Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

Groei analyse is afhankelijk van een set van tools die vaak worden gebruikt door planten wetenschappers om genotype bepaald groei verschillen en / of fenotypische reacties op milieu-factoren te beschrijven. Ze beschikken over de grootte en het gewicht metingen van de hele plant of een orgaan en berekeningen van groeicijfers om de onderliggende mechanismen van de groei te verkennen. Orgaangroei wordt bepaald door celdeling en expansie op cellulair niveau. Daarmee ook de kwantificering van deze twee processen in groeianalyses is essentieel voor het begrijpen van verschillen in groei 1 whole-orgaan. Bijgevolg is het cruciaal om een ​​geschikte methodologie celgroei parameters die relatief eenvoudig te gebruiken door niet-gespecialiseerde laboratoria te bepalen.

Kinematische analyse reeds ingevoerd als een benadering die een krachtige kader voor de ontwikkeling van orgaangroei modellen 2. De techniek is geoptimaliseerd voor lineaire systemen,zoals Arabidopsis thaliana wortels en bladeren monocotyle, maar ook voor niet-lineaire systemen, zoals tweezaadlobbige bladeren 3. Tegenwoordig wordt deze methode steeds vaker gebruikt om te onderzoeken hoe genetische, hormonale, ontwikkelings- en milieufactoren invloed celdeling en groei in diverse organen (tabel 1). Bovendien biedt een raamwerk om cellulaire processen te verbinden met de onderliggende biochemische, moleculaire en fysiologische voorschriften (tabel 2), hoewel beperkingen door orgaangrootte en ruimtelijke organisatie kan worden opgelegd technieken die grotere hoeveelheden plantenmateriaal vereisen (bijv metaboliet metingen, proteomics, etc.).

Eenzaadlobbige bladeren, zoals maïs (Zea mays) bladeren vertegenwoordigen lineaire systemen waarbij cellen zich van de basis van het blad naar de punt, achtereenvolgens door het meristeem en elongatiezone de rijpe bereikenzone. Dit maakt het een ideaal modelsysteem voor kwantitatieve studies van de ruimtelijke patronen van de groei 4. Bovendien, maïs bladeren hebben grote groei zones (meristeem en rek zone verspreid over enkele centimeters 5) en bieden mogelijkheden om studies bij andere organisatieniveaus. Dit maakt het mogelijk voor het onderzoek naar de (vermeende) regulerende mechanismen die celdeling en expansie, gekwantificeerd door kinematische analyse door middel van een reeks van moleculaire technieken, fysiologische metingen, en celbiologie benaderingen (tabel 2).

Hier bieden we een protocol voor het uitvoeren van een kinematische analyse in eenzaadlobbige bladeren. Eerst wordt uitgelegd hoe een goede analyse van zowel celdeling en elongatie voeren als functie van positie langs de vleugelas en hoe kinematische parameters berekenen. Ten tweede hebben wij laten ook zien hoe deze kan worden gebruikt als basis voor de steekproef. Hier bespreken we twee gevallen: high-resolution sampling eend gerichte steekproeven, waardoor betere interpretatie van gegevens en de besparing van tijd / geld, respectievelijk.

Tabel 1. Overzicht van kinematische analysemethoden voor kwantificeren van celdeling en groei in diverse organen.

orgaan referentie
eenzaadlobbige bladeren 16, 20, 21, 22
Root tips 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
tweezaadlobbige bladeren 21, 30, 31
schieten topmeristeem 32

Tabel 1. Overzicht van kinematische analysemethoden voor kwantificeren van celdeling en groei in diverse organen.

Tabel 2. Verband tussen cellulaire processen gekwantificeerd door de kinematische analyse om de regulering op moleculair niveau. Verwijzingen naar verscheidene studies die de kwantificering van cellulaire processen om resultaten van biochemische en moleculaire assays verschillende soorten en organen. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), malondialdehyde (MDA), cycline-afhankelijke kinasen (CDK). Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: De volgende protocol voor kinematische analyse is alleen geldig voor bladeren tijdens de groei van steady-state. Dit impliceert een stabiele blad reksnelheid en ruimtelijke patronen van cellengte en expansie in een blad gedurende enkele dagen 6.

1. Plant Groei en Metingen van Leaf Rek Rate (LER)

  1. Kies een blad in de groei steady-state en een ontwikkelingsstadium van belang.
    NB: Er is een verschil tussen de groei van steady-state en repetitieve groei, die soortgelijke ruimtelijke patronen houdt op achtereenvolgende bladeren op dezelfde as. Tijdens de vroege stadia van zaailingsgroei opeenvolgende bladeren groeien typisch steeds sneller door de toenemende grootte van de groeizone 7. Hoewel enkele hogere blad kijkrichtingen groeipatroon 8 kan hebben, is een overgangsfase die kunnen worden beïnvloed door behandelingen onderzocht. Het is daarom belangrijk om lijnen en tr vergelijken eatments strikt dezelfde bladpositie, ook al kan ontwikkelen op een ander tijdstip. Zelfs met een constante reksnelheid, de groei profiel is niet noodzakelijk in verschillende ontwikkelingsstadia. Daarom is het belangrijk om bladeren analyseren in hetzelfde ontwikkelingsstadium 8, kenmerkend bepaald door het aantal dagen na het opkomen.
  2. Een volledige analyse van kinematische bladgroei uitvoeren eenzaadlobbigen groeien tenminste 15 planten per behandeling en genotype onder gecontroleerde omstandigheden in een kweekkamer.
  3. Op het moment dat het blad van belang verschijnt (opkomst van de werveling van omliggende bladeren), beginnen met het meten van de lengte van het blad dagelijks met een liniaal totdat het blad volledig is uitgebreid (Figuur 1i). Bladlengte betekent de lengte vanaf grondniveau tot de top van het blad. Wees voorzichtig niet te breken of schade aan het blad, omdat dit de groei zou kunnen veranderen.

re 1 "src =" / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Schematisch overzicht van een kinematische analyse maïs bladeren Blad van belang wordt gemeten met een liniaal gedurende drie opeenvolgende dagen te berekenen Leaf reksnelheid (LER). Daarna wordt het blad geoogst en drie centimeter segment wordt gebruikt voor het bepalen van het meristeem grootte. Dit gebeurt door de lengte vanaf de basis tot aan het meest distale mitotische figuur na DAPI kleuring. (A) Voorbeelden van proliferatieve mitotische figuren en (B) vormende mitotische figuren. De eerste elf cm van de bladbasis aan de andere zijde van het midden ader worden gebruikt om 1001 centimeter segmenten cel lengtemetingen gesneden. Deze metingen vormen de basis voor het creëren van de cel lengteprofiel, die dient om de rijpe cel lengte (l mat) en de lengte van cellen waardoor de meristeem (l div) te bepalen. De l LER en mat worden gebruikt om de cel productiesnelheid (P) te berekenen, terwijl l div en L mer worden gebruikt om het aantal cellen in het meristeem (N mer) berekenen. Op zijn beurt, P en N mer worden gebruikt om de gemiddelde celdelingssnelheid (D), welke de inverse van celcyclus duur (Tc) berekenen. Pijlen van dezelfde kleur geven parameters die worden gebruikt om de parameter te berekenen volgende op deze pijlen. Schaalbalken = 40 urn. Romeinse cijfers worden gebruikt om te verwijzen naar specifieke in het protocol beschreven experimentele procedures. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Oogsten

  1. Aan het ontwikkelingsstadium van belang (bijvoorbeeld, de derde dag na opkomst), minstens vijf representatieve pnten van de partij waarop de kinematische analyse uit te voeren. Continue meting van de rest van de planten zoals beschreven in stap 1.3 tot de uiteindelijke blad lengte te bepalen.
  2. Snijd het bovengrondse deel van de plant. Het meristeem deel intact, snijden zo dicht mogelijk bij de wortels (Figuur 1ii).
  3. Vanaf de buitenste bladeren, verwijder alle bladeren tot aan het blad van de rente door ze voorzichtig afrollen één voor één. Verwijder indien nodig een paar extra millimeters van de basis naar de bladeren los te maken. Verwijder ook de apex en kleine blaadjes omsloten door het blad van belang (figuur 1iii).
  4. Snijd een segment 3 cm, te beginnen vanaf de basis aan de ene kant van het midden van de ader, en bewaar het op een 1,5 ml reageerbuis gevuld met 3: 1 (v: v) absolute ethanol: azijnzuur-oplossing (LET OP: draag handschoenen) bij 4 ° C gedurende 24 uur tot enkele maanden (Figuur 1iv). Dit segment wordt later gebruikt om de lengte van het meristeem bepalen.
  5. Van deandere kant van de ader, snijd een 11 cm segment van de basis (figuur 1 v) en plaats deze in een 15 ml buis gevuld met absolute ethanol bij 4 ° C gedurende ten minste 6 uur pigmenten (figuur 1 vi) verwijderen.
    LET OP: Later, gebruik dan alleen de eerste 10 cm aan de cel lengte profiel te bepalen (zie Discussie).
  6. Vernieuwen van de absolute ethanol voor een nieuwe ronde van reiniging bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur (Figuur 1vi).
  7. Tenslotte wordt vervangen absolute ethanol met zuiver melkzuur (NB: handschoenen) voor reiniging en opslag bij 4 ° C gedurende 24 uur en tot verder gebruik (figuur 1vi).

3. Meristem Lengte Metingen

  1. Bereid een spoelbuffer met 50 mM natriumchloride (NaCl), 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; LET handschoenen) en 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan-waterstofchloride (TRIS-HCl, pH 7).
  2. Neem het segment 3 cm uit paragraaf 2.4 en zoak in de buffer gedurende 20 minuten (Figuur 1vii).
  3. Afwachting Gebruik de spoelbuffer een 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring oplossing van 1 ug / ml te bereiden, houden het op ijs en in het donker.
  4. Vlekken op de kernen door het plaatsen van de meristeem segment voor 2-5 min in de DAPI kleuring oplossing. Werk aan ijs en in het donker (figuur 1vii).
  5. Controleer op fluorescentie-signaal door het snel monteren van het segment op een microscopie glas en het te bedekken met een deksel glas. De epidermale cellen moet fluorescentie vertonen, terwijl de onderliggende cellagen niet moeten doen.
  6. Indien kleuring onvoldoende, zet het segment terug in de DAPI kleuring oplossing extra minuten.
  7. Om de kleuring te stoppen, de segmenten in een daling van de spoelbuffer op een microscopie glijbaan en dekken met een deksel glas te monteren.
  8. Gebruik een microscoop met UV-fluorescentie op 20x vergroting, waardoor visualisatie van ongeveer 1000 epidermisal cellen tegelijk. Scroll in het hele segment en kijk voor proliferatieve mitotische figuren (metafase, anafase, telofase en cytokinese), maar vermijd vormende celdeling van de ontwikkeling van huidmondjes (figuur 1viii) 9. Definieer waar de meest distale mitotische cijfer ligt.
  9. Bepaal de lengte van het meristeem door de afstand tussen de onderkant van het blad en de meest distale epidermale mitotische figuur. Met een beeld-analyse-software (bijvoorbeeld ImageJ) de volledige lengte van het beeldframe meten.
    1. Tel het aantal frames dat de volledige lengte meristeem (van de bladbasis de meest distale mitotische figuur) omvatten en vermenigvuldigt dit getal met de lengte van de frames het meristeem volledige lengte (Figuur 1ix) te verkrijgen.

4. Cell Lengte Profiel

  1. Neem het segment dat is opgeslagen in melkzuur (stap 2,5) en plaats deze voorzichtig op de bank. Snijd de segmenten witha scalpel in 10 segmenten van 1 cm per (figuur 1x).
  2. Monteer de opeenvolgende blad segmenten op een microscopie dia in een kleine daling van melkzuur. Zorg ervoor dat u altijd kijken uit op de adaxial of abaxiale kant naar boven. In principe is er geen voorkeur voor een bepaalde kant.
  3. Gebruik een microscoop uitgerust met differentiële interferentie contrast (DIC) optiek om de segmenten te analyseren, vanaf de bladvoet. Meten met een beeldanalyse software de lengte van ten minste 20 repliceren epidermale cellen in bestanden direct naast de stomatale bestanden om consequent te selecteren hetzelfde celtype.
    1. Doe dit op gelijke afstand van elkaar plaatsen langs elk van de segmenten (4 standen per segment volstaan), en zorg ervoor dat op te schrijven van de overeenkomstige positie voor elke meting gedurende het blad (Figuur 1xi).
  4. Bepaal de gemiddelde celgrootte lengte bij elke mm langs de vleugelas door een lokale polynoom p smoothingROCEDURE, geïmplementeerd in een R-script (figuur 1xii; aanvullend bestand 1).
    OPMERKING: De R-script bevat een reeks gegevens met toenemende smoothing. De hoeveelheid gladmakende nodig is, is enigszins arbitrair en idealiter moet gewoon verwijderen van de lokale lawaai, maar geen invloed op de algemene curve. Zorg ervoor dat u hetzelfde bedrag te gebruiken van het effenen voor alle monsters binnen een experiment.
  5. Middel de lengte cel op elke positie tussen planten en bereken de standaardfout aan een cel lengteprofiel langs de vleugelas maken.

5. Berekeningen van kinematische parameters (zie aanvullend bestand 2)

  1. Bereken de LER Door de verandering in bladlengte tussen twee opeenvolgende tijdstippen (bijvoorbeeld, 24 uur, zoals in stap 1,3) te delen door het tijdsinterval.
  2. Bereken de lengte van de groeizone (L gz) overeenkomt met de stand distaal van de basis waar cellen bereikt 95% van de volwassen cell lengte aan de smoothened cel lengteprofiel.
    1. Neem voor elke positie op het smoothened cel lengteprofiel 95% van de gemiddelde lengte van alle cellen na die positie (figuur 2).
    2. Vergelijk het smoothened cel lengtes (stap 4.4) met de berekende 95% cel lengte op elke positie. Vanaf de basis van het blad, de groei zone eindigt op de plaats waar de werkelijke cel lengte bedraagt 95% van de volgende cel lengte (Figuur 2; zie aanvullende gegevens 2).

Figuur 2
Figuur 2:. Bepalen het einde van de groeizone Meristem: Voor deze aangegeven met een rode sterpositie de werkelijke celgrootte kleiner is dan 95% (rode stippellijn) van de gemiddelde celgrootte van alle cellen na deze positie (rode vaste stof lijn). Het einde van de groei zone (L gz; aangeduid met ablue sterren) is gelegen waar 95% (gestippelde blauwe lijn) van de gemiddelde celgrootte van alle cellen na deze positie (stevige blauwe lijn) is gelijk aan de werkelijke cel grootte. Division zone (D), rek zone (E), en volwassen zone (M). Binnen de pijlen geven de convergentie tussen de lokale grootte en 95% van de gemiddelde grootte over het distale gedeelte van het blad bij het verplaatsen van de basale posities aan het uiteinde van het blad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Bereken de lengte van elongatiezone (L el) als het verschil tussen de lengte van de groeizone (L gz) en het meristeem grootte (L mer, bepaald in stap 3).
  2. Bereken de volwassen cel lengte (l mat) als de gemiddelde cel lengte in de mature zone.
  3. Verdeel de LER door l mat aan te verkrijgencell productie snelheid (P).
  4. Bereken het aantal cellen in de elongatiezone (N el) als het verschil tussen N en N gz mer. Het aantal cellen in het meristeem (N mer) gelijk aan het totaal aantal cellen in het interval overeenkomend met de meristeem. Het aantal cellen in de groei zone (N gz) gelijk aan het totaal aantal cellen in het interval overeenkomend met de groeizone.
  5. Bereken de gemiddelde celdeling rate (D) als P / N mer. De celcyclus duur (Tc) is gelijk aan ln (2) / D.
  6. Bereken de tijd in de rek zone (T el) door te delen N el door P. De tijd in de divisie zone is gelijk aan log 2 (N mer) * T c. De lengte van cellen waardoor de meristeem (l div)gelijk aan de lengte van de cel smoothened cel lengteprofiel aan het eind van het meristeem.
  7. Bereken de gemiddelde celexpansie (R el) met behulp van volgende formule: ln (l mat) -ln (l div)] / T el.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier tonen we een vergelijking tussen goed bewaterd planten (controle, 54% bodem water inhoud, (SWC)) en planten blootgesteld aan droogtestress omstandigheden (droogte, 34% SWC) in termen van hun bladgroei. Alle planten werden gekweekt in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden (16 uur dag / 8 uur nacht, 25 ° C / 18 ° C dag / nacht, 300-400 μEm -2 -1 sec fotosynthetisch actieve straling (PAR). De droogte werden opgericht door inhouding water totdat de juiste SWC werd bereikt en dan verder onderhouden. In een voorstudie, werd bepaald dat het vijfde blad is de eerste te voorschijn te komen en te ontwikkelen in het kader van deze spanning staat. Daarom werd gekozen als het blad van interest. de uiteindelijke bladlengte (LL) van de droogte-stress gebrachte planten was 40% lager dan die van de waterrijke planten, die door lagere LER (tabel 3) was. de cellulaire basis van de lea begrijpenf groei reactie, we voerden een kinematische analyse. Overall, blad reksnelheid is een functie van celproductie in het meristeem en volwassen celgrootte bepaald de rek zone (Figuur 3). Daarom moet het verkorten van het blad door effecten op één of beide parameters. Onze resultaten tonen dat terwijl de cellengte volwassen (l mat) niet werd beïnvloed, de cel productiesnelheid (P) werd verminderd met 71% (tabel 3). L mat afhankelijk van de lengte van de cellen waardoor de meristeem (l div) , de tijd dat deze cellen door te brengen in de rek zone (T el), en de relatieve celexpansie (R el). Geen effect werd waargenomen voor l div, terwijl R el in de droogte werd verminderd met 67%. Dit effect werd gecompenseerd door de bijna verdrievoudiging van T el, waardoor dezelfde l mat </ Sub> als in de standaard omstandigheden. De afname in cel productiesnelheid was op zijn beurt veroorzaakt door zowel een lagere gemiddelde celdelingssnelheid (D) en een kleiner aantal cellen in het meristeem (N mer). Lengte van het meristeem (L mer) gereduceerd in tegenstelling tot de lengte van de groeizone (L gz), die niet wezenlijk is aangetast. Samenvattend tonen deze resultaten dat in dit geval, het aantal cellen, in tegenstelling celgrootte, had een belangrijke rol bij het bepalen bladgrootte.

kinematische parameters C D % Verandering CD p-value
LL 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (mm / h) 2,8 ± 0,1 0,8 ± 0,0 -73 0.000
l mat (pm) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
P (cellen / h) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (cellen · cel -1 · h-1) 0,028 ± 0,003 0.010 ± 0.001 -63 0.000
Tc (hr) 26 ± 3 71 ± 7 173 0.000
T div (hr) 249 ± 27 656 ± 71 164 0.000
L mer (mm) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0.010
N mer 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R el (um · um h-1) 0,043 ± 0,002 0,014 ± 0.001 -67 0.000
l div (pm) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
T el (hr) 42 ± 2 125 ± 11 199 0.000
N el 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L Gz (mm) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N Gz 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0.010

Tabel 3. Kinematische analyse van celdeling en celexpansie tijdens de groei steady-state van het vijfde blad van. goed bewaterd en planten blootgesteld aan droogtestress Gegevens zijn gemiddelden ± SE (n = 5, voor LL: n = 10). t-test van Student werd gebruikt als een statistische analyse. Parameters: lengte van de vleugel (LL), blad verlengingstarief (LER), volwassen cel lengte (l mat), mobiele productie snelheid (P), celdeling rate (D), de duur van de celcyclus (Tc), de tijd in divisie zone ( T div), lengte van het meristeem (L mer), het aantal cellen in het meristeem (N mer), relatieve elongatie (R el), lengte van de cellen waardoor de meristeem (l div), weer in de elongatiezone (T el), het aantal cellen in de rek zone (N el), de lengte van de groei zone (L gz), het aantal cellen in de groei zone (N gz), goed bewaterd omstandigheden (C), droogtestress ( D), een d niet significant (NS).

figuur 3
Figuur 3:. Relatie tussen de kinematische parameters De uiteindelijke bladlengte (LL) is afhankelijk van de bladverlenging Rate (LER), die op zijn beurt afhangt van de celproductie (P) en volwassen cellen lengte (l mat). Het aantal cellen in het meristeem (N mer) en de celdeling rate (D) bepalen tezamen P, met een duur celcyclus (Tc) als het omgekeerde van D. Tijd in de rek zone (T el), de lengte van de cellen het verlaten van de meristeem (l div), en de relatieve celexpansie (R el) bepalen de volwassen cel lengte (l mat). Het aantal cellen in de elongatiezone (N el)..jove.com / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

In aanvulling op de toepassing ervan als een gedetailleerde analyse van orgel groei, kinematische analyse geeft een kaart van bladgroei zone lokalisatie en maakt bemonstering met een subzonegrens resolutie voor moleculaire en biochemische analyses 4,10,11. Als voorbeeld, Figuur 4A toont malondialdehyde (MDA) kwantificering langs het groeigebied van het blad maïs planten aan dezelfde voorwaarden als hierboven. MDA is een secundaire metaboliet in lipide peroxidatie gevormd door ROS en weerspiegelt het niveau van oxidatieve schade 12. MDA werd gemeten in elke centimeter van het blad, te beginnen bij de basis, die de analyse van de concentratie veranderingen langs de groei gradiënt 11 toegestaan. Als de droogte behandeling veroorzaakte 40% leaf verkorten, de lengte van de ontwikkeling zones (meristam, elongatiezone en rijpe zone) in de controleplanten niet overeen met de lengte van dezelfde zones in de droogte stress gebrachte planten (Figuur 4B). Zoals blijkt uit figuur 4B, het meristeem in de controleplanten was ongeveer 1,5 cm lang, en de rek zone overspannen 1,5-6,8 cm vanaf de bladvoet. In de planten onder stress, werd de meristeem gelokaliseerd 0-1,1 cm en elongatiezone 1,1-6,1 cm. MDA niveaus en de hele groeizone verhoogd in planten door droogte in vergelijking met de controlebehandeling. Met behulp van de kinematische analyse kunnen we concluderen dat MDA inhoud bijzonder verhoogd in het rijpe gebied van zowel en droogte behandelingen. Zonder de afmetingen van de ontwikkeling zones, zouden we concluderen dat, onder droogtestress, de MDA gehalte toeneemt in een eerder ontwikkelingsstadium dan in de controleplanten die verkeerd zijn omdat het geen rekening houdt met de verschuiving van de zones als gevolg tot tHij blad verkorten. Daarom kinematische analyse uitvoeren voor de biochemische metingen was van cruciaal belang om de gegevens correct te interpreteren.

figuur 4
Figuur 4: Voorbeeld van een hoge resolutie biochemische metingen en bemonstering voor gerichte analyse (A) malonaldehyd (MDA) concentraties gemeten langs de maïs bladgroei zone (verdeeld in tien segmenten) van planten gekweekt in goed bewaterd conditie en planten onderworpen aan droogte. 10 behandeling. Gegevens zijn gemiddelden ± SE (n = 5). Two-way ANOVA werd gebruikt als een statistische analyse, en p-waarden worden naast de grafiek paneel (factoren: droogte (d) en segment (en)); FW: versgewicht. (B) Visualisatie van de verschillende zones groei in controle en droogte gestresste planten. Division zone (D), rek zone (E), envolwassen zone (M). Cellen 125 maal vergroot. (C) Cell-lengteprofiel controle- en droogte behandelde planten. Gegevens zijn gemiddelden ± SE (n = 5). (D) Verschillen in gerichte bemonstering in zowel de controle en droogte behandelde planten. De blauwe vakken geven sampling positie om dezelfde ontwikkelingsfase te vergelijken in beide behandelingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast de mogelijkheid biedt onze dezelfde ontwikkeling zones in hoge-resolutie studies zou het kinematische analyse ook worden gebruikt als basis voor meer gerichte analyses, waarbij slechts voorbeelden van specifieke zones bevattende cellen in hetzelfde ontwikkelingsstadium worden genomen. We vergeleken de cellengte profielen, die door de afvlakking van de microscopische cel lengtemeting, in de eerste tien centimeters de bladvoet controle- en droogte stress gebrachte planten. Figuur 4C toont aan dat, met de cel lengteprofiel, konden we de lengte van de ontwikkeling zones te bepalen en kan ook volgen de groei dynamiek in zowel controle als droogte gestresste planten. Hierdoor kon bemonsteringssequentie van prolifererende cellen in het meristeem (voor de sterke toename), uitbreiding cellen in het rek zone (in het midden van de sterke stijging) en jonge volwassen cellen in de volwassen zone (begin van het plateau). Onze resultaten tonen dat door het blad verkorten als reactie op de droogte, deze zones niet overeenkomen in de controle en de gestresste planten. Om te proeven van proliferatie, het uitbreiden, en jonge volwassen cellen in de controle planten, moesten we de eerste, vijfde en negende centimeter uit het blad basis, respectievelijk. In de gestresste planten, deze segmenten corresponderen met de eerste, vierde en achtste centimeter respectievelijk. Dit soort meer gerichtbemonstering nuttig gebleken bij omslachtiger, dure of tijdrovende studies, zoals RNA-sequencing, proteomics, metabolomics, etc. zijn

Aanvullende File. 1: R-script voor polynoom smoothing procedure aub klik met de rechtermuisknop op dit bestand te downloaden.

Aanvullend File 2:. Berekeningen van kinematische parameters aub klik met de rechtermuisknop op dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een volledige analyse van kinematische maïsblaadjes maakt de bepaling van de cellulaire basis van bladgroei en maakt het ontwerp van efficiënte bemonsteringsstrategieën. Hoewel het protocol is relatief eenvoudig is enige voorzichtigheid bij de volgende belangrijke stappen: (1) Het is belangrijk dat de jongere, afgesloten bladeren (stap 2,3) los te maken zonder beschadiging van de meristeem, aangezien meristeem lengte bepalen (stap 3) vereist een totale meristeem aanwezig te zijn. Wat oefening op voorhand nodig zou zijn. (2) meristematic lengte bepaling is gebaseerd op de interpretatie van mitotische figuren. Daarom adviseren wij dat binnen één experiment, dezelfde persoon voert deze metingen om de variantie te verminderen als gevolg van de uitvoerder. (3) Hoewel slechts tien centimeter wordt gebruikt voor de eigenlijke cel lengtemetingen, is het belangrijk om elf centimeter bij het oogsten van het segment voor cellulaire lengtemetingen (stap 2,5) omvatten, omdat de rand van het segment niet doett altijd volledig onderdompelen in ethanol en / of melkzuur. Daarom is deze extra centimeter zorgt voor clearing van de eerste tien centimeter van de groei zone. (4) Op het einde, is het nuttig om de uitkomst van alle kinematische parameters te controleren om te bevestigen dat ze correct zijn. In Tabel 3, bijvoorbeeld, de cel productiesnelheid (P) van de droogte-stress gebrachte planten werd verlaagd met 71%, of met andere woorden, P droogte 0,29 P control. Aangezien de productiecel afhankelijk gemiddeld celdelingssnelheid (D; -63%) en het aantal cellen in het meristeem (N mer, -20% Figuur 3) kunnen de volgende worden gebruikt om de uitgang te valideren: P (0,29) ≈ N mer (0,8) x D (0,37). Hetzelfde kan worden toegepast LER = P x I mat.

Afhankelijk van de beschikbare faciliteiten, kan het protocol in een aantal stappen worden gewijzigd. (1) Een eendvanced alternatief voor de dagelijkse handmatige bladlengte metingen (stap 1,3) is gebaseerd op Linear Velocity-transductor (LVDTs) 13. Het voordeel is dat het mogelijk maakt metingen bij een veel hogere tijdresolutie, variërend van minuten tot seconden. (2) Het is cruciaal om de volledige groei zone tijdens de bemonstering omvatten. Echter, omgevingsomstandigheden, genotype, species en het ontwikkelingsstadium besproken kan de lengte van de groeizone veranderen. Daarom is het nuttig om een ​​eerste schatting van de lengte van de groeizone in antwoord op uw experiment behandeling. Dit protocol is gebaseerd op de ingeteelde stammen B73 gekweekt bij 25 ° C / 18 ° C (dag / nacht) en 300-400 μEm -2 s -1 (Photosynthetic Active Radiation - PAR). (3) Om de mitotische figuren (stap 3,8) zichtbaar zonder fluorescentie kan een Fuelgen vlek worden toegepast 14. (4) De afvlakking van de gegevens kunnen ook in MS Excel plaats van R worden gedaan met behulp vijfpuntenvoorstel quadratic passend bij de "LIJNSCH" -functie 15.

Een belangrijke beperking van deze techniek is dat de gehele groei zone moet tijdens de groei steady-state te oogsten. Met het oog op steady-state groei te verzekeren, moeten planten idealiter worden geteeld onder gecontroleerde groeiomstandigheden, omdat schommelingen in de lichtintensiteit, temperatuur of luchtvochtigheid van invloed op het blad rek tarief 16. Daarom, de kinematische analyse minder geschikt voor planten gekweekt onder veldomstandigheden. Een ander nadeel is dat de bladeren moeten ontstaan, waardoor het onmogelijk bladeren die nog omgeven door oudere bladeren onderzocht. Tenslotte wordt het protocol geschikt voor monocotyle soorten met grote groeizones omvat tenminste enkele centimeters. Een kinematische analyse van kleinere eenzaadlobbigen (bijvoorbeeld Poa, rijst), echter haalbaar maar dient enkele wijzigingen in de monsterbereiding 17,18.

Een ander vaak gebruiktd benadering van differentiële groei fenotypes te analyseren is de klassieke groei analyse. Deze analyse kwantificeert hele plant relatieve groeicijfers en bepaalt de onderliggende verdeling van de fotosynthetische afgeleid koolstof in een nieuw fotosynthetische gebied en in andere delen van de plant 19. De kinematische analyse laat echter een meer gedetailleerd begrip van de onderliggende cellulaire processen die gekoppeld zijn aan groei fenotypen gebaseerd op kwantificeren celdeling en celexpansie. Bovendien is de mogelijkheid om de lengte van elk groeigebied bepalen maakt de correlatie van moleculaire metingen langs de vleugelas de specifieke ontwikkelingsfase die wordt beïnvloed door de behandeling bestudeerd. Dit is essentieel voor de interpretatie van gegevens. Wanneer beperkt in de tijd of budget, of wanneer geïnteresseerd zijn in specifieke ontwikkelingsstadia, de uitkomst van deze analyse zorgt voor gerichte bemonstering, het verminderen van het aantal monsters die nodig zijn voor analyse. Concluderend kinematische analyse mogelijkis de bepaling van cellulaire parameters onderliggende stressreacties en genetische variatie in bladgroei en kan ze koppelen aan regulerende processen (tabel 2) stroomopwaarts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een PhD-beurs van de Universiteit van Antwerpen naar VA; een PhD beurs van de Vlaamse Science Foundation (FWO, 11ZI916N) naar KS; projectsubsidies van het FWO (G0D0514N); een gezamenlijke onderzoeksactiviteiten (GOA) onderzoek subsidie, "een systeembiologische benadering van bladmorfogenese" uit het onderzoek van de Raad van de Universiteit van Antwerpen; en de interuniversitaire attractiepolen (IUAP VII / 29, MARS), "maïs en Arabidopsis Root en Schiet groei" van het Federaal Wetenschapsbeleid (BELSPO) naar GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani en Hamada Abdelgawad allemaal bijgedragen tot de video .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Quantitative analyses of cell division in plants. Plant Mol. Biol. 60, 963-979 (2006).
  2. Silk, W. K., Erickson, R. O. Kinematics of Plant-Growth. J. Theor. Biol. 76, 481-501 (1979).
  3. Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Chapter 14 (2010).
  4. Avramova, V., Sprangers, K., Beemster, G. T. S. The Maize Leaf: Another Perspective on Growth Regulation. Trends Plant Sci. 20, 787-797 (2015).
  5. Rymen, B., et al. Cold nights impair leaf growth and cell cycle progression in maize through transcriptional changes of cell cycle genes. Plant Physiol. 143, 1429-1438 (2007).
  6. Muller, B., Reymond, M., Tardieu, F. The elongation rate at the base of a maize leaf shows an invariant pattern during both the steady-state elongation and the establishment of the elongation zone. J. Exp. Bot. 52, 1259-1268 (2001).
  7. Beemster, G. T. S., Masle, J., Williamson, R. E., Farquhar, G. D. Effects of soil resistance to root penetration on leaf expansion in wheat (Triticum aestivum L): Kinematic analysis of leaf elongation. J. Exp. Bot. 47, 1663-1678 (1996).
  8. Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Spatial and Temporal Aspects of Leaf Growth-Inhibition. Planta. 191, 433-439 (1993).
  9. Sylvester, A. W., Smith, L. G. Cell Biology of Maize Leaf Development. Handbook of maize: It's Biology. Bennetzen, J. L., Hake, S. C. , Springer. NY. (2009).
  10. Nelissen, H., et al. A Local Maximum in Gibberellin Levels Regulates Maize Leaf Growth by Spatial Control of Cell Division. Curr. Biol. 22, 1183-1187 (2012).
  11. Avramova, V., et al. Drought Induces Distinct Growth Response, Protection, and Recovery Mechanisms in the Maize Leaf Growth Zone. Plant Physiol. 169, 1382-1396 (2015).
  12. Picaud, J. C., et al. Total malondialdehyde (MDA) concentrations as a marker of lipid peroxidation in all-in-one parenteral nutrition admixtures (APA) used in newborn infants. Pediatr. Res. 53, 406 (2003).
  13. Basu, P., Pal, A., Lynch, J. P., Brown, K. M. A novel image-analysis technique for kinematic study of growth and curvature. Plant Physiol. 145, 305-316 (2007).
  14. Vander Weele, C. M., et al. A new algorithm for computational image analysis of deformable motion at high spatial and temporal resolution applied to root growth. Roughly uniform elongation in the meristem and also, after an abrupt acceleration, in the elongation zone. Plant Physiol. 132, 1138-1148 (2003).
  15. Nelissen, H., Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Plant Organogenesis. DeSmet, I. , Chapter 17 (2013).
  16. Ben-Haj-Salah, H., Tardieu, F. Temperature Affects Expansion Rate of Maize Leaves without Change in Spatial-Distribution of Cell Length - Analysis of the Coordination between Cell-Division and Cell Expansion. Plant Physiol. 109, 861-870 (1995).
  17. Fiorani, F., Beemster, G. T. S., Bultynck, L., Lambers, H. Can meristematic activity determine variation in leaf size and elongation rate among four Poa species? A kinematic study. Plant Physiol. 124, 845-855 (2000).
  18. Pettko-Szandtner, A., et al. Core cell cycle regulatory genes in rice and their expression profiles across the growth zone of the leaf. J. Plant Res. 128, 953-974 (2015).
  19. Poorter, H., Remkes, C. Leaf-Area Ratio and Net Assimilation Rate of 24 Wild-Species Differing in Relative Growth-Rate. Oecologia. 83, 553-559 (1990).
  20. Macadam, J. W., Volenec, J. J., Nelson, C. J. Effects of Nitrogen on Mesophyll Cell-Division and Epidermal-Cell Elongation in Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 89, 549-556 (1989).
  21. Tardieu, F., Granier, C. Quantitative analysis of cell division in leaves: methods, developmental patterns and effects of environmental conditions. Plant Mol. Biol. 43, 555-567 (2000).
  22. Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Possible Role of Some Mineral Elements in Growth-Inhibition. Planta. 196, 699-705 (1995).
  23. Erickson, R. O., Sax, K. B. Rates of Cell-Division and Cell Elongation in the Growth of the Primary Root of Zea-Mays. P. Am. Philos. Soc. 100, 499-514 (1956).
  24. Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
  25. Goodwin, R. H., Stepka, W. Growth and differentiation in the root tip of Phleum pratense. Am. J. Bot. 32, 36-46 (1945).
  26. Hejnowicz, Z. Growth and Cell Division in the Apical Meristem of Wheat Roots. Physiologia Plantarum. 12, 124-138 (1959).
  27. Gandar, P. W. Growth in Root Apices .1. The Kinematic Description of Growth. Bot. Gaz. 144, 1-10 (1983).
  28. Baskin, T. I., Cork, A., Williamson, R. E., Gorst, J. R. Stunted-Plant-1, a Gene Required for Expansion in Rapidly Elongating but Not in Dividing Cells and Mediating Root-Growth Responses to Applied Cytokinin. Plant Physiol. 107, 233-243 (1995).
  29. Sacks, M. M., Silk, W. K., Burman, P. Effect of water stress on cortical cell division rates within the apical meristem of primary roots of maize. Plant Physiol. 114, 519-527 (1997).
  30. Granier, C., Tardieu, F. Spatial and temporal analyses of expansion and cell cycle in sunflower leaves - A common pattern of development for all zones of a leaf and different leaves of a plant. Plant Physiol. 116, 991-1001 (1998).
  31. De Veylder, L., et al. Functional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabidopsis. Plant Cell. 13, 1653-1667 (2001).
  32. Kwiatkowska, D. Surface growth at the reproductive shoot apex of Arabidopsis thaliana pin-formed 1 and wild type. J. Exp. Bot. 55, 1021-1032 (2004).
  33. Kutschmar, A., et al. PSK-alpha promotes root growth in Arabidopsis. New Phytol. 181, 820-831 (2009).
  34. Vanneste, S., et al. Plant CYCA2s are G2/M regulators that are transcriptionally repressed during differentiation. Embo J. 30, 3430-3441 (2011).
  35. Eloy, N. B., et al. Functional Analysis of the anaphase-Promoting Complex Subunit 10. Plant J. 68, 553-563 (2011).
  36. Eloy, N. B., et al. SAMBA, a plant-specific anaphase-promoting complex/cyclosome regulator is involved in early development and A-type cyclin stabilization. P. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 13853-13858 (2012).
  37. Dhondt, S., et al. SHORT-ROOT and SCARECROW Regulate Leaf Growth in Arabidopsis by Stimulating S-Phase Progression of the Cell Cycle. Plant Physiol. 154, 1183-1195 (2010).
  38. Baute, J., et al. Correlation analysis of the transcriptome of growing leaves with mature leaf parameters in a maize RIL population. Genome Biol. 16, (2015).
  39. Andriankaja, M., et al. Exit from Proliferation during Leaf Development in Arabidopsis thaliana: A Not-So-Gradual Process. Dev. Cell. 22, 64-78 (2012).
  40. Beemster, G. T. S., et al. Genome-wide analysis of gene expression profiles associated with cell cycle transitions in growing organs of Arabidopsis. Plant Physiol. 138, 734-743 (2005).
  41. Spollen, W. G., et al. Spatial distribution of transcript changes in the maize primary root elongation zone at low water potential. Bmc Plant Biol. 8, (2008).
  42. Candaele, J., et al. Differential Methylation during Maize Leaf Growth Targets Developmentally Regulated Genes. Plant Physiol. 164, 1350-1364 (2014).
  43. West, G., Inze, D., Beemster, G. T. S. Cell cycle modulation in the response of the primary root of Arabidopsis to salt stress. Plant Physiol. 135, 1050-1058 (2004).
  44. Zhang, Z., Voothuluru, P., Yamaguchi, M., Sharp, R. E., Peck, S. C. Developmental distribution of the plasma membrane-enriched proteome in the maize primary root growth zone. Front. Plant Sci. 4, (2013).
  45. Bonhomme, L., Valot, B., Tardieu, F., Zivy, M. Phosphoproteome Dynamics Upon Changes in Plant Water Status Reveal Early Events Associated With Rapid Growth Adjustment in Maize Leaves. Mol. Cell Proteomics. 11, 957-972 (2012).
  46. Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Assimilate Partitioning in the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades at High and Low Irradiance. Plant Physiol. 90, 1201-1206 (1989).
  47. Schnyder, H., Nelson, C. J., Spollen, W. G. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .2. Dry-Matter Partitioning and Carbohydrate-Metabolism in the Elongation Zone and Adjacent Expanded Tissue. Plant Physiol. 86, 1077-1083 (1988).
  48. Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Carbohydrate Fluxes within the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 85, 548-553 (1987).
  49. Vassey, T. L., Shnyder, H. S., Spollen, W. G., Nelson, C. J. Cellular Characterisation and Fructan Profiles in Expanding Tall Fescue. Curr. T. Pl. B. 4, 227-229 (1985).
  50. Allard, G., Nelson, C. J. Photosynthate Partitioning in Basal Zones of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 95, 663-668 (1991).
  51. Spollen, W. G., Nelson, C. J. Response of Fructan to Water-Deficit in Growing Leaves of Tall Fescue. Plant Physiol. 106, 329-336 (1994).
  52. Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .1. Relationship to Genetically Altered Leaf Elongation Rates. Plant Physiol. 74, 590-594 (1984).
  53. Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .2. Relationship to Leaf Elongation Rates Modified by Nitrogen-Fertilization. Plant Physiol. 74, 595-600 (1984).
  54. Silk, W. K., Walker, R. C., Labavitch, J. Uronide Deposition Rates in the Primary Root of Zea-Mays. Plant Physiol. 74, 721-726 (1984).
  55. Granier, C., Inze, D., Tardieu, F. Spatial distribution of cell division rate can be deduced from that of p34(cdc2) kinase activity in maize leaves grown at contrasting temperatures and soil water conditions. Plant Physiol. 124, 1393-1402 (2000).
  56. Voothuluru, P., Sharp, R. E. Apoplastic hydrogen peroxide in the growth zone of the maize primary root under water stress.1. Increased levels are specific to the apical region of growth maintenance. J. Exp. Bot. 64, 1223-1233 (2012).
  57. Wu, Y. J., Jeong, B. R., Fry, S. C., Boyer, J. S. Change in XET activities, cell wall extensibility and hypocotyl elongation of soybean seedlings at low water potential. Planta. 220, 593-601 (2005).
  58. Macadam, J. W., Nelson, C. J., Sharp, R. E. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .1. Spatial-Distribution of Ionically Bound Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 872-878 (1992).
  59. Macadam, J. W., Sharp, R. E., Nelson, C. J. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .2. Spatial-Distribution of Apoplastic Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 879-885 (1992).
  60. Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inze, D. Variation in growth rate between Arabidopsis ecotypes is correlated with cell division and A-type cyclin-dependent kinase activity. Plant Physiol. 129, 854-864 (2002).
  61. Kavanova, M., Lattanzi, F. A., Schnyder, H. Nitrogen deficiency inhibits leaf blade growth in Lolium perenne by increasing cell cycle duration and decreasing mitotic and post-mitotic growth rates. Plant Cell Environ. 31, 727-737 (2008).
  62. Macadam, J. W., Nelson, C. J. Secondary cell wall deposition causes radial growth of fibre cells in the maturation zone of elongating tall fescue leaf blades. Ann. Bot-London. 89, 89-96 (2002).
  63. Schnyder, H., Nelson, C. J. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .1. Spatial-Distribution of Growth, Deposition of Water, and Assimilate Import in the Elongation Zone. Plant Physiol. 86, 1070-1076 (1988).
  64. Gastal, F., Nelson, C. J. Nitrogen Use within the Growing Leaf Blade of Tall Fescue. Plant Physiol. 105, 191-197 (1994).
  65. Vanvolkenburgh, E., Boyer, J. S. Inhibitory Effects of Water Deficit on Maize Leaf Elongation. Plant Physiol. 77, 190-194 (1985).
  66. Silk, W. K., Hsiao, T. C., Diedenhofen, U., Matson, C. Spatial Distributions of Potassium, Solutes, and Their Deposition Rates in the Growth Zone of the Primary Corn Root. Plant Physiol. 82, 853-858 (1986).
  67. Meiri, A., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Deposition of Inorganic Nutrient Elements in Developing Leaves of Zea-Mays L. Plant Physiol. 99, 972-978 (1992).
  68. Neves-Piestun, B. G., Bernstein, N. Salinity-induced inhibition of leaf elongation in maize is not mediated by changes in cell wall acidification capacity. Plant Physiol. 125, 1419-1428 (2001).
  69. Bouchabke, O., Tardieu, F., Simonneau, T. Leaf growth and turgor in growing cells of maize (Zea mays L.) respond to evaporative demand under moderate irrigation but not in water-saturated soil. Plant Cell Environ. 29, 1138-1148 (2006).
  70. Westgate, M. E., Boyer, J. S. Transpiration-Induced and Growth-Induced Water Potentials in Maize. Plant Physiol. 74, 882-889 (1984).
  71. Horiguchi, G., Gonzalez, N., Beemster, G. T. S., Inze, D., Tsukaya, H. Impact of segmental chromosomal duplications on leaf size in the grandifolia-D mutants of Arabidopsis thaliana. Plant J. 60, 122-133 (2009).
  72. Fleury, D., et al. The Arabidopsis thaliana homolog of yeast BRE1 has a function in cell cycle regulation during early leaf and root growth. Plant Cell. 19, 417-432 (2007).
  73. Vlieghe, K., et al. The DP-E2F-like gene DEL1 controls the endocycle in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 15, 59-63 (2005).
  74. Boudolf, V., et al. The plant-specific cyclin-dependent kinase CDKB1;1 and transcription factor E2Fa-DPa control the balance of mitotically dividing and endoreduplicating cells in Arabidopsis. Plant Cell. 16, 2683-2692 (2004).
  75. Baskin, T. I., Beemster, G. T. S., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).

Tags

Plant Biology kinematische analyse bladgroei eenzaadlobbige bladeren maïs celdeling celexpansie meristeem moleculaire bemonstering
Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Leaves
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprangers, K., Avramova, V.,… More

Sprangers, K., Avramova, V., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves. J. Vis. Exp. (118), e54887, doi:10.3791/54887 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter