Summary
Drosophila larven er et kraftig modellsystem for å studere nevrale kontroll av virkemåten. Denne publikasjonen beskriver bruk av lineære agarose kanaler for å lokke fram vedvarende anfall av lineær gjennomgang og metoder for å kvantifisere dynamikken i larve strukturer under repeterende krypende atferd.
Abstract
Drosophila larve gjennomgangen fremstår som en kraftfull modell for å studere nevrale kontroll av sensorisk atferd. Imidlertid er larvekrypende oppførsel på flate åpne flater komplekse, inkludert: pause, snu, og svingete. Denne kompleksiteten i repertoaret bevegelses hindrer detaljert analyse av hendelsene som oppstår under en enkelt krype skride syklus. For å overvinne denne hindringen, ble lineære agarose kanaler gjorde at begrense larve atferd til rett, vedvarende, rytmisk gjennomgang. I prinsippet, fordi agarose kanaler og Drosophila larve legemet er både optisk klare, bevegelsen av larver strukturer merket med genetisk kodet fluorescerende prober kan overvåkes i intakte, fritt-bevegelige larver. I det siste, ble larvene plassert i lineære kanaler og krypende på nivå med hele organismen, segment, og muskel ble analysert 1. I fremtiden kan larvene gjennomgangen i kanaler brukes for kalsium bildebehandling til å overvåke neuronal aktivitet. Videre kan disse fremgangsmåter anvendes sammen med larver av en hvilken som helst genotype og med en hvilken som helst forsker-utformet kanal. Således protokollen presentert nedenfor er bredt anvendelig for undersøkelser ved hjelp av Drosophila larven som en modell for å forstå motorisk kontroll.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å studere Drosophila larve krypende i detalj. Forsøk på bevegelse har spilt en viktig rolle i å utvikle og teste teorier om motorisk kontroll to. Tradisjonelt bevegelse har blitt undersøkt i akvatiske dyr (for eksempel igle, niøye, rumpetroll) 3. Den repeterende natur for bevegelse i disse dyrene har tillatt for studiet av rhythmogenesis, for analyse av de biofysiske hendelsene drivende bevegelse, og for overvåking av nevrale avfyring mønstre som følger bevegelse.
Bruken av Drosophila larver for studier av bevegelse presenterer en unik kombinasjon av fordeler fremfor andre modellsystemer: lettvinte genetikk, godt karakterisert utvikling, en kropp som er optisk klar på første og andre instars, og en pågående transmisjonselektronmikroskop rekonstruksjon av hele nervesystemet 4-6. Men Drosophila larve locobevegelse på flate åpne flater er noe komplisert inkludert pauser, snur, og meandrerende kryper 7. Denne publikasjonen presenterer en metode for å bruke lineære agarose kanaler for å lede Drosophila larve bevegelsesatferd slik at larvene utfører vedvarende, rett, rytmisk kryp atferd.
Studerer Drosophila larve oppførsel i agarose kanaler, i stedet for på flate oppførsel åpne flater, har flere fordeler. Først gjør det forskerne å spesifikt velge krypende atferd fra de mange bevegelser som er en del av larveatferdsrepertoar. For det andre, ved å justere bredden av kanalen i forhold til larvekroppsstørrelse, krypende hastighet kan reguleres. For det tredje, kanaler tillater for larven å bli sett fra dorsal, ventral, eller lateral side avhengig av hvor larven er lastet og orientert inne i kanalen. Denne allsidigheten i larve orientering tillater noen struktur av interesse å være kontinuerlig synlig under gjennomgangen. Fjerde,kanaler er mottagelig for bruk sammen med en lang rekke mikroskoper og målsettinger. For eksempel kan lineære kanaler brukes for lav oppløsning bildebehandling på lyse-feltet stereoscopes og / eller for høy oppløsning avbildning av sentrifuge-disc confocal mikroskoper 1. Femte, kan denne metoden brukes i kombinasjon med optogenetic / thermogenetic neuronale manipulasjoner i en hvilken som helst genetisk bakgrunn. Til slutt, fordi både larvekroppen (i første og andre instars) og agarose kanalene er optisk klart, kanaler kan brukes når du studerer dynamiske bevegelser, eller endringer i fluorescerende intensiteten av larve strukturer merket med genetisk kodet fluorescerende prober.
Metoden er beskrevet er egnet for detalj kinematiske studier av første og andre stadium Drosophila larve atferd. Denne publikasjonen analyserer dynamiske endringer i fluorescerende intensiteten av CNS under frem larvekryp å demonstrere bruken av kanaler og som en forløper til NeuRonal kalsium bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av larver
- En uke før innspillingen atferd, satt opp et kors (minimum 25 jomfruer og 5 menn). Opprettholde alle kors og avkom ved 25 ° C.
MERK: Temperaturen på dyrkningsforhold kan endres, men tidslinjen beskrevet nedenfor trenger å bli justert på kontoen for endringer i utviklingshastigheten. - 5 dager før opptaket, først i morgen, plasserer innlegg inn i en samling bur med en agar / juice cap og en skvett (0,5-1 ml) av gjær lim i midten av agar / juice cap.
- For å gjøre en samling bur, stikke hull i en 6 oz. firkantet polyetylen Drosophila flaske.
- For å gjøre agar / juice kapsler, bland 18 g agar med 600 ml vann i en konisk kolbe. I en separat kolbe blanding 20 g sukrose med 200 ml eplesaft. Mikrobølgeovn inntil faste stoffer blir oppløst. Kombiner og rør, slik at blandingen avkjøles til 60 ° C. Tilsett 20 ml 10% metyl-p-hydroksybenzoat i 95% etanol, og rør. Legg ~ 7ml til den nedre halvdelen av en 35 x 10 mm runde petriskål. Tillat agar / saft til å størkne i 1 time ved RT. Oppbevar ved 4 ° C.
- For å gjøre gjær lime, legge like volumdeler tørrgjær og vann. Oppbevar ved 4 ° C.
- Sjekk helsen larve samlinger.
- I morgen, 4 og 3 dager før opptak, ta av lokket og plasser en ny hette på buret. Endre caps på samme tid hver dag for å få en 24-timers samling av egg og nyklekte larven.
- Etter hvert hetten er fjernet, undersøke den for å se hvor mange egg korset er legging. Forvent mellom 500-2,000 egg. Juster antall voksne, om nødvendig.
MERK: Noen egg burde ha klekket til larver, og den nylig klekket larver vil bli funnet unna gjær lime. - Alder hver cap i 24 timer. Re-undersøke cap å avgjøre om larvene er sunt.
MERK: De fleste eggene skulle ha klekket til larver, og larvene skal ha gjennomgått i dereast lim. Tegn på dårlig helse inkluderer et stort antall unhatched egg, døde larver kropper unna gjær lim, og larver med betydelige mørke flekker i magen, noe som indikerer en immunreaksjon. Dersom larvene er usunn, endre buret, lage fersk caps / gjær lim, og sjekk genotype. - Kast den gamle caps.
- Samle larver for atferds opptak.
- At både to og en dag før opptak, ta av lokket og erstatte med en ny lue.
- Merk hver fjernet hetten og holde ved 25 ° C. Dette vil gi et iscenesatt rekke larver for atferds opptak. Larver fra nyfødt (0-4 timer posthatch) gjennom andre stadium (24-48 timer posthatch) kan anvendes i kanalene. Spar landskamper for opptak på påfølgende dager.
- Kast alle caps etter 48 timer.
- Om nødvendig, gjenta trinn 1.4.1-1.4.3 for opptil fem ekstra d. Etter at færre befruktede egg blir produsert.
- Forbered lineære kanal PDMS (Polydimethylsiloxane, en silikon elastomer) støpeform (figur 1A). PDMS støpeformer er tilgjengelige fra Heckscher lab på forespørsel.
- Rens støpeformen med isopropylalkohol. Lufttørke, DAB tørr med laboratorie våtservietter, eller bruke trykkluft på boks.
- Plassere støpeformen inn i en 10 cm petriskål lokk eller en annen beholder.
- Forbered og hell agarose løsning.
- Lag en 3% agarose løsning i vann (3 g i 100 ml) av mikrobølgeovnen til den er helt oppløst.
- Avkjøl til 55 ° C, slik at boblene stiger til overflaten.
- Hell agarose blandingen i petriskål som inneholder støpeformen, slik at støpeformen bare dekket. La agarose sett før stivnet.
- Fjern de agarose kanaler fra støpeformen. Trim kantene av agarose-plate med et barberblad.
- Sett kanals i en 10 cm petriskål nedsenket i vann. De kan oppbevares ved 4 ° C i 7 dager.
3. Legge et Larva inn i en kanal til Record Behavior
MERK: Hvis du lagrer kanaler ved 4 ° C, lar kanaler for å komme til romtemperatur før du bruker for atferds opptak.
- Bruk en ren barberblad for å kutte en eneste kanal fra de som er fremstilt i trinn 2 (figur 2A).
- Bruke en pinsett for å plassere kanalen rillede side opp på en glass dekkglass (figur 2B). Størrelsen og tykkelsen på dekk avhenger av den spesifikke omfang som brukes for avbildning.
- Bruk fine tang til å velge en larve fra agar / juice cap fremstilt i trinn 1 og sett inn i cut-kanal (figur 2C).
- Ikke klem på larven. Plukk den opp forsiktig med tuppen av tang tine. Det er også mulig å manipulere larve med en pensel med en fin spiss.
MERK: Dette er viktig som larver er svært senmerksomme på berøring. Hvis de ikke håndteres med forsiktighet, kan nociceptive responser dominere deres oppførsel i løpet av de første sekundene av forsøket. - Vask larvene ved kort å senke dem i vann.
- Etter å ha plassert larven på cut-kanal, bruke tuppen av tang tine å forsiktig erte larven inn i kanalen grove.
MERK: For de fleste anvendelser bredden av larven og bredden av kanalen skal samsvare. Den gjennomsnittlige bredden av larver på ulike stadier av utviklingen følger: 0 hr posthatch - 140 mikrometer, 24 timers posthatch - 180 mikrometer, 48 hr posthatch - 320 mikrometer, 72 timer posthatch - 500 mikrometer, 96 timer posthatch - 750 mikrometer 8. Kanaler kommer i følgende bredder: 100, 150, 200, 250 og 300 nm, og alle kanaler er 150 mikrometer dypt. - Med tuppen av en pinsett tine eller pensel for å justere posisjonen til larven i kanalen. Det kan være orientert i enhver retning: ventralopp, ventral ned, ventral til den ene side, avhengig av hvilken struktur er som skal avbildes.
- Ikke klem på larven. Plukk den opp forsiktig med tuppen av tang tine. Det er også mulig å manipulere larve med en pensel med en fin spiss.
- Bruk pinsett, forsiktig snu kanalen i løpet slik at larven er nå på glasset. Plassere en eller to dråper vann ved endene av kanalen, slik at det fylles med vann (figur 2D).
- Løft forsiktig på sidene av kanalen for å fjerne eventuelle luftbobler.
- Juster retningen larven. For å gjøre dette, skubber kanalen, men ikke glasset å rulle larven. Hvis dette ikke endre retningen, ta av dekselet glass og justere larve posisjon. Larven er klar til å bli avbildet.
- Bilde kanalen / dekkglass på et invertert mikroskop. Hvis bildebehandling på en oppreist mikroskop, bare snu kanalen / dekkglass.
4. Mål Funksjon av interesse i Behavioral Recording
- For en struktur av interesse (f.eks, hale, CNS), måle en funksjon av interesse (f.eks, Fluorescens-intensitet, plassering) over tid.
MERK: Strukturer som hode og hale kan manuelt annotert. For eksempel, kan hodet bli identifisert som inneholdende mørke H formet munn kroker, og halen kan identifiseres som inneholdende bakre tracheal spiricles. Denne artikkelen fokuserer på nerve ledningen. Bruk nevronale GAL4 linjen elav-GAL4 å drive et UAS-myr-GFP transgenet (elav> GFP) 9,10 til fluorescerende merke sentralnervesystemet (CNS). CNS inneholder to fremre hjernelapper som er festet til nerveledning, som strekker seg til den bakre (figur 3). - Mål pikselintensiteten av nerveledning (f (NC)) ved hvert tidspunkt (t). Nedenfor beskriver en manuell annotering tilnærming, men dette trinnet kan bli automatisert.
- I Fiji (eller lignende programvare) i "Analyze" -menyen bruke "Set Målinger ..." dialogboksen for å rapportere den gjennomsnittlige verdien for grått og SKIVEe posisjon.
- Tegne manuelt en boks i midten av nerve ledningen i den første rammen i filmen (figur 3). Dette trinnet kan også være automatisert med bilde segmentering og registrerings algoritmer.
- Bruk "tiltak" i 'Analyser' menyen for å rapportere gjennomsnittlig pikselintensiteten i eske regionen av interesse. Dette genererer en "Resultater" -vinduet.
- I neste bilde, manuelt flytte boksen uten å skalere ved hjelp av piltastene. Bruk "Mål" kommandoen igjen. De oppdaterte resultatene vil bli vist i "Resultater" -vinduet. Gjenta dette trinnet for hver ramme av interesse.
- Redd "Resultater" ved hjelp av "Lagre som ... 'kommandoen fra Fil-menyen. Resultatene vil bli eksportert som en XLS-fil.
5. Analyser Målinger
- Normaliser hver f (NC) verdi til en verdi mellom 0 og 1 (z (t) </ Em>).
- I regneark (eller andre program), åpne Results.xls filen. Denne filen vil ha to kolonner som representerer rammenummeret og gjennomsnittlig fluorescens intensitet.
- Foreta en ny kolonne og bruke formelen z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) å generere en normalisert verdi fluorescens svarende til hvert tidspunkt.
- Bestem skride periode for hvert skritt i opptaket.
MERK: En stegsyklus er måleenheten for repeterende hele kroppen bevegelse for fremover (og bakover) krypende. Ved kongress en Forward steg starter (og slutter) med forover bevegelse av halen, hodet, og andre indre organer som tarmen eller CNS en.- Inspisere manuelt atferds opptak og registrere innvielses ganger (i) av hvert skritt (i (Stride Cycle [n])).
MERK: I eksempelet nedenfor, bevegelse fremoverav CNS som initiering av en skrittsyklus ble anvendt (figur 3). - For hvert skritt beregne periode: Δ t (Stride syklus) = i (Stride Cycle [n + 1]) -i (Stride Cycle [n]).
- Inspisere manuelt atferds opptak og registrere innvielses ganger (i) av hvert skritt (i (Stride Cycle [n])).
- Beregn prosentandelen av skritt syklus medgått for hvert tidspunkt av opptaket.
- Lag en ekstra kolonne i regnearket som representerer tiden som er gått siden starten av en skritt syklus (c). Sett gang siden skride initiering til null ved oppstart av hvert skritt (c (Stride Cycle [n]) = 0). Juster ganger etter oppstart tilsvarende.
- Lag en ekstra kolonne i regnearket som representerer prosent skride syklus gått (% skride syklus) Del justerte ganger av løpeperioden og multiplisere med 100 for å konvertere til prosentandel av skrittlengde syklus utløpt.% Skride syklus = (c (Stride Cycle [n] )) / (Δ t (Stride syklus) * 100).
6. Generer Polar Koordinere Tomter å representere Dynamics of Structures av interesse over Crawl Cycle
- I MATLAB, bruk 'Import Data' dialog i kategorien Hjem for å importere den oppdaterte Results.xls.
- Lag en ny array "Theta" inneholder prosent skride sykkel verdier (% skride syklus). ( "Theta = Var1" hvor Var1 representerer% skride syklus).
- Lag en ny array "Rho" inneholder normalisert fluorescens verdier (z (t)). ( "Rho = Var2" hvor Var2 betegner z (t)).
- Bruk 'polarplot' befaling om å gjøre polare koordinere tomter med prosent skride syklus som vinkelen, og fluorescens som radius ( "polarplot (Theta, Rho)").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikkelen beskriver en fremgangsmåte for føring av Drosophila larve oppførsel ved hjelp av agarose-kanaler og for måling av dynamikken i larve strukturer over et gjennomsøking syklus. Larver i lineære kanaler utføre vedvarende anfall av rytmisk gjennomgangen (figur 3). Fordi både larver og kanaler er optisk klart, kan kanaler brukes med larver uttrykker fluorescerende prober uttrykt i noen struktur av interesse. Vi registrerte larver uttrykker GFP i alle nevroner (elav-Gal4 / +; UAS-myr-GFP / +) og overvåket de dynamiske endringer i fluorescens intensitet i nerve ledningen over gjennomgangen syklus. Vi viser at det CNS beveger seg fremover på nesten samme tid som larve hode og hale (figur 4A-B). Som en bølge av muskelkontraksjon passerer langs kroppens akse, beveger CNS inn og ut av planet for fokus å forårsake fluorescens av nerven ledningen for å endre (figur 4). For å kvantifisere chan GES i nerve ledningen fluorescens intensitet for flere fremskritt i flere dyr vi representert data på en polar koordinat plott (figur 4C). Plotting av dataene på polare koordinatsystem plott viser at dynamikken i nerveledning fluorescens over skride syklus følger et reproduserbart mønster.
Figur 1: Design av lineære kanaler i guide Drosophila Larve Crawling Behavior (A) Utformingen av mikrofluid enhet som brukes til å lage lineære agarose kanaler vises.. Breddene av kanaler i denne enheten varierer 100-300 nm i trinn på 50 mikrometer. Dybden er 150 mikrometer. (B) En Drosophila larven er lastet inn i en agarose-kanal. En rygg visning er vist med anterior (hode) til høyre. Scale bar = 200 mikrometer.4892 / 54892fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Diagram Hvordan legge en Larva inn i en kanal Se protokoll avsnitt 3 for detaljer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. En fluorescens-merket Drosophila Larva Utfører Vedvarende, Rytmisk, Linear Crawling når den plasseres i en agarose kanal på venstre, en skjematisk av en larve uttrykker GFP i alle nevroner (elav> GFP) blir vist. En boks viser det område hvor fluorescens-intensiteten av nerveledning (tegnes av sinlangstrakte morfologi) kan måles. Til høyre er et eksempel på en larve gjennomgang gjennom en kanal med ett sekunds intervaller. En rygg visning er vist med anterior opp. Pilene viser oppstart av en skrittlengde. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Dynamics av fluorescens Endringer i Nerve Cord Over the Crawl Cycle er presentert på Polar Koordinere Tomter (A) Et diagram av et enkelt skritt.. Prosenttallene til prosent av skride syklus fullført. Ved konvensjonen fremoverbevegelse av halen, hodet og innvendige organer som CNS markerer initiering av en skrittlengde (eller 0% av stegsyklus). Merk at CNS (hvit) beveger seg forover og bakover, samt opp og ned. En side view er vist med fremre til høyre. (B) En kymograph viser bevegelse av hode, hale, og CNS. Legg merke til at fluorescensintensiteten av nerve ledningen under skride syklusen er dynamisk. (C) en polar koordinat plott viser de dynamiske endringer i normalisert fluorescensintensitet av nerve ledningen over skride syklusen. Hver prikk representerer en normalisert fluorescens intensitet av en enkelt larve på ett tidspunkt (n = 3 larver, 3 skritt hver). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En microfluidic enheten ble bygget for å gjøre lineære agarose kanaler som rommer Drosophila larver (figur 1). Når Drosophila larver er plassert i disse lineære agarose kanalene deres atferdsrepertoar er begrenset til gjennomgang, som gjør det mulig for detaljert observasjon av dynamikken i larve strukturer over gjennomgangen syklus.
En vellykket opptak oppstår når en larve utføre en serie av rytmiske skritt (figur 3). Hvis dette ikke skjer, se etter hindringer som en luftboble i kanalen, og sjekke helsen larven. Et annet viktig element for en vellykket opptak er at larven er orientert optimalt å visualisere strukturer av interesse. Dersom larven ikke er riktig orientert, eller hvis larven kryper ut av kanalen, bare å fjerne dekkglass og Monter larven. I vår erfaring, ~ 20% av larvene i utgangspunktet montert avkastning gode atferds opptak without justering.
I det siste, ble målinger av posisjonen av larver strukturer som for eksempel munn krok, gut, og mage segmentene under gjennomgang oppførsel. For å visualisere bevegelsen av disse strukturene over kryp skride syklus, ble polare koordinere tomter generert. I denne utredningen ble fluorescens intensiteten av nerveledning målt og polare koordinere plott brukes til å visualisere dynamikken i fluorescens over kryp skride syklus (figur 4). Det er flere fordeler med å representere dataene på polar koordinere tomter: det eliminerer sneglefart som en variabel, kan det oppsummere data fra mange dyr og mange fremskritt, og det tillater visualisering av både generelle trender og variasjoner i data 11. Spesielt, er det mulig å måle dynamikken i en hvilken som helst fluorescens-merket struktur av interesse. I prinsippet er denne analysen gjelder for sporing av hvilken som helst type av dynamiske endringer som oppstår over en gjennomsøking syklus. Det er et bredt spekter av applikasjoner til metodene beskrevet i dette dokumentet. I det siste har lineære agarose kanaler blitt brukt til å spille inn larve atferd på hele organismen, segment og enkelte muskel nivå 1. Disse dataene viste at larver bruke en "visceral-stempler er" mekanisme for både forover og bakover krypende, og de tillot neuromuskulære mekanismen kjøring både forover og bakover kryp skal fastsettes en. I fremtiden kan forskerne bruke kanaler for å studere gjennomgangen i ulike genetiske bakgrunn. I tillegg bør det være mulig å benytte kanaler for å analysere aktiviteten av larver nerveceller ved hjelp av kalsium avbildning under gjennomgang. Dette bør føre til forståelsen av hvilke nevroner brann i fase med bestemte bevegelser av gjennomgangen syklus. Endelig, er det ingen grunn til at kanalene må følge den lineære presentert i dette papir; ved hjelp av kanaler med ulike dimensjoner vil uten tvil få svar på en VARiety på spørsmålet om Drosophila larve bevegelse og motorisk kontroll som helhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| Isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. The visual display of quantitative information. , Graphics Press. Cheshire, CT. (2004).
