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Biology

कोशिका विभाजन और विस्तार के विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण: में विकास और नमूना विकास क्षेत्र के सेलुलर आधार बढ़ाता Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

विकास विश्लेषण है कि आमतौर पर संयंत्र के वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल किया जाता है जीनोटाइप चुना गया विकास मतभेद और / या पर्यावरणीय कारकों के प्ररूपी प्रतिक्रियाओं का वर्णन करने के लिए उपकरणों का एक सेट पर निर्भर करता है। वे पूरे संयंत्र के आकार और वजन माप या एक अंग है और विकास दर की गणना के विकास के अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए शामिल हैं। अंग विकास सेलुलर स्तर पर कोशिका विभाजन और विस्तार से निर्धारित होता है। इसलिए, इन दोनों प्रक्रियाओं के विकास में विश्लेषण की मात्रा का ठहराव सहित पूरे अंग विकास 1 में अंतर को समझने की कुंजी है। नतीजतन, यह सेलुलर विकास मानकों को गैर-विशेष प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है कि निर्धारित करने के लिए एक उचित कार्यप्रणाली के लिए महत्वपूर्ण है।

विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण पहले से ही एक दृष्टिकोण अंग विकास मॉडल 2 के विकास के लिए एक शक्तिशाली ढांचा उपलब्ध कराने के रूप में स्थापित कर दिया गया है। तकनीक रैखिक प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया गया है,ऐसे Arabidopsis thaliana जड़ों और monocotyledonous पत्तियों के रूप में, लेकिन यह भी इस तरह के द्विबीजपत्री पत्ते 3 के रूप में गैर रेखीय सिस्टम, के लिए। आजकल, इस पद्धति तेजी से अध्ययन करने के लिए कैसे आनुवंशिक, हार्मोनल, विकास के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और पर्यावरणीय कारकों कोशिका विभाजन और विभिन्न अंगों में विस्तार (तालिका 1) को प्रभावित करती है। इसके अलावा, यह भी एक रूपरेखा अपनी अंतर्निहित, जैव रासायनिक आणविक, और शारीरिक नियमों (तालिका 2) के लिए सेलुलर प्रक्रियाओं से जोड़ने के लिए प्रदान करता है, हालांकि सीमाओं तकनीक (जैसे, मेटाबोलाइट कि संयंत्र सामग्री की उच्च मात्रा की आवश्यकता के लिए अंग के आकार और स्थानिक संगठन द्वारा लगाया जा सकता है माप, प्रोटिओमिक्स, आदि)।

इस तरह के मक्का (Zea mays) पत्ती, के रूप में monocotyledonous पत्ते, रैखिक प्रणालियों जो कोशिकाओं सिरे की ओर पत्ती के आधार से स्थानांतरित करने का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमिक रूप से विभज्योतक और बढ़ाव क्षेत्र से गुजर परिपक्व तक पहुँचने के लिएक्षेत्र। यह यह विकास 4 के स्थानिक पैटर्न की मात्रात्मक अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाता है। इसके अलावा, मक्का पत्ते बड़े विकास क्षेत्र (विभज्योतक और बढ़ाव जोन कई सेंटीमीटर 5 फैले) और अन्य संगठनात्मक स्तर पर अध्ययन के लिए संभावनाओं प्रदान करते हैं। यह कोशिका विभाजन और विस्तार, आणविक तकनीक, शारीरिक माप, और कोशिका जीव विज्ञान के दृष्टिकोण (तालिका 2) की एक श्रृंखला के माध्यम से विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण द्वारा मात्रा को नियंत्रित (ख्यात) विनियामक तंत्र की जांच के लिए अनुमति देता है।

यहाँ, हम monocot पत्तियों में एक विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। सबसे पहले, हम कैसे पत्ती अक्ष के साथ स्थिति और कैसे विज्ञान सम्बन्धी मापदंडों की गणना करने के एक समारोह के रूप में दोनों कोशिका विभाजन और सेल बढ़ाव का एक उचित विश्लेषण का संचालन करने के लिए समझाना। दूसरे, हम यह भी पता चलता है कि यह कैसे नमूना डिजाइन के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम दो मामलों पर चर्चा: उच्च संकल्प नमूना एकडी ध्यान केंद्रित नमूने, सुधार डेटा व्याख्या और समय / पैसे की बचत, क्रमशः सक्षम करने से।

तालिका 1. विज्ञान सम्बन्धी का अवलोकन कोशिका विभाजन और विभिन्न अंगों में विस्तार की मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों का विश्लेषण करती है।

अंग संदर्भ
monocotyledonous पत्ते 16, 20, 21, 22
जड़ सुझावों 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
द्विबीजपत्री पत्ते 21, 30, 31
शिखर विभज्योतक गोली मार 32

तालिका 1. विज्ञान सम्बन्धी का अवलोकन कोशिका विभाजन और विभिन्न अंगों में विस्तार की मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों का विश्लेषण करती है।

तालिका 2 आण्विक स्तर पर उनके विनियमन के लिए विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण द्वारा मात्रा सेलुलर प्रक्रियाओं के बीच लिंक। विभिन्न प्रजातियों और अंगों में जैव रासायनिक और आणविक assays से परिणाम के लिए सेलुलर प्रक्रियाओं की मात्रा का ठहराव जोड़ने विभिन्न अध्ययनों के संदर्भ। Xyloglucan endotransglucosylase (XET), malondialdehyde (एमडीए), cyclin निर्भर kinases (CDK)। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

नोट: विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल स्थिर राज्य विकास के दौरान पत्तियों के लिए ही मान्य है। यह कई दिनों 6 की अवधि के दौरान एक स्थिर पत्ती बढ़ाव दर और सेल लंबाई और एक पत्ती में विस्तार के स्थानिक पैटर्न निकलता है।

1. पौधों की वृद्धि और पत्ता बढ़ाव दर की माप (LER)

  1. स्थिर राज्य के विकास में एक पत्ता और ब्याज की एक विकास मंच का चयन करें।
    नोट: स्थिर राज्य के विकास और दोहराव विकास है, जो एक ही धुरी पर लगातार पत्तियों पर समान स्थानिक पैटर्न का तात्पर्य के बीच एक अंतर है। अंकुर विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान, लगातार पत्ते आम तौर पर विकास जोन 7 के बढ़ते आकार के लिए तेजी से तेजी की वजह से बढ़ता है। कुछ उच्च पदों पत्ती एक समान विकास पैटर्न 8 हो सकता है हालांकि, यह एक क्षणिक चरण है कि जांच के तहत उपचार से प्रभावित हो सकता है। यह लाइनें और टीआर तुलना करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है सख्ती से ही पत्ता स्थिति पर eatments, भले ही यह एक अलग समय पर विकसित हो सकता है। यहां तक ​​कि एक निरंतर बढ़ाव दर पर, विकास दर प्रोफ़ाइल जरूरी विभिन्न विकासात्मक चरणों में ही नहीं है। इसलिए, यह एक ही विकास के चरण 8, आम तौर पर उभरने के बाद के दिनों की संख्या से परिभाषित पर पत्तियों का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. monocots में पत्ती विकास की एक पूरी विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण करने के लिए, एक विकास के कमरे में नियंत्रित परिस्थितियों में प्रत्येक उपचार और जीनोटाइप के लिए कम से कम 15 पौधों को विकसित।
  3. समय ब्याज की पत्ती प्रकट होता है (आसपास के पत्तों की वोर्ल से उद्भव) में, एक शासक के साथ दैनिक पत्ती की लंबाई मापने शुरू जब तक पत्ता पूरी तरह से विस्तार किया है (चित्रा 1 मैं)। पत्ता लंबाई पत्ती की टिप करने के लिए मिट्टी के स्तर से लंबाई निकलता है। तोड़ने या पत्ती को नुकसान नहीं सावधान रहें, क्योंकि यह अपने विकास को बदल सकता है।

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चित्रा 1:। मक्का की पत्तियों का एक विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण के योजनाबद्ध सिंहावलोकन ब्याज की पत्ती लगातार तीन दिनों पत्ता बढ़ाव दर (LER) की गणना करने के लिए एक शासक के साथ मापा जाता है। इसके बाद, पत्ता काटा जाता है और एक तीन सेंटीमीटर खंड विभज्योतक आकार का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस DAPI धुंधला के बाद सबसे बाहर का mitotic आंकड़ा करने के लिए आधार से लंबाई मापने के द्वारा किया जाता है। (ए) proliferative mitotic आंकड़े और (बी) के प्रारंभिक mitotic आंकड़े के उदाहरण हैं। मध्य शिरा के दूसरे पक्ष पर पत्ती आधार से पहले ग्यारह सेंटीमीटर सेल लंबाई मापन के लिए दस एक सेंटीमीटर खंडों में कटौती करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन मापों सेल लंबाई प्रोफ़ाइल, जो परिपक्व कोशिका लंबाई (एल मैट) और विभज्योतक (एल div) छोड़ने कोशिकाओं की लंबाई निर्धारित करने के लिए कार्य करता है बनाने के लिए आधार प्रदान करते हैं। एल चटाई, सेल उत्पादन दर (पी) की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि एल div और एल मेर विभज्योतक (एन मेर) में कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। बदले में, पी और एन मेर औसत कोशिका विभाजन दर (डी), जो कोशिका चक्र अवधि (टी सी) के उलटा है गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक ही रंग के तीर पैरामीटर है कि इन तीरों पर निम्न पैरामीटर गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं संकेत मिलता है। स्केल सलाखों = 40 माइक्रोन। रोमन संख्या प्रोटोकॉल में वर्णित विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का उल्लेख किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. कटाई

  1. ब्याज की विकास के चरण में (जैसे, तीसरे दिन उद्भव के बाद), कम से कम पांच प्रतिनिधि पी चुनेंबैच से lants जिस पर विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण का संचालन करने के लिए। पौधों के बाकी को मापने के रूप में 1.3 चरण में समझाया अंतिम पत्ती लंबाई निर्धारित करने के लिए आगे बढ़ें।
  2. संयंत्र के ऊपर जमीन हिस्सा कट। मेरिस्टेमेटिक हिस्सा बरकरार, संभव के रूप में बंद जड़ों को कटौती (चित्रा 1ii) रखने के लिए।
  3. बाहरी पत्तियों से शुरू, धीरे उन्हें एक एक करके unrolling से हटाने के सभी ब्याज की पत्ती अप करने के लिए छोड़ देता है। यदि आवश्यक हो, पत्तियों को अलग करने के लिए आधार से कुछ अतिरिक्त मिलीमीटर हटा दें। इसके अलावा ब्याज (चित्रा 1iii) की पत्ती से घिरा सर्वोच्च और छोटे पत्तियों को हटा दें।
  4. एक 3 सेमी खंड कट, मध्य शिरा के एक तरफ आधार से शुरू, और एक 1.5 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब 3 के साथ भर में स्टोर: 1 (वी: v) पूर्ण इथेनॉल: एसिटिक एसिड समाधान (चेतावनी: दस्ताने पहनते हैं) पर कई महीनों के लिए 24 घंटा तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1iv)। इस खंड बाद में विभज्योतक की लंबाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  5. वहाँ सेनस के दूसरी ओर, बेस से एक 11 सेमी खंड में कटौती (चित्रा 1 वी) और कम से कम 6 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण इथेनॉल के साथ भरा एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह पिगमेंट (चित्रा 1 vi) को हटा दें।
    नोट: बाद में, सेल लंबाई प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए (चर्चा देखने के लिए) केवल पहले 10 सेमी का उपयोग करें।
  6. कम से कम 24 घंटा (चित्रा 1vi) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सफाई के दूसरे दौर के लिए पूर्ण इथेनॉल नवीनीकृत।
  7. सफाई और भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए या आगे उपयोग (चित्रा 1vi) तक: अंत में, पूर्ण इथेनॉल शुद्ध लैक्टिक एसिड के साथ स्थानापन्न (दस्ताने पहनने चेतावनी)।

3. विभज्योतक लंबाई माप

  1. और 10 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane-हाइड्रोक्लोरिक एसिड (पीएच 7 Tris-एचसीएल): एक rinsing बफर 50 मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl), 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड युक्त तैयार (पहनने दस्ताने EDTA चेतावनी)।
  2. खंड 2.4 और इतने से 3 सेमी खंड लो20 मिनट (चित्रा 1vii) के लिए बफर में यह ak।
  3. इंतजार करते हुए, 1 माइक्रोग्राम / एमएल के एक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला समाधान तैयार करने के लिए, बर्फ पर है और अंधेरे में रखते हुए rinsing बफर का उपयोग करें।
  4. DAPI धुंधला समाधान में 2-5 मिनट के लिए विभज्योतक खंड रखकर नाभिक दाग। बर्फ पर और अंधेरे (चित्रा 1vii) में काम करते हैं।
  5. जल्दी से एक माइक्रोस्कोपी कांच पर खंड बढ़ते और एक गिलास को कवर के साथ इसे कवर द्वारा प्रतिदीप्ति संकेत के लिए जाँच करें। एपिडर्मल कोशिकाओं प्रतिदीप्ति दिखाना चाहिए, जबकि अंतर्निहित सेल परतों नहीं करना चाहिए।
  6. धुंधला हो जाना पर्याप्त नहीं है, तो कुछ अतिरिक्त मिनट के लिए DAPI धुंधला समाधान में वापस खंड डाल दिया।
  7. धुंधला रोकने के लिए, एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड और एक कवर गिलास के साथ कवर पर बफर rinsing की एक बूंद में खंडों माउंट।
  8. एक 20X बढ़ाई यूवी प्रतिदीप्ति से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग, 1000 के आसपास Epiderm के दृश्य के लिए अनुमति देता हैएक बार में अल कोशिकाओं। खंड भर में स्क्रॉल करें और proliferative mitotic आंकड़े (metaphase, anaphase, टीलोफ़ेज़, और cytokinesis) के लिए लग रही है, लेकिन विकासशील रंध्र (चित्रा 1viii) के प्रारंभिक कोशिका विभाजन से बचने 9। परिभाषित करें जहां सबसे बाहर का mitotic आंकड़ा स्थित है।
  9. पत्ती का आधार है और सबसे बाहर का एपिडर्मल mitotic चित्रा के बीच की दूरी को मापने के द्वारा विभज्योतक की लंबाई निर्धारित करते हैं। एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) का उपयोग करें छवि फ्रेम की पूरी लंबाई को मापने के लिए।
    1. फ्रेम कि (सबसे बाहर का mitotic आंकड़ा करने के लिए पत्ता आधार से) पूर्ण विभज्योतक लंबाई को कवर की संख्या की गणना और पूर्ण लंबाई विभज्योतक (चित्रा 1ix) प्राप्त करने के लिए एक फ्रेम की लंबाई से इस संख्या को गुणा।

4. सेल लंबाई प्रोफ़ाइल

  1. खंड है कि लैक्टिक एसिड (2.5 कदम) में संग्रहीत किया जाता है ले लो और बेंच पर ध्यान रखें। खंडों बुद्धि कटहा 1 सेमी प्रत्येक (चित्रा 1x) के 10 खंडों में छुरी।
  2. लैक्टिक एसिड की एक छोटी सी बूंद में एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर लगातार पत्ती खंडों माउंट। लगातार या तो adaxial या abaxial पक्ष का सामना करने के लिए सुनिश्चित करें। सिद्धांत रूप में, वहाँ एक विशेष पक्ष के लिए कोई वरीयता है।
  3. , क्षेत्रों का विश्लेषण करने की पत्ती आधार से शुरू करने के साथ अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। आदेश में लगातार एक ही सेल प्रकार का चयन करने के लिए एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उपाय फाइलें सीधे रंध्र संबंधी फाइल करने के लिए आसन्न में कम से कम 20 दोहराने एपिडर्मल कोशिकाओं की लंबाई।
    1. खंडों (खंड पर्याप्त प्रति 4 पदों) में से प्रत्येक के साथ समान रूप से स्थान दिया गया है पदों पर यह मत करो, और पत्ती (चित्रा 1xi) भर में प्रत्येक माप के लिए इसी स्थिति नीचे लिखने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. एक स्थानीय बहुपद समरेखण पी का उपयोग करके पत्ती अक्ष के साथ प्रत्येक मिमी औसत सेल लंबाई निर्धारितrocedure, एक आर-लिपि (; अनुपूरक फ़ाइल 1 चित्रा 1xii) में लागू किया है।
    नोट: आर-स्क्रिप्ट समरेखण में वृद्धि के साथ डेटा की एक श्रृंखला प्रदान करता है। आवश्यक राशि समरेखण के कुछ मनमाना है और आदर्श सिर्फ स्थानीय शोर को दूर करना चाहिए, लेकिन कुल मिलाकर वक्र को प्रभावित नहीं। एक प्रयोग के भीतर सभी नमूनों के लिए चौरसाई का एक ही राशि का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
  5. पौधों के बीच प्रत्येक स्थिति में सेल लंबाई औसत और पत्ती अक्ष के साथ एक सेल लंबाई प्रोफ़ाइल बनाने के लिए मानक त्रुटि की गणना।

5. विज्ञान सम्बन्धी मानकों की गणना (अनुपूरक फ़ाइल 2 देखें)

  1. (1.3 चरण में के रूप में जैसे, 24 घंटा,) लगातार दो समय बिंदुओं के बीच पत्ता लंबाई में परिवर्तन ले रही है और समय के अंतराल से विभाजित करके LER की गणना।
  2. विकास क्षेत्र (एल GZ) की अवधि की गणना के आधार से स्थिति बाहर करने के लिए इसी जहां कोशिकाओं को उनके परिपक्व सीई का 95% तक पहुँचsmoothened सेल लंबाई प्रोफ़ाइल पर डालूँगा लंबाई।
    1. स्थिति यह है कि (चित्रा 2) के बाद सभी सेल लंबाई की औसत से smoothened सेल लंबाई प्रोफ़ाइल 95% पर प्रत्येक स्थिति के लिए ले लो।
    2. smoothened सेल लंबाई (कदम 4.4) प्रत्येक स्थिति में गणना 95% सेल लंबाई के साथ तुलना करें। (; अनुपूरक डेटा 2 देखें चित्र 2) पत्ती के आधार से शुरू, विकास क्षेत्र की स्थिति जहां वास्तविक सेल लंबाई के बाद सेल लंबाई के 95% के बराबर होती है पर समाप्त होता है।

चित्र 2
चित्रा 2:। विकास क्षेत्र के अंत निर्धारण विभज्योतक: स्थिति एक लाल सितारा के साथ संकेत दिया है, वास्तविक सेल आकार छोटा 95% से इस स्थिति के बाद सभी कोशिकाओं की औसत सेल आकार की (लाल बिंदीदार रेखा) (लाल ठोस है लाइन)। विकास क्षेत्र (एल GZ के अंत; एबी के साथ संकेत दियालुए स्टार) स्थित है, जहां 95% (इस स्थिति (ठोस ब्लू लाइन के बाद सभी कोशिकाओं की औसत सेल आकार की ब्लू लाइन बिंदीदार)) वास्तविक सेल के आकार के बराबर है। डिवीजन क्षेत्र (डी), बढ़ाव क्षेत्र (ई), और परिपक्व क्षेत्र (एम)। धराशायी तीर स्थानीय आकार और पत्ती जब पत्ती की टिप करने के लिए बेसल पदों से चलती के बाहर का भाग में औसत आकार के 95% के बीच समानता का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. बढ़ाव क्षेत्र (एल एल) विकास क्षेत्र (एल GZ) और विभज्योतक आकार की लंबाई के बीच अंतर के रूप में की लंबाई की गणना (एल मेर, चरण 3 में निर्धारित)।
  2. परिपक्व कोशिका लंबाई (एल चटाई) परिपक्व क्षेत्र में औसत सेल लंबाई के रूप में गणना।
  3. प्राप्त करने के लिए एल चटाई द्वारा LER फूट डालोसेल उत्पादन दर (पी)।
  4. बढ़ाव क्षेत्र (एन एल) एन GZ और एन मेर बीच अंतर के रूप में कोशिकाओं की संख्या की गणना। विभज्योतक (एन मेर) में कोशिकाओं की संख्या अंतराल विभज्योतक करने के लिए इसी में स्थित कोशिकाओं की संचयी संख्या के बराबर होती है। विकास क्षेत्र (एन GZ) में कोशिकाओं की संख्या अंतराल विकास क्षेत्र के लिए इसी में स्थित कोशिकाओं की संचयी संख्या के बराबर होती है।
  5. औसत कोशिका विभाजन दर (डी) पी / एन मेर के रूप में गणना। सेल चक्र अवधि (टी सी) एल.एन. (2) / डी के बराबर होती है।
  6. P से एन एल विभाजित करके बढ़ाव क्षेत्र (टी एल) में समय की गणना। विभाजन के क्षेत्र में समय लॉग 2 (एन मेर) * टी सी के बराबर होती है। विभज्योतक छोड़ने कोशिकाओं की लंबाई (एल div)विभज्योतक के अंत में smoothened सेल लंबाई प्रोफ़ाइल से सेल लंबाई के बराबर होती है।
  7. एल.एन. (एल मैट) -ln (एल div)] / टी एल: औसत सेल विस्तार की दर (आर एल) सूत्र निम्न का उपयोग कर की गणना।

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Representative Results

यहाँ, हम अच्छी तरह से पौधों को पानी पिलाया (नियंत्रण, 54% मिट्टी पानी की सामग्री, (एसडब्ल्यूसी)) और पौधों उनकी पत्ती विकास के मामले में सूखे तनाव की स्थिति (सूखा, 34% एसडब्ल्यूसी) के अधीन के बीच एक तुलना दिखा। सभी पौधों डिग्री सेल्सियस दिन / रात, 300-400 μEm -2 सेकंड -1 photosynthetically सक्रिय विकिरण (PAR)। सूखे की स्थिति 25 डिग्री सेल्सियस / 18 नियंत्रित परिस्थितियों (16 घंटा दिन / रात के 8 घंटे के तहत एक विकास कक्ष में बड़े हो रहे थे, पानी रोक जब तक सही एसडब्ल्यूसी पहुँच गया था और फिर आगे बनाए रखा द्वारा स्थापित किए गए थे। एक प्रारंभिक अध्ययन में यह परिभाषित किया गया था कि पांचवें पत्ती पहले एक उभरने और इस तनाव शर्त के तहत विकसित करना है। इसलिए, यह की पत्ती के रूप में चुना गया था सूखे पर बल दिया पौधों की ब्याज। अंतिम पत्ता लंबाई (डालूँगा) 40% अच्छी तरह से पौधों को पानी पिलाया है, जो एक कम LER (3 टेबल) के कारण हुई थी में से एक से भी कम था। ए के के सेलुलर आधार को समझने के लिएएफ विकास प्रतिक्रिया, हम एक विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण किया। कुल मिलाकर, पत्ती बढ़ाव दर विभज्योतक और परिपक्व कोशिका का आकार बढ़ाव क्षेत्र में निर्धारित (चित्रा 3) में सेल के उत्पादन का एक समारोह है। इसलिए, पत्ती का छोटा इनमें से एक या मापदंडों के दोनों पर प्रभाव के कारण होना चाहिए। हमारे परिणाम बताते हैं कि जब परिपक्व कोशिका लंबाई (एल मैट) प्रभावित नहीं था, सेल उत्पादन दर (पी) 71% (3 टेबल) से कम हो गया था। एल चटाई कोशिकाओं विभज्योतक छोड़ने की लंबाई (एल div) पर निर्भर करता है , समय इन कोशिकाओं को बढ़ाव क्षेत्र (टी एल) में खर्च करते हैं, और रिश्तेदार सेल विस्तार की दर (आर एल)। कोई प्रभाव नहीं, एल div के लिए मनाया गया, जबकि आर एल सूखे की स्थिति में 67% की कमी थी। इस आशय की लगभग टी एल, जो एक ही एल चटाई के परिणामस्वरूप के तीन गुना से मुआवजा दिया गया था </ उप> नियंत्रण की स्थिति में है। सेल उत्पादन की दर में कमी थी, बारी में, दोनों एक कम औसत कोशिका विभाजन दर (डी) और विभज्योतक (एन मेर) में कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की वजह से। विभज्योतक (एल मेर) की लंबाई विकास क्षेत्र (एल GZ) है, जो काफी प्रभावित नहीं था की लंबाई के विपरीत में कम हो गया था। अंत में, इन परिणाम बताते हैं कि इस मामले में, सेल नंबर, सेल आकार के विपरीत, पत्ती आकार का निर्धारण करने में एक प्रमुख भूमिका थी।

विज्ञान सम्बन्धी मानकों को सी डी % परिवर्तन सीडी पी मूल्य
डालूँगा 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (मिमी / एच) 2.8 ± 0.1 0.8 ± 0.0 -73 0.000
एल चटाई (माइक्रोन) 140 ± 3 130 ± 6 -7 एन एस
पी (कोशिकाओं / एच) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
डी (कोशिकाओं · सेल -1 · मानव संसाधन -1) 0.028 ± 0.003 0.010 ± 0.001 -63 0.000
टी सी (मानव संसाधन) 26 ± 3 71 ± 7 173 0.000
टी div (मानव संसाधन) 249 ± 27 656 ± 71 164 0.000
एल मेर (मिमी) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0.010
एन मेर 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
आर एल (माइक्रोन · माइक्रोन -1) 0.043 ± 0.002 0.014 ± 0.001 -67 0.000
एल div (माइक्रोन) 24 ± 2 23 ± 2 -4 एन एस
टी एल (मानव संसाधन) 42 ± 2 125 ± 11 199 0.000
एन एल 844 ± 54 735 ± 65 -13 एन एस
एल जी Z (मिमी) 68 ± 1 61 ± 5 -1 1 एन एस
एन जी Z 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0.010

के पांचवें पत्ती के स्थिर राज्य विकास के दौरान कोशिकाओं के विभाजन और सेल विस्तार पर तालिका 3. विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण। अच्छी तरह से पौधों को पानी पिलाया और पौधों सूखे तनाव डेटा के अधीन (डालूँगा के लिए, एन = 5: N = 10) ± एसई औसत हैं। छात्र की टी परीक्षण एक सांख्यिकीय विश्लेषण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। पैरामीटर: विभाजन के क्षेत्र में पत्ती लंबाई (डालूँगा), पत्ती बढ़ाव दर (LER), परिपक्व कोशिका लंबाई (एल चटाई), सेल उत्पादन दर (पी), कोशिका विभाजन दर (डी), कोशिका चक्र की अवधि (टी सी), समय ( टी div), विभज्योतक की लंबाई (एल मेर), विभज्योतक (एन मेर में कोशिकाओं की संख्या), रिश्तेदार सेल बढ़ाव दर (आर एल), कोशिकाओं विभज्योतक (एल div छोड़कर) की लंबाई, बढ़ाव क्षेत्र में समय (टी एल), बढ़ाव क्षेत्र (एन एल), विकास क्षेत्र की लंबाई (एल GZ), विकास के क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या (एन GZ), अच्छी तरह से पानी पिलाया की स्थिति (सी), सूखा तनाव में कोशिकाओं की संख्या ( डी), एक घ महत्वपूर्ण नहीं (एन एस)।

चित्र तीन
चित्रा 3:। विज्ञान सम्बन्धी मापदंडों के बीच रिश्ता अंतिम पत्ती लंबाई (डालूँगा) पत्ता बढ़ाव दर (LER) है, जो बारी में सेल उत्पादन (पी) और परिपक्व कोशिका लंबाई (एल मैट) पर निर्भर करता है पर निर्भर करता है। विभज्योतक (एन मेर) में कोशिकाओं की संख्या और कोशिका विभाजन दर (डी) एक साथ, पी निर्धारित एक कोशिका चक्र की अवधि (टी सी) के साथ डी का विलोम के रूप में। बढ़ाव क्षेत्र (टी एल), विभज्योतक (एल div) छोड़ने कोशिकाओं की लंबाई, और रिश्तेदार सेल विस्तार की दर (आर एल) में समय है परिपक्व कोशिका लंबाई (एल मैट) का निर्धारण। बढ़ाव क्षेत्र (एन एल) में कोशिकाओं की संख्या।.jove.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अंग विकास का एक विस्तृत विश्लेषण के रूप में अपने आवेदन के अलावा, विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण पत्ती विकास क्षेत्र स्थानीयकरण का एक नक्शा प्रदान करता है और आणविक के लिए एक subzonal संकल्प के साथ नमूने की अनुमति देता है और जैव रासायनिक विश्लेषण 4,10,11। एक उदाहरण के रूप में, चित्रा -4 ए malondialdehyde (एमडीए) के रूप में ऊपर एक ही शर्तों के अधीन पौधों में मक्का पत्ती के विकास के क्षेत्र के साथ मात्रा का ठहराव से पता चलता है। एमडीए एक माध्यमिक मेटाबोलाइट आरओएस द्वारा लिपिड peroxidation के दौरान बनाई है और oxidative नुकसान 12 के स्तर को दर्शाता है। एमडीए पत्ती के हर सेंटीमीटर में मापा गया था, उसके आधार है, जो विकास को ढाल 11 के साथ एकाग्रता परिवर्तन का विश्लेषण अनुमति से शुरू। सूखे के उपचार के रूप में हुई 40% पत्ती छोटा करने, विकास के क्षेत्रों की लंबाई (Meriस्टेम, बढ़ाव क्षेत्र है, और परिपक्व क्षेत्र) नियंत्रण पौधों में एक ही क्षेत्रों में सूखे पर जोर दिया पौधों (चित्रा 4 बी) की लंबाई से मेल नहीं खाती। जैसा कि चित्र 4 बी में देखा, नियंत्रण पौधों में विभज्योतक लगभग 1.5 सेमी लंबा था, और बढ़ाव क्षेत्र पत्ती आधार से 1.5 6.8 सेमी से फैला। जोर देकर कहा कि पौधों में, विभज्योतक 0 1.1 सेमी और 1.1 6.1 सेमी से बढ़ाव क्षेत्र से स्थानीयकृत किया गया था। एमडीए के स्तर और पूरे विकास जोन नियंत्रण उपचार की तुलना में सूखा जोर दिया पौधों में बढ़ रहे थे। विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण की मदद से, हम निष्कर्ष निकाल सकता है कि एमडीए सामग्री विशेष रूप से दोनों नियंत्रण और सूखा उपचार के लिए परिपक्व क्षेत्र में वृद्धि की गई थी। विकास के क्षेत्रों के आकार जानने के बिना, हम उस निष्कर्ष निकालना होगा, सूखा तनाव के तहत, नियंत्रण पौधों में से एक पहले विकास के चरण में एमडीए सामग्री बढ़ जाती है, जो गलत होगा क्योंकि यह खाते में कारण जोनों के स्थानांतरण नहीं ले करता है टी करने के लिएवह पत्ती छोटा। इसलिए, जैव रासायनिक माप करने से पहले विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण प्रदर्शन के क्रम में सही ढंग से डेटा की व्याख्या करने में महत्वपूर्ण महत्व का था।

चित्रा 4
चित्रा 4: उच्च संकल्प जैव रासायनिक माप का उदाहरण और ध्यान केंद्रित विश्लेषण के लिए नमूने (ए) Malonaldehyde (एमडीए) पौधों की सांद्रता मक्का पत्ती विकास क्षेत्र (दस खंडों में विभाजित) के साथ मापा जाता उगाया में अच्छी तरह से पानी पिलाया हालत और पौधे सूखे के अधीन है। उपचार 10। डेटा ± एसई औसत हैं (एन = 5)। दो-तरफा एनोवा एक सांख्यिकीय विश्लेषण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और पी-मूल्यों ग्राफ पैनल (कारकों: सूखे (डी) और खंड (s)) के बगल में प्रस्तुत कर रहे हैं; परिवार कल्याण: ताजा वजन। (बी) के नियंत्रण और सूखा पर जोर दिया पौधों में विभिन्न विकास क्षेत्रों के दृश्य। डिवीजन क्षेत्र (डी), बढ़ाव क्षेत्र (ई), औरपरिपक्व जोन (एम)। प्रकोष्ठों 125 बार बढ़ाया जाता है। (सी) नियंत्रण और सूखा इलाज किया पौधों की कोशिका-लंबाई प्रोफ़ाइल। डेटा ± एसई औसत हैं (एन = 5)। (डी) दोनों नियंत्रण और सूखा इलाज के पौधों में केंद्रित नमूने में अंतर। नीले बक्से दोनों उपचार में ही विकास मंच तुलना करने के लिए नमूना स्थिति से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उच्च संकल्प पढ़ाई में ही विकास के क्षेत्रों की तुलना करने की संभावना प्रदान करने के अलावा, विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण भी अधिक ध्यान केंद्रित विश्लेषण करती है, जिसमें एक ही विकास के चरण में कोशिकाओं से युक्त विशिष्ट क्षेत्रों में से केवल नमूने ले रहे हैं के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हम सेल लंबाई प्रोफाइल, सूक्ष्म सेल लंबाई मापन के समरेखण द्वारा प्रदान की गई है, पहले दस ग में तुलनानियंत्रण और सूखा पर जोर दिया पौधों की पत्तियों के आधार से entimeters। चित्रा 4C पता चलता है कि, सेल लंबाई प्रोफ़ाइल का उपयोग कर, हम विकास के क्षेत्रों की लंबाई निर्धारित कर सकता है और यह भी दोनों नियंत्रण और सूखा पर जोर दिया पौधों में विकास दर गतिशीलता का पालन कर सकता है। इस विभज्योतक में कोशिकाओं proliferating के विशिष्ट नमूना अनुमति (भारी वृद्धि से पहले), बढ़ाव क्षेत्र में कोशिकाओं के विस्तार और परिपक्व क्षेत्र में युवा परिपक्व कोशिकाओं (पठार की शुरुआत) (भारी वृद्धि के बीच में)। हमारे परिणाम बताते हैं कि, सूखे के जवाब में पत्ती छोटा होने की वजह से इन क्षेत्रों के नियंत्रण में है और जोर दिया पौधों में अनुरूप नहीं था। आदेश, proliferating विस्तार हो रहा है, और नियंत्रण पौधों में युवा परिपक्व कोशिकाओं के नमूने के लिए, हम पहले, पांचवें, नौवें और पत्ती आधार से सेंटीमीटर, क्रमशः की जरूरत है। हालांकि, जोर दिया पौधों में, इन क्षेत्रों, पहले चौथे, आठवें और सेंटीमीटर करने के लिए क्रमश: अनुरूप हैं। और अधिक ध्यान केंद्रित की इस तरह कीनमूना इस तरह के शाही सेना अनुक्रमण, प्रोटिओमिक्स, metabolomics, आदि के रूप में, अधिक श्रमसाध्य महंगा है, या समय लेने के अध्ययन के मामले में उपयोगी साबित हो गया है

अनुपूरक फ़ाइल 1:। बहुपद समरेखण प्रक्रिया के लिए आर-स्क्रिप्ट कृपया सही इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 2:। विज्ञान सम्बन्धी मानकों के गणना कृपया सही इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

मक्का के पत्तों पर एक पूर्ण विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण पत्ती विकास के सेलुलर आधार के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है और कुशल नमूना रणनीति के डिजाइन के लिए अनुमति देता है। हालांकि प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, कुछ सावधानी निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम में सिफारिश की है: (1) यह विभज्योतक को नुकसान पहुँचाए बिना युवा, संलग्न पत्तियों (2.3 कदम) को अलग करने के बाद से, विभज्योतक लंबाई निर्धारण (चरण 3) महत्वपूर्ण है पूरी की आवश्यकता है विभज्योतक उपस्थित होने के लिए। कुछ अभ्यास पहले से जरूरत हो सकती है। (2) मेरिस्टेमेटिक लंबाई दृढ़ संकल्प mitotic आंकड़े की व्याख्या पर आधारित है। इसलिए, हम सलाह है कि, एक प्रयोग के भीतर, एक ही व्यक्ति इन मापों विचरण कम करने के लिए निष्पादक के कारण आयोजित करता है। (3) हालांकि केवल दस सेंटीमीटर वास्तविक सेल लंबाई मापन के लिए प्रयोग किया जाता है, यह ग्यारह सेंटीमीटर जब सेल लंबाई मापन (2.5 कदम) के लिए खंड कटाई शामिल करने के लिए है क्योंकि खंड के किनारे कोई महत्वपूर्ण हैटी हमेशा पूरी तरह से इथेनॉल और / या लैक्टिक एसिड में डूब। इसलिए, इस अतिरिक्त सेंटीमीटर विकास क्षेत्र के पहले दस सेंटीमीटर के समाशोधन है। (4) अंत में, यह सब विज्ञान सम्बन्धी मानकों के परिणाम का निरीक्षण करने पुष्टि करने के लिए कि वे सही हैं उपयोगी है। तालिका 3 में, उदाहरण के लिए, सेल उत्पादन दर (पी) सूखा जोर दिया पौधों की 71% से दूसरे शब्दों में कमी आई थी, या, पी पी सूखे नियंत्रण से 0.29 है। और विभज्योतक में कोशिकाओं की संख्या (एन मेर; -20% चित्रा 3), के बाद से कोशिकाओं के उत्पादन पर औसत कोशिका विभाजन दर (-63% d) निर्भर करता है, निम्नलिखित को मान्य करने के लिए उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: पी (0.29) ≈ एन मेर (0.8) एक्स डी (0.37)। एक ही LER = पी एक्स मैं चटाई के लिए लागू किया जा सकता है।

उपलब्ध सुविधाओं पर निर्भर करता है, प्रोटोकॉल कुछ चरणों में संशोधित किया जा सकता है। (1) एक और अधिक एकदैनिक मैनुअल पत्ती लंबाई माप (1.3 चरण) के लिए dvanced विकल्प पर रेखीय वेग विस्थापन transducers (LVDTs) 13 आधारित है। इसका लाभ यह है कि यह एक बहुत अधिक समय संकल्प पर माप सक्षम बनाता है, मिनट से सेकंड को लेकर है। (2) यह नमूने के दौरान पूर्ण विकास क्षेत्र में शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, पर्यावरण की स्थिति, जीनोटाइप, प्रजातियों, और विकास मंच की जांच की विकास क्षेत्र की लंबाई को बदल सकता है। इसलिए, यह अपने प्रयोग के उपचार के जवाब में विकास क्षेत्र की लंबाई के लिए पहली बार एक अनुमान बनाने के लिए उपयोगी है। इस प्रोटोकॉल जन्मजात लाइन B73 25 डिग्री सेल्सियस से बढ़ी पर आधारित है / 18 डिग्री सेल्सियस (दिन / रात) 300-400 μEm -2 एस -1 (संश्लेषक एक्टिव विकिरण - PAR)। (3) के क्रम में प्रतिदीप्ति का उपयोग किए बिना mitotic आंकड़े (कदम 3.8) कल्पना करने के लिए, एक Fuelgen दाग 14 आवेदन किया जा सकता है। (4) के आंकड़ों के समरेखण भी एक पांच सूत्री योग्यता के रूप में उपयोग करके एमएस एक्सेल के बजाय आर में किया जा सकता है"LINEST" समारोह 15 के साथ dratic फिटिंग।

इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि पूरे विकास क्षेत्र स्थिर राज्य के विकास के दौरान काटा जा करने की जरूरत है। आदेश में स्थिर राज्य विकास को सुनिश्चित करने के लिए, पौधों आदर्श रूप में, नियंत्रित विकास की स्थिति के अधीन हो जाना चाहिए, क्योंकि प्रकाश की तीव्रता, तापमान, आर्द्रता या में उतार-चढ़ाव का पत्ता बढ़ाव दर 16 प्रभावित करते हैं। इस कारण से, विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण कम क्षेत्र की स्थिति के तहत बड़े पौधों के लिए अनुकूल है। एक और दोष यह है कि पत्तियों में उभरा है, जो यह असंभव पत्ते कि अभी भी पुराने पत्तों से घिरा रहे हैं जांच करने के लिए करता है की जरूरत है। अंत में, प्रोटोकॉल में कम से कम कुछ सेंटीमीटर शामिल बड़ी वृद्धि क्षेत्रों के साथ monocotyledonous प्रजाति के लिए अनुकूल है। छोटे monocots (जैसे, Poa, चावल) पर एक विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण, हालांकि, संभव है, लेकिन नमूना तैयार 17,18 में कुछ संशोधनों की जरूरत है।

एक और बार बार उपयोगडी दृष्टिकोण अंतर विकास phenotypes का विश्लेषण करने के लिए शास्त्रीय विकास विश्लेषण है। इस विश्लेषण पूरे संयंत्र रिश्तेदार वृद्धि दर quantifies और एक नया संश्लेषक क्षेत्र में और संयंत्र 19 के अन्य भागों में संश्लेषक निकाली गई कार्बन की अंतर्निहित आवंटन निर्धारित करता है। विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण, हालांकि, अंतर्निहित सेलुलर प्रक्रियाओं है कि कोशिकाओं के विभाजन और विस्तार बढ़ाता के आधार पर विकास phenotypes करने के लिए मिलकर कर रहे हैं की एक अधिक विस्तृत समझ के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रत्येक संभावना विकास क्षेत्र की लंबाई निर्धारित करने के लिए विशेष विकास मंच है कि अध्ययन के तहत उपचार से प्रभावित है पत्ती अक्ष के साथ आणविक माप के संबंध के लिए अनुमति देता है। इस डेटा की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है। जब समय या बजट या जब विशिष्ट विकास के चरणों में रुचि में सीमित, इस विश्लेषण के परिणाम को विश्लेषण के लिए आवश्यक नमूनों की संख्या को कम करने, ध्यान केंद्रित नमूना लेने के लिए अनुमति देता है। अंत में, विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण कर सकेंपत्ती विकास में तनाव प्रतिक्रियाओं और आनुवंशिक परिवर्तन अंतर्निहित सेलुलर मापदंडों का निर्धारण है और नियामक प्रक्रियाओं (तालिका 2) नदी के ऊपर करने के लिए उन्हें लिंक कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम के लिए वीए एंटवर्प विश्वविद्यालय से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; फ्लेमिश विज्ञान फाउंडेशन (FWO, 11ZI916N) केएस करने से पीएचडी फैलोशिप; FWO (G0D0514N) से परियोजना अनुदान; एक ठोस अनुसंधान गतिविधियों (गोवा) अनुसंधान अनुदान, एंटवर्प विश्वविद्यालय के अनुसंधान परिषद से "पत्ता Morphogenesis का एक सिस्टम्स बायोलॉजी दृष्टिकोण"; और Interuniversity आकर्षण डंडे (IUAP सातवीं / 29, मंगल), GTSB हान Asard, Bulelani एल Sizani और Hamada AbdElgawad को बेल्जियम के संघीय विज्ञान नीति कार्यालय (BELSPO) से "मक्का और Arabidopsis रूट और विकास को गोली मार" सभी वीडियो के लिए योगदान दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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कोशिका विभाजन और विस्तार के विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण: में विकास और नमूना विकास क्षेत्र के सेलुलर आधार बढ़ाता<em&gt; Zea mays</em&gt; पत्तियां
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Sprangers, K., Avramova, V.,… More

Sprangers, K., Avramova, V., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves. J. Vis. Exp. (118), e54887, doi:10.3791/54887 (2016).

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