.0 -73 0.000
ل حصيرة (ميكرون) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
ف (خلايا / ساعة) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (خلايا · خلية -1 · -1 ساعة) 0.028 ± 0.003 0.010 ± 0.001 -63 0.000
تي ج (ساعة) 26 ± 3 71 ± 7 +173 0.000
تي شعبة (ساعة) 249 ± 27 656 ± 71 +164 0.000
L مير (مم) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0.010
N مير 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R ايل (ميكرون ميكرون · -1 ساعة) 0.043 ± 0.002 0.014 ± 0.001 -67 0.000
ل شعبة (ميكرون) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
تي ايل (ساعة) 42 ± 2 125 ± 11 +199 0.000
N ايل 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L ز ض (مم) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N ز ض 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0.010

الجدول 3. تحليل الحركية على انقسام الخلايا وتوسيع الخلية خلال النمو المطرد للدولة من ورقة الخامسة. النباتات والنباتات المروية جيدا تتعرض للجفاف الإجهاد البيانات هي متوسطات ± SE (ن = 5، ليرة لبنانية: ن = 10). تم استخدام اختبار (ت) الطالب باعتباره التحليل الإحصائي. المعلمات: طول الورقة (ليرة لبنانية)، ومعدل الاستطالة ورقة (لير)، طول الخلية الناضجة (ل حصيرة)، ومعدل إنتاج خلايا (P)، ومعدل انقسام الخلايا (D)، ومدة دورة الخلية (T ج)، والوقت في منطقة تقسيم ( تي شعبة)، وطول النسيج الإنشائي (L مير)، وعدد من الخلايا في النسيج الإنشائي (N مير)، ومعدل استطالة الخلية النسبية (R شرم)، وطول الخلايا وترك النسيج الإنشائي (ل شعبة)، والوقت في منطقة الاستطالة (T شرم)، وعدد من الخلايا في منطقة الاستطالة (N شرم)، طول منطقة نمو (L جي زد)، وعدد من الخلايا في منطقة نمو (N جي زد)، وظروف الماء جيدا (C)، والإجهاد الجفاف ( D)، وهو د يكن كبيرا (NS).

الشكل (3)
الرقم 3: العلاقة بين المعلمات الحركية وطول الورقة النهائية (LL) يعتمد على استطالة أسعار ليف (لير)، وهذا بدوره يعتمد على إنتاج خلايا (P) وطول خلية ناضجة (ل حصيرة). عدد الخلايا في النسيج الإنشائي (N مير)، و سعر انقسام الخلايا (D) جنبا إلى جنب تحديد P، مع مدة دورة الخلية (T ج) كما معكوس D. الوقت في منطقة الاستطالة (T شرم)، طول الخلايا وترك النسيج الإنشائي (ل شعبة)، والنسبي معدل توسع الخلية (R ايل) تحديد طول خلية ناضجة (ل حصيرة). عدد الخلايا في منطقة الاستطالة (N القاهرة)..jove.com / ملفات / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالإضافة إلى تطبيقه باعتباره تحليلا مفصلا لنمو الجهاز، يقدم تحليلا الحركية خريطة توطين منطقة نمو الأوراق ويسمح أخذ العينات مع قرار تحت المنطقة لالجزيئية والكيمياء الحيوية ويحلل 4،10،11. وكمثال على ذلك، الشكل 4A يظهر malondialdehyde (MDA) الكمي على طول منطقة نمو نبات الذرة في محطات تعرضوا لنفس الشروط المذكورة أعلاه. نجمة داود الحمراء هو المستقلب الثانوي تشكلت خلال بيروكسيد الدهون التي كتبها ROS ويعكس مستويات الضرر التأكسدي 12. وقد تم قياس MDA في كل سنتيمتر من ورقة، بدءا من قاعدة والتي سمحت لتحليل التغيرات التركيز على التدرج نمو 11. كما تسببت علاج جفاف 40٪ رقة تقصير، وطول المناطق التنموية (مريلم الجذعية، منطقة الاستطالة، ومنطقة الناضجة) في محطات المراقبة لا تتطابق مع طول نفس المناطق في الجفاف وشدد النباتات (الشكل 4B). كما رأينا في الشكل 4B، وكان النسيج الإنشائي في محطات مراقبة حوالي 1.5 سم، ومنطقة الاستطالة امتدت 1،5-6،8 سم من قاعدة ورقة. في النباتات وأكد، والمترجمة النسيج الإنشائي 0-1،1 سم ومنطقة الاستطالة 1،1-6،1 سم. وزادت مستويات MDA ومنطقة النمو كلها في محطات شدد الجفاف مقارنة بمعاملة السيطرة. مع مساعدة من تحليل الحركية، يمكننا أن نستنتج أن محتوى MDA وزادت وخاصة في منطقة الناضجة على حد سواء العلاجات السيطرة والجفاف. دون معرفة أحجام المناطق التنموية، فإننا نخلص إلى أن، تحت إجهاد الجفاف، ويزيد من محتوى MDA في مرحلة النمو السابقة مما كانت عليه في محطات المراقبة، التي من شأنها أن تكون خاطئة لأنها لا تأخذ في الاعتبار التحول من المناطق بسبب لروقال انه ورقة تقصير. لذلك، إجراء تحليل الحركية قبل القياسات البيوكيميائية يتسم بأهمية حاسمة من أجل تفسير البيانات بشكل صحيح.

الشكل (4)
الشكل 4: مثال عالية الدقة القياسات البيوكيميائية وأخذ عينات لتحليلها تركيزا (A) Malonaldehyde (MDA) التركيزات المقاسة على طول منطقة نمو نبات الذرة (مقسمة إلى عشرة أجزاء) من النباتات التي تزرع حالة في الماء جيدا والنباتات تتعرض للجفاف. معالجة 10. البيانات هي متوسطات ± SE (ن = 5). كان يستخدم في اتجاهين أنوفا باعتباره التحليل الإحصائي، وترد ف القيم المقبل إلى لوحة الرسم البياني (عوامل هي: الجفاف (د) وقطاع (ق))؛ FW: الوزن الطازج. (ب) تصور مناطق النمو المختلفة في السيطرة والنباتات وشدد الجفاف. منطقة تقسيم (D)، منطقة الاستطالة (E)، ومنطقة ناضجة (M). تم تكبيرها خلايا 125 مرة. (C) لمحة الخلوي طول الرقابة ومحطات المعالجة الجفاف. البيانات هي متوسطات ± SE (ن = 5). (D) الاختلافات في أخذ العينات مركزة في كل من السيطرة ومحطات المعالجة الجفاف. وتشير المربعات الزرقاء موقف أخذ العينات للمقارنة في نفس المرحلة التنموية في كل من العلاجات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وبالإضافة إلى توفير إمكانية مقارنة بنفس المناطق التنموية في دراسات عالية الدقة، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحليل الحركية كأساس لتحليلات أكثر تركيزا، والتي تؤخذ فقط عينات من مناطق محددة تحتوي على خلايا في هذه المرحلة التنموية نفسها. قارنا لمحات طول الخلية، التي تقدمها تجانس القياسات طول الخلية المجهرية، في أول ج عشرentimeters من قاعدة ورقة عن نطاق السيطرة والنباتات وشدد الجفاف الشكل 4C يظهر ذلك، باستخدام ملف طول الخلية، استطعنا تحديد طول المناطق التنموية ويمكن أيضا تتبع ديناميات النمو في كل من السيطرة والنباتات وشدد الجفاف. يسمح هذا أخذ العينات محددة من الخلايا المتكاثرة في النسيج الإنشائي (قبل الزيادة الحادة)، وتوسيع الخلايا في منطقة الاستطالة (في منتصف زيادة حادة) والخلايا الناضجة الشباب في منطقة ناضجة (بداية من الهضبة). وتشير النتائج التي توصلنا إليها، ويرجع ذلك إلى تقصير ورقة في استجابة للجفاف، هذه المناطق لا تتفق في السيطرة وفي النباتات وشدد. من أجل أخذ عينات المتكاثرة، والتوسع، وخلايا ناضجة شابة في محطات مراقبة، كنا بحاجة إلى الأول والخامس، وسنتيمتر التاسع من قاعدة ورقة، على التوالي. ومع ذلك، في النباتات أكد هذه القطاعات تتوافق مع سنتيمتر الأول، الرابع، والثامن على التوالي. هذا النوع من أكثر تركيزاوقد أثبتت المعاينة أن تكون مفيدة في حالة إجراء دراسات أكثر شاقة ومكلفة، أو تستغرق وقتا طويلا، مثل الحمض النووي الريبي التسلسل، البروتينات، الايض، الخ

الملف التكميلي 1: R-النصي لإجراء تمهيد متعدد الحدود الرجاء انقر بزر الماوس الأيمن لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: حسابات المعلمات الحركية الرجاء انقر بزر الماوس الأيمن لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحليل الحركية الكاملة على أوراق الذرة يمكن تحديد الأساس الخلوي للنمو الأوراق ويسمح لتصميم استراتيجيات أخذ العينات فعالة. على الرغم من أن البروتوكول هو بسيط نسبيا، ينصح بعض الحذر في الخطوات الهامة التالية: (1) من المهم لفصل الأصغر سنا، ويترك المغلقة (خطوة 2.3) دون الإضرار النسيج الإنشائي، منذ تقرير طول النسيج الإنشائي (الخطوة 3) يتطلب كاملة النسيج الإنشائي ليكون حاضرا. بعض الممارسات مسبقا قد تكون هناك حاجة. (2) ويستند بارضي تقرير مطول على تفسير من الشخصيات الإنقسامية. ولذلك، فإننا ننصح أن، في تجربة واحدة، نفس الشخص تجري هذه القياسات للحد من التباين يرجع ذلك إلى المنفذ. (3) على الرغم من أن تستخدم فقط عشرة سم للقياسات طول الخلية الفعلية، فمن المهم أن يشمل أحد عشر سم عند حصاد جزء لقياس طول الخلية (الخطوة 2.5)، لأن حافة الجزء تفعل أير دائما يغرق تماما في الإيثانول و / أو حمض اللبنيك. لذلك، هذا سنتيمتر إضافي يضمن المقاصة من عشرة سنتيمترات الأولى من منطقة النمو. (4) وفي النهاية، فمن المفيد أن تفقد نتائج جميع المعلمات الحركية للتأكد من أنها صحيحة. في الجدول 3، على سبيل المثال، فقد انخفض معدل إنتاج خلايا (ف) من النباتات وشدد الجفاف بنسبة 71٪، أو، بعبارة أخرى، ف الجفاف هو 0.29 من السيطرة P. منذ إنتاج الخلايا يعتمد على متوسط معدل انقسام الخلايا (دال؛ -63٪) وعدد الخلايا في النسيج الإنشائي (N مير؛ -20٪، الشكل 3)، ما يلي يمكن استخدامها للتحقق من صحة الإخراج: P (0.29) ≈ N مير (0.8) خ د (0.37). والشيء نفسه يمكن تطبيقه للير = ف س أنا حصيرة.

اعتمادا على التسهيلات المتاحة، بروتوكول يمكن تعديلها في بعض الخطوات. (1) أكثر من ذلكويستند البديل dvanced للقياسات طول الورقة اليدوية اليومية (خطوة 1.3) على الخطي سرعة الإزاحة المحولات (LVDTs) 13. ميزته هو أنه تمكن القياسات في قرار الوقت أعلى من ذلك بكثير، تتراوح ما بين دقائق إلى ثواني. (2) ومن الأهمية بمكان أن تشمل منطقة نمو كاملة خلال أخذ العينات. ومع ذلك، والظروف البيئية، وراثى، والأنواع، والمرحلة التنموية فحص قد يغير طول منطقة النمو. وبالتالي، فإنه من المفيد تقديم تقدير الأول من طول منطقة النمو في الاستجابة للعلاج تجربتك. ويستند هذا البروتوكول على السلالة النقية B73 نمت عند 25 درجة مئوية / 18 درجة مئوية (يوم / ليلة) في 300-400 μEm -2 -1 ق (الضوئى الإشعاع النشط - PAR). (3) من أجل تصور الأشكال الإنقسامية (الخطوة 3.8) دون استخدام مضان، وصمة عار Fuelgen يمكن تطبيق 14. (4) وتجانس البيانات يمكن أيضا أن يتم في MS Excel بدلا من R باستخدام غنى عنه خمس نقاطdratic المناسب مع وظيفة "LINEST" 15.

قيود هاما من هذه التقنية هو أن منطقة نمو كلها تحتاج إلى أن تحصد خلال النمو المطرد للدولة. من أجل ضمان النمو المطرد للدولة، يجب أن يكون مثاليا نمت النباتات في ظل ظروف النمو للرقابة، لأن تقلبات في شدة الضوء ودرجة الحرارة والرطوبة أو تؤثر على معدل استطالة ورقة 16. لهذا السبب، فإن تحليل الحركية أقل ملاءمة للالنباتات التي تزرع تحت الظروف الميدانية. عيب آخر هو أن يترك تحتاج إلى ظهر، مما يجعل من المستحيل لدراسة الأوراق التي لا تزال محاطة الأوراق القديمة. وأخيرا، يناسب بروتوكول للأنواع monocotyledonous ومع مناطق نمو كبيرة تضم عدد قليل من سم على الاقل. تحليل الحركية في ذوات الفلقة أصغر (على سبيل المثال، العمل، الأرز)، ومع ذلك، هو ممكن ولكن يحتاج إلى بعض التعديلات في إعداد العينات 17،18.

كثيرا ما تستخدم آخرد نهج لتحليل الظواهر نمو التفاضلية هو تحليل النمو الكلاسيكية. هذا التحليل الكمي معدلات النمو النسبية مصنع كامل ويحدد توزيع الكامن وراء الضوئي الكربون المتأتية في منطقة الضوئي الجديدة وإلى أجزاء أخرى من النبات 19. تحليل الحركية، ومع ذلك، يسمح لفهم أكثر تفصيلا من العمليات الخلوية الأساسية التي تقترن إلى الظواهر النمو القائم على قياس انقسام الخلايا والتوسع. وعلاوة على ذلك، فإن إمكانية لتحديد طول كل منطقة نمو تسمح للارتباط القياسات الجزيئية على طول محور ورقة إلى مرحلة تنموية محددة يتأثر علاج قيد الدراسة. هذا أمر بالغ الأهمية لتفسير البيانات. عندما محدودة في الزمن أو الميزانية أو عندما يرغبون في مراحل نمو محددة، ونتائج هذا التحليل يسمح لأخذ العينات مركزة، والحد من عدد من العينات اللازمة لتحليلها. في الختام، تحليل الحركية تمكينق تحديد المعلمات الخلوية الكامنة استجابات التوتر والاختلاف الجيني في نمو نبات ويمكن ربطها المنبع العمليات التنظيمية (الجدول 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل زمالة الدكتوراه من جامعة أنتويرب إلى VA. زمالة الدكتوراه من مؤسسة العلوم الفلمنكية (FWO، 11ZI916N) إلى KS. منح المشاريع من FWO (G0D0514N)؛ منحة بحثية النشاط البحثي متضافرة (غوا)، "علم الأحياء ونظم النهج من ورقة التشكل" من مجلس البحوث في جامعة أنتويرب. وبين الجامعات الجذب البولنديين (IUAP السابع / 29، MARS)، "الذرة ونبات الأرابيدوبسيس الجذر واطلاق النار على النمو" من المكتب البلجيكي الاتحادي العلوم السياسة (BELSPO) إلى GTSB هان Asard، Bulelani L. Sizani وحمادة عبد الجواد عن ساهمت في الفيديو .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Quantitative analyses of cell division in plants. Plant Mol. Biol. 60, 963-979 (2006).
  2. Silk, W. K., Erickson, R. O. Kinematics of Plant-Growth. J. Theor. Biol. 76, 481-501 (1979).
  3. Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Chapter 14 (2010).
  4. Avramova, V., Sprangers, K., Beemster, G. T. S. The Maize Leaf: Another Perspective on Growth Regulation. Trends Plant Sci. 20, 787-797 (2015).
  5. Rymen, B., et al. Cold nights impair leaf growth and cell cycle progression in maize through transcriptional changes of cell cycle genes. Plant Physiol. 143, 1429-1438 (2007).
  6. Muller, B., Reymond, M., Tardieu, F. The elongation rate at the base of a maize leaf shows an invariant pattern during both the steady-state elongation and the establishment of the elongation zone. J. Exp. Bot. 52, 1259-1268 (2001).
  7. Beemster, G. T. S., Masle, J., Williamson, R. E., Farquhar, G. D. Effects of soil resistance to root penetration on leaf expansion in wheat (Triticum aestivum L): Kinematic analysis of leaf elongation. J. Exp. Bot. 47, 1663-1678 (1996).
  8. Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Spatial and Temporal Aspects of Leaf Growth-Inhibition. Planta. 191, 433-439 (1993).
  9. Sylvester, A. W., Smith, L. G. Cell Biology of Maize Leaf Development. Handbook of maize: It's Biology. Bennetzen, J. L., Hake, S. C. , Springer. NY. (2009).
  10. Nelissen, H., et al. A Local Maximum in Gibberellin Levels Regulates Maize Leaf Growth by Spatial Control of Cell Division. Curr. Biol. 22, 1183-1187 (2012).
  11. Avramova, V., et al. Drought Induces Distinct Growth Response, Protection, and Recovery Mechanisms in the Maize Leaf Growth Zone. Plant Physiol. 169, 1382-1396 (2015).
  12. Picaud, J. C., et al. Total malondialdehyde (MDA) concentrations as a marker of lipid peroxidation in all-in-one parenteral nutrition admixtures (APA) used in newborn infants. Pediatr. Res. 53, 406 (2003).
  13. Basu, P., Pal, A., Lynch, J. P., Brown, K. M. A novel image-analysis technique for kinematic study of growth and curvature. Plant Physiol. 145, 305-316 (2007).
  14. Vander Weele, C. M., et al. A new algorithm for computational image analysis of deformable motion at high spatial and temporal resolution applied to root growth. Roughly uniform elongation in the meristem and also, after an abrupt acceleration, in the elongation zone. Plant Physiol. 132, 1138-1148 (2003).
  15. Nelissen, H., Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Plant Organogenesis. DeSmet, I. , Chapter 17 (2013).
  16. Ben-Haj-Salah, H., Tardieu, F. Temperature Affects Expansion Rate of Maize Leaves without Change in Spatial-Distribution of Cell Length - Analysis of the Coordination between Cell-Division and Cell Expansion. Plant Physiol. 109, 861-870 (1995).
  17. Fiorani, F., Beemster, G. T. S., Bultynck, L., Lambers, H. Can meristematic activity determine variation in leaf size and elongation rate among four Poa species? A kinematic study. Plant Physiol. 124, 845-855 (2000).
  18. Pettko-Szandtner, A., et al. Core cell cycle regulatory genes in rice and their expression profiles across the growth zone of the leaf. J. Plant Res. 128, 953-974 (2015).
  19. Poorter, H., Remkes, C. Leaf-Area Ratio and Net Assimilation Rate of 24 Wild-Species Differing in Relative Growth-Rate. Oecologia. 83, 553-559 (1990).
  20. Macadam, J. W., Volenec, J. J., Nelson, C. J. Effects of Nitrogen on Mesophyll Cell-Division and Epidermal-Cell Elongation in Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 89, 549-556 (1989).
  21. Tardieu, F., Granier, C. Quantitative analysis of cell division in leaves: methods, developmental patterns and effects of environmental conditions. Plant Mol. Biol. 43, 555-567 (2000).
  22. Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Possible Role of Some Mineral Elements in Growth-Inhibition. Planta. 196, 699-705 (1995).
  23. Erickson, R. O., Sax, K. B. Rates of Cell-Division and Cell Elongation in the Growth of the Primary Root of Zea-Mays. P. Am. Philos. Soc. 100, 499-514 (1956).
  24. Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
  25. Goodwin, R. H., Stepka, W. Growth and differentiation in the root tip of Phleum pratense. Am. J. Bot. 32, 36-46 (1945).
  26. Hejnowicz, Z. Growth and Cell Division in the Apical Meristem of Wheat Roots. Physiologia Plantarum. 12, 124-138 (1959).
  27. Gandar, P. W. Growth in Root Apices .1. The Kinematic Description of Growth. Bot. Gaz. 144, 1-10 (1983).
  28. Baskin, T. I., Cork, A., Williamson, R. E., Gorst, J. R. Stunted-Plant-1, a Gene Required for Expansion in Rapidly Elongating but Not in Dividing Cells and Mediating Root-Growth Responses to Applied Cytokinin. Plant Physiol. 107, 233-243 (1995).
  29. Sacks, M. M., Silk, W. K., Burman, P. Effect of water stress on cortical cell division rates within the apical meristem of primary roots of maize. Plant Physiol. 114, 519-527 (1997).
  30. Granier, C., Tardieu, F. Spatial and temporal analyses of expansion and cell cycle in sunflower leaves - A common pattern of development for all zones of a leaf and different leaves of a plant. Plant Physiol. 116, 991-1001 (1998).
  31. De Veylder, L., et al. Functional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabidopsis. Plant Cell. 13, 1653-1667 (2001).
  32. Kwiatkowska, D. Surface growth at the reproductive shoot apex of Arabidopsis thaliana pin-formed 1 and wild type. J. Exp. Bot. 55, 1021-1032 (2004).
  33. Kutschmar, A., et al. PSK-alpha promotes root growth in Arabidopsis. New Phytol. 181, 820-831 (2009).
  34. Vanneste, S., et al. Plant CYCA2s are G2/M regulators that are transcriptionally repressed during differentiation. Embo J. 30, 3430-3441 (2011).
  35. Eloy, N. B., et al. Functional Analysis of the anaphase-Promoting Complex Subunit 10. Plant J. 68, 553-563 (2011).
  36. Eloy, N. B., et al. SAMBA, a plant-specific anaphase-promoting complex/cyclosome regulator is involved in early development and A-type cyclin stabilization. P. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 13853-13858 (2012).
  37. Dhondt, S., et al. SHORT-ROOT and SCARECROW Regulate Leaf Growth in Arabidopsis by Stimulating S-Phase Progression of the Cell Cycle. Plant Physiol. 154, 1183-1195 (2010).
  38. Baute, J., et al. Correlation analysis of the transcriptome of growing leaves with mature leaf parameters in a maize RIL population. Genome Biol. 16, (2015).
  39. Andriankaja, M., et al. Exit from Proliferation during Leaf Development in Arabidopsis thaliana: A Not-So-Gradual Process. Dev. Cell. 22, 64-78 (2012).
  40. Beemster, G. T. S., et al. Genome-wide analysis of gene expression profiles associated with cell cycle transitions in growing organs of Arabidopsis. Plant Physiol. 138, 734-743 (2005).
  41. Spollen, W. G., et al. Spatial distribution of transcript changes in the maize primary root elongation zone at low water potential. Bmc Plant Biol. 8, (2008).
  42. Candaele, J., et al. Differential Methylation during Maize Leaf Growth Targets Developmentally Regulated Genes. Plant Physiol. 164, 1350-1364 (2014).
  43. West, G., Inze, D., Beemster, G. T. S. Cell cycle modulation in the response of the primary root of Arabidopsis to salt stress. Plant Physiol. 135, 1050-1058 (2004).
  44. Zhang, Z., Voothuluru, P., Yamaguchi, M., Sharp, R. E., Peck, S. C. Developmental distribution of the plasma membrane-enriched proteome in the maize primary root growth zone. Front. Plant Sci. 4, (2013).
  45. Bonhomme, L., Valot, B., Tardieu, F., Zivy, M. Phosphoproteome Dynamics Upon Changes in Plant Water Status Reveal Early Events Associated With Rapid Growth Adjustment in Maize Leaves. Mol. Cell Proteomics. 11, 957-972 (2012).
  46. Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Assimilate Partitioning in the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades at High and Low Irradiance. Plant Physiol. 90, 1201-1206 (1989).
  47. Schnyder, H., Nelson, C. J., Spollen, W. G. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .2. Dry-Matter Partitioning and Carbohydrate-Metabolism in the Elongation Zone and Adjacent Expanded Tissue. Plant Physiol. 86, 1077-1083 (1988).
  48. Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Carbohydrate Fluxes within the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 85, 548-553 (1987).
  49. Vassey, T. L., Shnyder, H. S., Spollen, W. G., Nelson, C. J. Cellular Characterisation and Fructan Profiles in Expanding Tall Fescue. Curr. T. Pl. B. 4, 227-229 (1985).
  50. Allard, G., Nelson, C. J. Photosynthate Partitioning in Basal Zones of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 95, 663-668 (1991).
  51. Spollen, W. G., Nelson, C. J. Response of Fructan to Water-Deficit in Growing Leaves of Tall Fescue. Plant Physiol. 106, 329-336 (1994).
  52. Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .1. Relationship to Genetically Altered Leaf Elongation Rates. Plant Physiol. 74, 590-594 (1984).
  53. Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .2. Relationship to Leaf Elongation Rates Modified by Nitrogen-Fertilization. Plant Physiol. 74, 595-600 (1984).
  54. Silk, W. K., Walker, R. C., Labavitch, J. Uronide Deposition Rates in the Primary Root of Zea-Mays. Plant Physiol. 74, 721-726 (1984).
  55. Granier, C., Inze, D., Tardieu, F. Spatial distribution of cell division rate can be deduced from that of p34(cdc2) kinase activity in maize leaves grown at contrasting temperatures and soil water conditions. Plant Physiol. 124, 1393-1402 (2000).
  56. Voothuluru, P., Sharp, R. E. Apoplastic hydrogen peroxide in the growth zone of the maize primary root under water stress.1. Increased levels are specific to the apical region of growth maintenance. J. Exp. Bot. 64, 1223-1233 (2012).
  57. Wu, Y. J., Jeong, B. R., Fry, S. C., Boyer, J. S. Change in XET activities, cell wall extensibility and hypocotyl elongation of soybean seedlings at low water potential. Planta. 220, 593-601 (2005).
  58. Macadam, J. W., Nelson, C. J., Sharp, R. E. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .1. Spatial-Distribution of Ionically Bound Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 872-878 (1992).
  59. Macadam, J. W., Sharp, R. E., Nelson, C. J. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .2. Spatial-Distribution of Apoplastic Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 879-885 (1992).
  60. Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inze, D. Variation in growth rate between Arabidopsis ecotypes is correlated with cell division and A-type cyclin-dependent kinase activity. Plant Physiol. 129, 854-864 (2002).
  61. Kavanova, M., Lattanzi, F. A., Schnyder, H. Nitrogen deficiency inhibits leaf blade growth in Lolium perenne by increasing cell cycle duration and decreasing mitotic and post-mitotic growth rates. Plant Cell Environ. 31, 727-737 (2008).
  62. Macadam, J. W., Nelson, C. J. Secondary cell wall deposition causes radial growth of fibre cells in the maturation zone of elongating tall fescue leaf blades. Ann. Bot-London. 89, 89-96 (2002).
  63. Schnyder, H., Nelson, C. J. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .1. Spatial-Distribution of Growth, Deposition of Water, and Assimilate Import in the Elongation Zone. Plant Physiol. 86, 1070-1076 (1988).
  64. Gastal, F., Nelson, C. J. Nitrogen Use within the Growing Leaf Blade of Tall Fescue. Plant Physiol. 105, 191-197 (1994).
  65. Vanvolkenburgh, E., Boyer, J. S. Inhibitory Effects of Water Deficit on Maize Leaf Elongation. Plant Physiol. 77, 190-194 (1985).
  66. Silk, W. K., Hsiao, T. C., Diedenhofen, U., Matson, C. Spatial Distributions of Potassium, Solutes, and Their Deposition Rates in the Growth Zone of the Primary Corn Root. Plant Physiol. 82, 853-858 (1986).
  67. Meiri, A., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Deposition of Inorganic Nutrient Elements in Developing Leaves of Zea-Mays L. Plant Physiol. 99, 972-978 (1992).
  68. Neves-Piestun, B. G., Bernstein, N. Salinity-induced inhibition of leaf elongation in maize is not mediated by changes in cell wall acidification capacity. Plant Physiol. 125, 1419-1428 (2001).
  69. Bouchabke, O., Tardieu, F., Simonneau, T. Leaf growth and turgor in growing cells of maize (Zea mays L.) respond to evaporative demand under moderate irrigation but not in water-saturated soil. Plant Cell Environ. 29, 1138-1148 (2006).
  70. Westgate, M. E., Boyer, J. S. Transpiration-Induced and Growth-Induced Water Potentials in Maize. Plant Physiol. 74, 882-889 (1984).
  71. Horiguchi, G., Gonzalez, N., Beemster, G. T. S., Inze, D., Tsukaya, H. Impact of segmental chromosomal duplications on leaf size in the grandifolia-D mutants of Arabidopsis thaliana. Plant J. 60, 122-133 (2009).
  72. Fleury, D., et al. The Arabidopsis thaliana homolog of yeast BRE1 has a function in cell cycle regulation during early leaf and root growth. Plant Cell. 19, 417-432 (2007).
  73. Vlieghe, K., et al. The DP-E2F-like gene DEL1 controls the endocycle in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 15, 59-63 (2005).
  74. Boudolf, V., et al. The plant-specific cyclin-dependent kinase CDKB1;1 and transcription factor E2Fa-DPa control the balance of mitotically dividing and endoreduplicating cells in Arabidopsis. Plant Cell. 16, 2683-2692 (2004).
  75. Baskin, T. I., Beemster, G. T. S., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).

Tags

علم الأحياء النباتية، العدد 118، تحليل الحركية والنمو ورقة، أوراق monocotyledonous ووالذرة وانقسام الخلايا، وتوسيع الخلية، النسيج الإنشائي، وأخذ العينات الجزيئية
تحليل الحركية من انقسام الخلايا والتوسع: تحديد مقدار الأساس الخلوي للمناطق التنموية النمو وأخذ العينات في<em&gt; ذرة شامية</em&gt; أوراق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprangers, K., Avramova, V.,… More

Sprangers, K., Avramova, V., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves. J. Vis. Exp. (118), e54887, doi:10.3791/54887 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter