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Cinématique Analyse de la division cellulaire et Expansion: Quantifier la base cellulaire de la croissance et du développement d'échantillonnage Zones dans Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

Analyse de la croissance dépend d'un ensemble d'outils qui sont couramment utilisés par les scientifiques de plantes pour décrire le génotype déterminé les différences de croissance et / ou des réponses phénotypiques à des facteurs environnementaux. Ils comprennent la taille et le poids des mesures de la plante entière ou un organe et les calculs des taux de croissance à explorer les mécanismes sous-jacents de la croissance. Croissance organique est déterminée par la division cellulaire et de l'expansion au niveau cellulaire. Par conséquent, incluant la quantification de ces deux procédés dans des analyses de croissance est essentiel pour comprendre les différences de croissance organe entier 1. Par conséquent, il est crucial d'avoir une méthodologie appropriée pour déterminer les paramètres de croissance cellulaire qui est relativement facile à utiliser par des laboratoires non spécialisés.

L' analyse cinématique a déjà été établie comme une approche fournissant un cadre puissant pour le développement de modèles de croissance de l' organe 2. La technique a été optimisé pour les systèmes linéaires,tels que les racines d' Arabidopsis thaliana et les feuilles monocotylédones, mais également pour les systèmes non-linéaires, tels que les feuilles dicotylédone 3. De nos jours, cette méthodologie est de plus en plus utilisée pour étudier comment génétiques, hormonaux, développementaux et les facteurs environnementaux influencent la division cellulaire et l' expansion dans divers organes (tableau 1). En outre, il fournit également un cadre pour lier les processus cellulaires à leurs règlements biochimiques, moléculaires et physiologiques sous - jacents (tableau 2), bien que les limites peuvent être imposées par la taille des organes et de l' organisation spatiale des techniques qui nécessitent des quantités plus élevées de matières végétales (par exemple, métabolite mesures, de la protéomique, etc.).

Feuilles monocotylédones telles que le maïs (Zea mays) feuille, représentent des systèmes linéaires dans lesquels les cellules se déplacent à partir de la base de la feuille vers la pointe, en passant successivement à travers la zone de méristèmes et de l' allongement pour atteindre la maturitézone. Cela en fait un système de modèle idéal pour les études quantitatives de la configuration spatiale de la croissance 4. De plus, les feuilles de maïs ont de grandes zones de croissance (méristème et zone d'allongement couvrant plusieurs centimètres 5) et offrent des possibilités d'études à d' autres niveaux d' organisation. Cela permet de l'enquête sur les mécanismes de régulation (putatifs) contrôlant la division cellulaire et de l' expansion, quantifiée par analyse cinématique grâce à une gamme de techniques moléculaires, des mesures physiologiques, et des approches de biologie cellulaire (tableau 2).

Ici, nous fournissons un protocole pour effectuer une analyse cinématique dans les feuilles monocotylédones. Tout d'abord, nous expliquons comment procéder à une analyse appropriée à la fois la division cellulaire et l'élongation des cellules en fonction de la position le long de l'axe de la feuille et la façon de calculer les paramètres cinématiques. Deuxièmement, nous montrons aussi comment cela peut être utilisé comme base pour la conception d'échantillonnage. Ici, nous discutons deux cas: haute résolution d'échantillonnage d'und axée échantillonnage, permettant une meilleure interprétation des données et le gain de temps / argent, respectivement.

Tableau 1. Aperçu des analyses cinématique des méthodes de quantification de la division cellulaire et de l' expansion dans divers organes.

organe référence
feuilles monocotylédones 16, 20, 21, 22
pointes des racines 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
feuilles dicotylédones 21, 30, 31
méristème apical 32

Tableau 1. Aperçu des analyses cinématique des méthodes de quantification de la division cellulaire et de l' expansion dans divers organes.

Tableau 2. Lien entre les processus cellulaires quantifiés par l'analyse cinématique à leur régulation au niveau moléculaire. Les références à diverses études reliant la quantification des processus cellulaires aux résultats des tests biochimiques et moléculaires chez diverses espèces et des organes. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdéhyde (MDA), les kinases cycline-dépendantes (CDK). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

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Protocol

NOTE: Le protocole suivant pour l'analyse cinématique est valable uniquement pour les feuilles pendant la croissance à l'état stable. Cela implique un taux d'allongement de la feuille stable et la répartition spatiale de la longueur de la cellule et à l' expansion d'une feuille au cours d' une période de plusieurs jours à 6.

1. Croissance des plantes et des mesures de feuilles Allongement Rate (LER)

  1. Choisissez une feuille en croissance stable et un stade de développement d'intérêt.
    NOTE: Il y a une différence entre la croissance à l'état stable et la croissance répétitive, ce qui implique des modèles spatiaux similaires sur les feuilles successives sur le même axe. Pendant les premiers stades de la croissance des semis, les feuilles successives croissent généralement plus rapidement en raison de la taille croissante de la zone de croissance 7. Bien que quelques positions des feuilles supérieures peuvent avoir un modèle de croissance similaire 8, ceci est une phase transitoire qui peut être affectée par les traitements à l'étude. Il est donc important de comparer les lignes et tr eatments strictement sur la même position de la feuille, même si elle peut se développer à un autre moment. Même à un taux d'allongement constant, le profil de taux de croissance ne sont pas nécessairement identiques à différents stades de développement. Par conséquent, il est important d'analyser les feuilles au même stade de développement 8, typiquement défini par le nombre de jours après la levée.
  2. Pour effectuer une analyse cinématique complète de la croissance des feuilles de monocotylédones, croître au moins 15 plantes pour chaque traitement et le génotype dans des conditions contrôlées dans une chambre de croissance.
  3. Au moment où la feuille d'intérêt apparaît (sortie de la volute de feuilles avoisinantes), commencer à mesurer la longueur de la feuille par jour avec une règle jusqu'à ce que la lame est complètement déployée (figure 1i). Longueur de la feuille implique la longueur à partir du niveau du sol à la pointe de la feuille. Veillez à ne pas casser ou d'endommager la feuille, car cela pourrait modifier sa croissance.

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Figure 1:. Aperçu schématique d'une analyse cinématique des feuilles de maïs La feuille d'intérêt est mesuré avec une règle pendant trois jours consécutifs pour calculer le taux Allongement Leaf (LER). Ensuite, la feuille est récoltée et un segment de trois centimètres est utilisée pour la détermination de la taille du méristème. Cela se fait en mesurant la longueur de la base jusqu'à mitotique chiffre le plus distal après coloration DAPI. (A) Exemples de figures de mitose prolifératives et (B) figures mitotiques formatives. Les onze premiers centimètres de la base de la feuille de l'autre côté de la nervure centrale sont utilisés pour couper dix segments d'un centimètre pour les mesures de longueur de la cellule. Ces mesures fournissent la base pour la création du profil de la longueur de la cellule, qui sert à déterminer la longueur des cellules matures (l mat) et la longueur des cellules en laissant le méristème (l div). le l tapis sont utilisés pour calculer le taux de production de cellules (P), tandis que l div et L mer sont utilisés pour calculer le nombre de cellules dans le méristème (N mer). À son tour, P et N mer sont utilisées pour calculer le taux moyen de division de cellule (D), qui est l'inverse de la durée du cycle cellulaire (T c). Les flèches de la même couleur indiquent des paramètres qui sont utilisés pour calculer le paramètre suivant sur ces flèches. Les barres d'échelle = 40 pm. Les chiffres romains sont utilisés pour se référer à des procédures expérimentales spécifiques décrites dans le protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. La récolte

  1. Au stade de développement d'intérêt (par exemple, le troisième jour après la levée), choisir au moins cinq p représentantlants du lot sur lequel pour effectuer l'analyse cinématique. Continuer à mesurer le reste des plantes, comme expliqué dans l'étape 1.3 pour déterminer la longueur finale de la feuille.
  2. Couper la partie de la plante au sol ci-dessus. Pour garder la partie méristème intact, couper le plus près possible des racines (Figure 1ii).
  3. A partir des feuilles extérieures, retirez toutes les feuilles jusqu'à la feuille d'intérêt en les déroulage doucement un par un. Si nécessaire, retirez quelques millimètres supplémentaires de la base de détacher les feuilles. Également supprimer les feuilles apex petites et fermées par la feuille d'intérêt (Figure 1iii).
  4. Couper un segment de 3 cm, à partir de la base sur un côté de la nervure centrale, et le stocker dans un tube de 1,5 ml d'essai rempli de 3: 1 (v: v) d'éthanol absolu: solution d'acide acétique (ATTENTION: porter des gants) à 4 ° C pendant 24 heures jusqu'à plusieurs mois (figure 1iv). Ce segment sera utilisée ultérieurement pour déterminer la longueur du méristème.
  5. Duautre côté de la veine, couper un segment de 11 cm à partir de la base (Figure 1 v) et le placer dans un tube de 15 ml rempli d'éthanol absolu à 4 ° C pendant au moins 6 heures pour éliminer les pigments (figure 1 vi).
    NOTE: Plus tard, utilisez uniquement les 10 premiers cm pour déterminer le profil de longueur de la cellule (voir Discussion).
  6. Renouveler l'éthanol absolu pour un autre tour de nettoyage à 4 ° C pendant au moins 24 heures (Figure 1VI).
  7. Enfin, remplacer l'éthanol absolu avec de l' acide lactique pur (ATTENTION: porter des gants) pour le nettoyage et le stockage à 4 ° C pendant 24 h ou jusqu'à utilisation ultérieure (Figure 1VI).

3. méristèmes mesures de longueur

  1. Préparer un tampon de rinçage contenant du chlorure de sodium 50 mM (NaCl), 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA; ATTENTION: porter des gants) et Tris 10 mM (hydroxyméthyl) aminométhane-chlorhydrique (TRIS-HCl, pH 7).
  2. Prenez le segment de 3 cm de la section 2.4 et ainsiak dans le tampon pendant 20 minutes (Figure 1vii).
  3. En attendant, utilisez le tampon de rinçage pour préparer une solution à 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration de 1 pg / ml, en le maintenant sur la glace et dans l'obscurité.
  4. Colorer les noyaux en plaçant le segment de méristème pour 2-5 minutes dans la solution de coloration DAPI. Les travaux sur la glace et dans l'obscurité (Figure 1vii).
  5. Vérifiez signal de fluorescence par le montage rapide du segment sur un verre de microscopie et en le recouvrant avec un verre de couverture. Les cellules épidermiques devraient montrer la fluorescence, tandis que les couches cellulaires sous-jacents ne devrait pas.
  6. Si la coloration ne suffit pas, mettez le segment de retour dans la solution de coloration DAPI pendant quelques minutes supplémentaires.
  7. Pour arrêter la coloration, monter les segments dans une goutte de rinçage tampon sur une lame de microscope et le couvercle avec un couvercle en verre.
  8. Utiliser un microscope équipé d'UV-fluorescence à un grossissement de 20X, ce qui permet la visualisation de l'ordre de 1000 epidermecellules al à la fois. Faites défiler à travers le segment et rechercher des chiffres prolifératives mitose (métaphase, anaphase, télophase et cytocinèse), mais il faut éviter la division cellulaire formative du développement stomates (Figure 1viii) 9. Définir où la figure la plus distale mitotique est situé.
  9. Déterminer la longueur du méristème, en mesurant la distance entre la base de la feuille et la plus distale mitotique épidermique figure. Utilisez un logiciel d'analyse d' image (par exemple, ImageJ) pour mesurer la longueur de la trame d'image.
    1. Comptez le nombre de cadres qui couvrent la longueur du méristème complète ( à partir de la base de la feuille à la figure la plus distale mitotique) et multiplier ce nombre par la longueur d'une trame pour obtenir la longueur de méristèmes complète (Figure 1ix).

Longueur 4. Cellule Profil

  1. Prenez le segment qui est stocké dans l'acide lactique (étape 2.5) et placez-le soigneusement sur le banc. Couper les segments d'espritha scalpel en 10 segments de 1 cm chacune (Figure 1x).
  2. Monter les segments de feuilles successifs sur une lame de microscope dans une petite goutte d'acide lactique. Assurez-vous de toujours faire face soit le adaxial ou abaxial vers le haut. En principe, il n'y a pas de préférence pour un côté particulier.
  3. Utiliser un microscope équipé contraste interférentiel différentiel (DIC) optique pour analyser les segments, à partir de la base des feuilles. Mesurer avec un logiciel d'analyse d'image de la longueur d'au moins 20 cellules épidermiques répliquée dans des fichiers directement adjacents aux fichiers stomates afin de sélectionner systématiquement le même type de cellule.
    1. Pour ce faire , à des positions également espacées le long de chacun des segments (4 positions par segment suffisent), et assurez - vous d'écrire la position correspondante pour chaque mesure tout au long de la feuille (Figure 1xi).
  4. Déterminer la longueur moyenne des cellules à chaque mm le long de l'axe de la feuille en utilisant un lissage polynomial local procédure, mis en œuvre dans un R script (Figure 1xii; Fichier supplémentaire 1).
    NOTE: Le R-script fournit une série de données avec l'augmentation de lissage. La quantité de lissage nécessaire est quelque peu arbitraire et, idéalement, devrait tout simplement retirer le bruit local, mais pas d'incidence sur la courbe globale. Assurez-vous d'utiliser la même quantité de lissage pour tous les échantillons dans une seule expérience.
  5. La moyenne de la longueur de la cellule au niveau de chaque position entre les plantes et de calculer l'erreur standard pour créer un profil de longueur de cellule le long de l'axe de la feuille.

5. Calculs de Kinematic paramètres (voir fichier complémentaire 2)

  1. Calculer le LER en prenant la variation de la longueur de la feuille entre deux points de temps successifs (par exemple 24 heures, comme à l' étape 1.3) et en divisant par l'intervalle de temps.
  2. Calculer la longueur de la zone de croissance (L gz) correspondant à la position distale par rapport à la base où les cellules atteignent 95% de leur maturité thisll longueur du profil de la longueur des cellules lissée.
    1. Prendre pour chaque position sur le profil lissée de la longueur des cellules 95% de la moyenne de toutes les longueurs cellulaires suivantes cette position (figure 2).
    2. Comparer la longueur de la cellule lissées (étape 4.4) avec la longueur de la cellule 95%, calculée à chaque position. À partir de la base de la feuille, la zone de croissance se termine à la position dans laquelle la longueur de la cellule réelle est égale à 95% de la longueur des cellules suivantes (figure 2; voir les données supplémentaires 2).

Figure 2
Figure 2:. Détermination de la fin de la zone de croissance méristème: A la position indiquée par une étoile, la taille réelle de la cellule est inférieure à 95% (ligne rouge en pointillés) de la taille moyenne des cellules de toutes les cellules qui suivent cette position (solide rouge ligne). La fin de la zone de croissance (L gz, indiqué abstar Lue) est situé à 95% (ligne bleue en pointillés) de la taille moyenne des cellules de toutes les cellules suivantes de cette position (ligne bleue) est égale à la taille réelle de la cellule. zone de division (D), zone d'allongement (E), et la zone mature (M). Flèches pointillées indiquent la convergence entre la taille locale et 95% de la taille moyenne sur la partie distale de la feuille lors du passage de la position de base à la pointe de la feuille. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Calculer la longueur de la zone d'allongement (L EL) comme étant la différence entre la longueur de la zone de croissance (L gz) et la taille du méristème (L mer, déterminée à l' étape 3).
  2. Calculer la longueur de la cellule mature (l mat) que la longueur moyenne des cellules dans la zone mature.
  3. Diviser le LER par l mat pour obtenir lele taux de production de cellules (P).
  4. Calculer le nombre de cellules dans la zone d'allongement (N el) comme la différence entre N et N gz mer. Le nombre de cellules dans le méristème (N FPE) est égal au nombre total de cellules situées dans les intervalles correspondant au méristème. Le nombre de cellules dans la zone de croissance (N gz) est égal au nombre total de cellules situées dans les intervalles correspondant à la zone de croissance.
  5. Calculer le taux de division cellulaire moyenne (D) P / N mer. La durée du cycle cellulaire (T c) est égale à ln (2) / D.
  6. Calculer le temps dans la zone d'allongement (T el) en divisant N el par P. Le temps dans la zone de division est égal à log 2 (N mer) * T c. La longueur des cellules en laissant le méristème (l div)est égale à la longueur de la cellule du profil de la longueur de la cellule lissée à la fin de méristème.
  7. Calculer le taux moyen d'expansion cellulaire (R el) en utilisant la formule suivante: ln (l mat) -ln (l div)] / T el.

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Representative Results

Ici, nous montrons une comparaison entre les plantes bien arrosées (contrôle, 54% la teneur en eau du sol, (CFC)) et les plantes soumises à des conditions de stress de la sécheresse (sécheresse, 34% SWC) en termes de croissance des feuilles. Toutes les plantes ont été cultivées dans une chambre de croissance dans des conditions contrôlées (16 h jour / 8 h nuit, 25 ° C / 18 ° C jour / nuit, 300-400 μEm -2 s -1 rayonnement photosynthétiquement actif (PAR). Les conditions de sécheresse ont été établies en retenant l'eau jusqu'à ce que le bon SWC a été atteint et ensuite encore maintenue. Dans une étude préliminaire, il a été défini que la cinquième feuille est le premier à émerger et se développer sous cette condition de stress. En conséquence, il a été choisi comme la feuille de intérêt. la longueur de la feuille finale (LL) des plantes à la sécheresse a souligné était de 40% inférieur à celui des plantes bien arrosées, ce qui était dû à un LER inférieur (tableau 3). pour comprendre la base cellulaire de l'Icaf réponse de croissance, nous avons effectué une analyse cinétique. Globalement, le taux d'allongement des feuilles est une fonction de production de cellules dans le méristème et la taille des cellules matures déterminée dans la zone d'allongement (figure 3). Par conséquent, le raccourcissement de la feuille doit être due à des effets sur l'une ou l'autre de ces paramètres. Nos résultats montrent que si la longueur des cellules matures (l mat) n'a pas été affectée, le taux de production de cellules (P) a été réduit de 71% (tableau 3). L mat dépend de la longueur des cellules en laissant le méristème (l div) le temps de ces cellules passent dans la zone d'allongement (T el) et le taux d'expansion de la cellule relative (R el). Aucun effet n'a été observé pour l div, tandis que R el a été réduite de 67% dans les conditions de sécheresse. Cet effet a été compensé par la quasi triplement de T el, qui a abouti à la même l mat </ Sub> comme dans les conditions de contrôle. La diminution du taux de production de cellules a été, à son tour, provoquée à la fois par un taux plus faible moyenne des cellules de division (D) et un plus petit nombre de cellules dans le méristème (N - mère). Longueur du méristème (L - mère) a été réduit en contraste avec la longueur de la zone de croissance (L gz), qui n'a pas été affectée de manière significative. En conclusion, ces résultats montrent que, dans ce cas, le nombre de cellules, contrairement à la taille des cellules, a un rôle majeur dans la détermination de la taille des feuilles.

paramètres cinématiques C ré % Variation CD p-valeur
LL 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (mm / h) 2,8 ± 0,1 0,8 ± 0,0 -73 0.000
l mat (pm) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
P (cellules / h) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (cellules · cellule -1 · h -1) 0,028 ± 0,003 0,010 ± 0,001 -63 0.000
T c (h) 26 ± 3 71 ± 7 +173 0.000
T div (hr) 249 ± 27 656 ± 71 +164 0.000
L mer (mm) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0,010
N mer 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R el (um um · -1) 0,043 ± 0,002 0,014 ± 0,001 -67 0.000
l div (pm) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
T el (hr) 42 ± 2 125 ± 11 +199 0.000
N el 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L g z (mm) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N g z 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0,010

Tableau 3. Analyse Cinématique sur la division cellulaire et l' expansion des cellules au cours de la croissance stable de la cinquième feuille. les plantes et les plantes bien arrosées soumises à stress hydrique données sont des moyennes ± SE (n = 5, pour LL: n = 10). Le test t de Student a été utilisé comme une analyse statistique. Paramètres: longueur de la feuille (LL), taux d'allongement de la feuille (LER), la longueur de la cellule mature (l mat), taux de production de cellules (P), taux de division cellulaire (D), la durée du cycle cellulaire (T c), le temps dans la zone de division ( T div), la longueur du méristème (l - mère), le nombre de cellules dans le méristème (N - mère), le taux d'élongation cellulaire relatif (R el), de la longueur des cellules en laissant le méristème (l div), le temps dans la zone d'élongation (T el), le nombre de cellules dans la zone d'allongement (N el), longueur de la zone de croissance (l gz), le nombre de cellules dans la zone de croissance (N gz), conditions bien arrosées (C), le stress de la sécheresse ( D), un D non significative (NS).

Figure 3
Figure 3:. Relation entre les paramètres cinématiques La dernière longueur de la feuille (LL) dépend de la Allongement Taux Leaf (LER), qui à son tour dépend de la production de cellules (P) et de la longueur de la cellule mature (l mat). Le nombre de cellules dans le méristème (N - mère) et le taux de division cellulaire (D) déterminent ensemble P, avec une durée de cycle cellulaire (T c) comme étant l'inverse de la D. Temps dans la zone d'allongement (T el), de la longueur des cellules en laissant le méristème (l div), et le taux d'expansion des cellules par rapport (R el) déterminer la longueur des cellules matures (l mat). Le nombre de cellules dans la zone d'allongement (N el)..jove.com / fichiers / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

En plus de son application comme une analyse détaillée de la croissance des organes, l' analyse cinématique fournit une carte de la croissance des feuilles zone de localisation et permet un échantillonnage avec une résolution subzonal pour moléculaire et biochimique analyses 4,10,11. A titre d'exemple, la figure 4A montre le malondialdéhyde (MDA) , la quantification le long de la zone de croissance de la feuille de maïs dans les plantes soumises aux mêmes conditions que ci - dessus. MDA est un métabolite secondaire formé au cours de la peroxydation des lipides par les ROS et reflète les niveaux de dommages oxydatifs 12. MDA a été mesurée dans chaque centimètre de la feuille, à partir de sa base, ce qui a permis l' analyse des changements de concentration le long du gradient de croissance 11. Le traitement de la sécheresse a provoqué 40% de matière grasse de la feuille, la longueur des zones de développement (meritige, zone d'allongement, et la zone mature) dans les usines de contrôle ne correspondent pas à la longueur des mêmes zones dans la sécheresse des plantes souligné (figure 4B). Comme on le voit sur la figure 4B, le méristème des plantes témoins était d' environ 1,5 cm de long, et la zone d'allongement enjambé de 1,5 à 6,8 cm de la base de la feuille. Dans les plantes stressées, le méristème est localisé de 0 à 1,1 cm, et la zone d'allongement de 1,1 à 6,1 cm. Les taux de MDA et de la zone de croissance de l'ensemble ont été augmentés chez les plantes à la sécheresse stressées par rapport au traitement témoin. Avec l'aide de l'analyse cinématique, nous pourrions conclure que le contenu MDA a été particulièrement augmenté dans la zone mature pour les deux traitements de contrôle et de la sécheresse. Sans connaître les tailles des zones de développement, nous pouvons conclure que, sous le stress de la sécheresse, le contenu augmente MDA dans un stade de développement plus tôt que dans les plantes témoins, ce qui serait mauvais car il ne prend pas en compte le déplacement des zones dues à til feuille shortening. Par conséquent, effectuer une analyse cinématique avant les mesures biochimiques était d'une importance cruciale afin d'interpréter correctement les données.

Figure 4
Figure 4: Exemple de mesures biochimiques à haute résolution et d' échantillonnage pour l' analyse ciblée (A) malonaldéhyde (MDA) concentrations mesurées le long de la zone de croissance du maïs en feuilles (divisé en dix segments) de plantes cultivées condition bien arrosée et de plantes soumises à la sécheresse. 10 traitement. Les données sont des moyennes ± écart-type (n = 5). Deux voies ANOVA a été utilisée comme une analyse statistique, et les valeurs p sont présentées à côté du panneau graphique (facteurs: sécheresse (d) et le segment (s)); FW: poids frais. (B) Visualisation des différentes zones de croissance dans le contrôle et la sécheresse des plantes stressées. la zone de division (D), d'une zone d'allongement (E), etzone mature (M). Les cellules sont amplifiées 125 fois. (C) de profil Cell-longueur de contrôle et la sécheresse des plantes traitées. Les données sont des moyennes ± écart-type (n = 5). (D) Les différences dans l' échantillonnage ciblé à la fois dans le contrôle et la sécheresse des plantes traitées. Les cases bleues indiquent la position d'échantillonnage pour comparer le même stade de développement dans les deux traitements. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

En plus d'offrir la possibilité de comparer les mêmes zones de développement dans les études à haute résolution, l'analyse cinématique pourrait également être utilisé comme base pour des analyses plus ciblées, dans laquelle seuls des échantillons de zones spécifiques contenant des cellules au même stade de développement sont prises. Nous avons comparé les profils de longueur de cellule, fournies par le lissage des microscopiques mesures de longueur des cellules, dans les dix premiers centimeters de la base de la feuille de contrôle et la sécheresse des plantes souligné. Figure 4C montre que, en utilisant le profil de longueur de cellule, nous avons pu déterminer la longueur des zones de développement et pourrait également suivre la dynamique des taux de croissance à la fois le contrôle et la sécheresse des plantes stressées. Cela a permis un échantillonnage spécifique de la prolifération des cellules dans le méristème (avant la forte augmentation), l'expansion des cellules dans la zone d'allongement (au milieu de la forte augmentation) et les jeunes cellules matures dans la zone matures (début du plateau). Nos résultats montrent que, en raison du raccourcissement de la feuille en réponse à la sécheresse, ces zones ne correspondent pas au contrôle et dans les plantes stressées. Pour goûter à la prolifération, l'expansion, et les jeunes cellules matures dans les plantes témoins, nous avions besoin de la première, cinquième et neuvième centimètre de la base de la feuille, respectivement. Cependant, dans les plantes stressées, ces segments correspondent aux premier, quatrième et huitième centimètre, respectivement. Ce genre de plus cibléel' échantillonnage a révélé être utile dans le cas d'études plus laborieux, coûteux ou chronophages, tels que l' ARN-séquençage, protéomique, métabolomique, etc.

Fichier supplémentaire 1:. R-script pour la procédure de lissage polynomiale S'il vous plaît faites un clic droit pour télécharger ce fichier.

Fichier complémentaire 2:. Les calculs des paramètres cinématiques S'il vous plaît faites un clic droit pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Une analyse cinématique complète sur les feuilles de maïs permet la détermination de la base cellulaire de la croissance des feuilles et permet la conception de stratégies d'échantillonnage efficaces. Bien que le protocole est relativement simple, une certaine prudence est recommandée dans les étapes essentielles suivantes: (1) Il est important de détacher les feuilles plus jeunes fermés (étape 2.3) sans endommager le méristème, puisque la longueur du méristème détermination (étape 3) exige la complète méristème d'être présent. Certaines pratiques pourrait être préalablement nécessaire. (2) méristématique détermination de la longueur est basée sur l'interprétation des figures de mitose. Par conséquent, nous conseillons que, dans une expérience, la même personne effectue ces mesures pour réduire la variance due à l'exécuteur. (3) Même si seulement une dizaine de centimètres est utilisé pour les mesures de longueur de cellules réelles, il est important d'inclure onze centimètres lors de la récolte du segment pour les mesures de longueur de cellules (étape 2.5), parce que le bord du segment ne fait paspas toujours complètement immergé dans de l'éthanol et / ou l'acide lactique. Par conséquent, ce centimètre supplémentaire assure la compensation des dix premiers centimètres de la zone de croissance. (4) A la fin, il est utile d'examiner les résultats de tous les paramètres cinématiques pour confirmer qu'ils sont corrects. Dans le tableau 3, par exemple, le taux de production de cellules (P) des plantes à la sécheresse stressées a été réduite de 71% ou, en d' autres termes, la sécheresse est P 0,29 P contrôle. Depuis la production de cellules dépend de taux moyen de la division cellulaire (D; -63%) et le nombre de cellules dans le méristème (N mer; -20%; la figure 3), ce qui suit peut être utilisé pour valider la sortie: P (0,29) ≈ N mer (0,8) x D (0,37). La même chose peut être appliquée pour LER = P mat x I.

Selon les installations disponibles, le protocole peut être modifié en quelques étapes. (1) A plus d'unalternatif VANCÉES pour manuels les mesures quotidiennes de la longueur de la feuille (étape 1.3) est basée sur Linear Velocity Cylindrée Transducteurs (LVDT) 13. Son avantage est qu'elle permet des mesures avec une résolution de temps beaucoup plus élevée, allant de quelques minutes à quelques secondes. (2) Il est essentiel d'inclure la zone de croissance complète lors de l'échantillonnage. Cependant, les conditions environnementales, le génotype, l'espèce et le stade de développement examinées pourraient modifier la longueur de la zone de croissance. Par conséquent, il est utile de faire une première estimation de la longueur de la zone de croissance en réponse à votre traitement de l'expérience. Ce protocole est basé sur la lignée consanguine B73 cultivées à 25 ° C / 18 ° C (jour / nuit) à 300-400 μEm -2 s -1 (photosynthétique Active Radiation - PAR). (3) Pour visualiser les figures de mitose (étape 3.8) sans utiliser la fluorescence, une tache Fuelgen peut être appliquée 14. (4) Le lissage des données peut également être effectuée dans MS Excel au lieu de R en utilisant un qua cinq pointsdratic raccord avec la fonction "DROITEREG" 15.

Une limitation importante de cette technique est que la zone de croissance entière doit être récolté pendant la croissance à l'état stable. Afin d'assurer la croissance à l' état stable, les plantes doivent idéalement être cultivées dans des conditions de croissance contrôlées, parce que les fluctuations de l'intensité lumineuse, la température, l' humidité ou affectent le taux d'allongement de la feuille 16. Pour cette raison, l'analyse cinématique est moins bien adaptée pour les plantes cultivées dans des conditions de terrain. Un autre inconvénient est que les feuilles doivent être apparues, ce qui rend impossible d'examiner des feuilles qui sont encore entourés par des feuilles âgées. Enfin, le protocole est adapté pour les espèces monocotylédones avec de grandes zones de croissance englobant au moins quelques centimètres. Une analyse cinématique sur les petits monocotylédones (par exemple, Poa, riz), cependant, est faisable , mais a besoin de quelques modifications dans la préparation de l' échantillon 17,18.

Une autre utilisation souventd approche pour analyser les phénotypes de croissance différentielle est l'analyse de la croissance classique. Cette analyse quantifie les taux de croissance relatifs des plantes ensemble et détermine la répartition sous - jacente de photosynthétique carbone dérivé dans une nouvelle zone photosynthétique et dans d' autres parties de la plante 19. L'analyse cinématique, cependant, permet une compréhension plus détaillée des processus cellulaires sous-jacents qui sont couplés à des phénotypes de croissance basé sur la quantification de la division cellulaire et de l'expansion. En outre, la possibilité de déterminer la longueur de chaque zone de croissance permet la corrélation des mesures moléculaires selon l'axe des feuilles au stade de développement spécifique qui est affectée par le traitement à l'étude. Ceci est essentiel pour l'interprétation des données. Lorsqu'il est limité dans le temps ou le budget ou quand intéressé par des stades de développement spécifiques, le résultat de cette analyse permet un échantillonnage ciblé, ce qui réduit le nombre d'échantillons nécessaires à l'analyse. En conclusion, l'analyse cinématique permettents la détermination des paramètres cellulaires sous - jacents des réactions de stress et la variation génétique dans la croissance des feuilles et peut les relier à l' amont des processus de réglementation (tableau 2).

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une bourse de doctorat de l'Université d'Anvers à VA; une bourse de doctorat de la Fondation flamande Science (FWO, 11ZI916N) à KS; subventions de projet du FWO (G0D0514N); une activité de recherche concertée (GOA) subvention de recherche, "Biologie Approche A Systèmes de Leaf morphogenèse" du conseil de recherche de l'Université d'Anvers; et l'activité Interuniversitaire Polonais (IUAP VII / 29, MARS), "Le maïs et Arabidopsis racines et des pousses de croissance" de l'Office belge de la Politique scientifique fédérale (BELSPO) à CSGT Han Asard, Bulelani L. Sizani et Hamada Abdelgawad ont tous contribué à la vidéo .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

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Cinématique Analyse de la division cellulaire et Expansion: Quantifier la base cellulaire de la croissance et du développement d&#39;échantillonnage Zones dans<em&gt; Zea mays</em&gt; Feuilles
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