Introduction
근육 낭비는 암, 패혈증, 간, 간경변, 심장 및 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환, 에이즈 등의 다양한 임상 조건의 심각한 합병증이다. 특히, 근육 쇠약 한 암 환자의 50 % 이상에서 명백하다. 인해 및 / 또는로부터 골격근 단백질 분해 시스템의 과도한 활성화로 증가 단백질 분해로부터 암 결과 골격근 상실 단백질 합성 (6) 감소 하였다. 지방 분해는 지방 조직의 붕괴를 초래 또한 명백하다. 임상 악액질 감소 된 품질 및 수명의 길이와 연관된 20 사망 원인으로 추정된다 - 암 환자 (7)의 30 %. 최대한 가깝게 인간 질환과 유사한 실험 모델의 사용은 유익 할 것이다. 최적의 동물 모델 높은 재현성과 다를 치료에서 제한된 간섭 및 예측 인자 특징일반적으로 임상 상태 (8)과 관련된 다이어트, 성별, 유전 적 배경. 새로운 방법은 암의 발달에 민감한 유전자 변형 마우스를 사용하는 것이지만, 지금까지 암 악액질은 암 세포 또는 발암 주입 이식 특징 동물 모델에서 주로 연구되어왔다.
C26 암종 베어링 마우스 암 악액질 2,5의 잘 특징으로 널리 사용 모델을 나타내는 (도 26 - 결장 선암 함). 주로 고급 지방 및 단백질 이화 9 체 근육 감량 C26에서 종양의 성장 결과. 일반적으로, 몸 전체 중량 대비 10 % 종양 중량은 골격근 질량 20-25 %의 감소 및 지방 3,10의 큰 고갈과 연관된다. 비장 비대 및 또한 급성기 반응의 활성화 및 프로 infla의 높이와 함께, 종양 성장을 관찰mmatory 사이토 카인 수준 3,11. 이들 중, 이곳은 IL-6 사이토 카인이 아마 악액질 (12)의 유일한 유도제없는 경우에도 C26 모델에서 근육 쇠약을 매개에서 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 상승 된 IL-6는 JAK / STAT3 경로의 활성화를 통해 근육 위축이 발생하고,이 전사 인자를 억제하는 근육 3,4- 낭비를 방지 할 수있다.
C26에 의한 근육 낭비하는 동안, 근육 위축의 많은 조건에서와 같이 근육 질량이없는 세포 사멸 또는 섬유 (13)의 손실을 크게 근육 섬유에서 근육 단백질 함량의 감소를 통해 손실됩니다. C26 악액질에서 작은 단면적을 향한 이동은 당분 및 산화 섬유 둘 모두에서 관찰된다. 이는 또한 감소 된 근력 5와 일치한다. 전세계 여러 그룹은 암 CAC 대한 근 소모성 새로운 중재자 또는 임상 적 약물을 발견하기 위해 C26 모델의 장점을 찍은hexia. 그러나,이 모델의 사용을위한 다양한 방법이 획득 된 데이터의 일관성에 관한 문제를 제기하고 다른 실험 조건에서 재현성 장벽 포즈보고되었다. 여기에서 우리는 표준화 및 재현성 데이터를 산출 암 악액질의 연구를위한이 모델의 전형적인 사용을보고합니다.
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Protocol
윤리 정책 : 상기 토머스 제퍼슨 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 의학의 인디애나 대학에 의해 승인 된 기술 된 모든 연구.
1. C26 세포 성장 및 준비
- 완전 성장 배지를 C26 대장 암 세포 (오하이오 주립대 병원 (OSUMC))를 구하여 준비 (즉, 높은 글루코스 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 10 % 태아 소 혈청 (FBS 함유), 1 mM 피루브산 나트륨, 1 % 글루타민, 1 % 스트렙토 마이신 / 페니실린).
주 : 더 실험 간 재현성을 허용하기 위해서는, 가능한 한 낮은 통로 C26에서 세포를 사용하는 것이 바람직하다. - 완전 성장 배지로 플라스크에 50,000 세포 / cm 2 판 시판 세포 계수기를 사용한다. 서브 컨 플루 언트 될 때까지 CO 2, 37 ℃에서 가습 분위기 중에서 부화 5 %. 이전에 높은 밀도를 배양하지 마십시오엔트 분화 및 세포 표현형의 표류.
- 제 1 통로 후, 판 충분한 세포는 동물의 계획 수에 이식한다. 세포 이식 당일, cm 2 당 0.02 ml의 0.25 % 트립신 EDTA 용액 트립신 처리에 의해 세포를 해리 트립신 1 ㎖ 당 새로운 배지 중 적어도 3 ㎖를 첨가하여 트립신을 중화 세포 / ml의 세포 농도를 결정 및 멸균 PBS에서 실험 (마우스 당 1 × 106 세포)을위한 필요한 셀들의 개수를 재현 탁.
주 : 밀도 / cm 2 내지 약 500,000 세포 때 C26 세포가 포화 상태에 도달한다.
2. 마우스
- 그룹으로 성인 CD2F1 마우스 (생후 최소 8 주) 랜덤 (일반적으로 제어하고 종양 소지자) 최소한 n = 6 그룹 당과.
참고 : C26 종양뿐만 아니라을 Balb / c 마우스에서 성장합니다. 그러나, 우리의 경험을 바탕으로, CD2F1 마우스는이 특정 종양 모델에 대한보다 다양하고 경제적 호스트를 나타냅니다. 게다가,임상 설정 및 14-16, C26의 악액질에 대한 응답에서 성별 차이도 17을 관찰 할 수있다 낭비 암 관련 근육의 다른 실험 모델에보고 된 연구 결과와 유사 (또한 표 1 참조). - 흡입 (산소 3 %)로 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취. 배타적 종양 접종을 수행하는 데 필요한 시간 동안 마취하에 동물을 유지한다. 반드시 마우스가 몸의 열 손실을 방지하기 위해 가열 패드 위에 놓여 있는지. 종양 주입 절차를 시작하기 전에 부드럽게 뒤 발가락을 곤란하게하여 적절한 마취를 확인합니다.
주 :이 절차에 (일반적으로 몇 초)의 지속 시간으로 인해, 수의학 눈 연고의 사용이 필요하지 않습니다. 동일한 이유로, 모의 동작을받은 대조군 동물은 체중을 기대하지 않는다. - 신속 t를 함유하는 용액 250 μL를 투입, 26 게이지 바늘로 멸균 한 ml의 인슐린 주사기를 사용umor 피하 및 intrascapularly 마우스의 지방 패드에있는 세포.
참고 : 제어 동물 intrascapularly 지방 패드에 멸균 생리 식염수 250 μl를 받게됩니다. - 새장에있는 동물 등을 놓습니다. 그것은 부드러운 조작에 응답 할 수 및 복원력 반사를 회복 할 때까지 직접 한 번 이상 매 15 분 마우스를 관찰합니다.
주 : 무인 마우스를두고 고체 기판을 포함하는 따뜻한 복구 케이지에 보관하지 마십시오. 완전히 마취에서 회복 될 때까지 또한, 동물의 방에 마우스를 반환하지 않습니다. 일반적으로 마우스는 연구자가 개별 음식 섭취량을 평가하는 것을 목표로하지 않는 개별적으로 수용 할 필요가 없습니다. 이 경우 자동화 대사 케이지의 사용이 가능하지 않은 경우, 음식 섭취의 수동 녹화 아마도 매일 매일 같은 시간에 수행되어야한다. - 매일 쥐를 확인하고 자신의 체중을 기록한다.
참고 : 몸 상태 점수를 기록하고홈 케이지 행동 치료 연구 (18)에 유용 악액질과 질병 행동의 정도를 구별 할 수 있습니다.
3. 안락사 및 혈액 채취
- 컨트롤에 비해 종양 호스트의 체중 손실이 5 %, 10 % 또는 15 %의 초기 체중에 비해 (경증, 중등도, 중증 악액질, 각각)에 도달하면, 마우스를 안락사.
주 : 하나의 그룹은 모든 그룹이 안락사되는 시간에 10 %의 중량 손실에 도달 할 때까지 통상의 실험을 수행한다. 체중 감소는 종양 포함한 체중을 측정하여 평가된다. - 이소 플루 란 전신 마취 (산소 3 %)에서 마우스를 놓습니다. (- 1.5 ml의 약 1) 심장 천자에 의해 혈액을 그립니다.
- K 2 -EDTA (18 mg)을 빈 튜브에 혈액을 수집하고 얼음에 배치합니다. 원심 분리기 혈액 (4 ° C에서 15 분 동안 2,000 XG) 및 플라즈마 / 혈청을 수집합니다.
- C에 의해 마우스를 안락사ervical 전위. 조직의 절단 및 장기 컬렉션에 진행합니다.
4. 조직과 기관 절제술
참고 : 생화학 적 또는 분자 생물학 분석에서 조직의 사용을 위해, 각 기관 및 조직의 무게를 사전 레이블 cryotubes에 즉시 조각을 배치 할 계획입니다. 스냅 -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 동결.
- 모피 조직 샘플의 오염을 방지하기 위해서, 전신에 걸쳐 70 % 에탄올을 스프레이.
- 부정사 위치에 해부 침대에 마우스를 놓고 상승 뷰렛 클램프에 발을 부착하여 수직으로 다리를 확장 할 수 있습니다.
- 뒤몽의 집게와 하체의 피부를 잡고 부드럽게 하체의 기본 근육 배를 노출, 피부와 근막을 제거하기 위해 곡선 미세 가위를 사용합니다.
- 측면 및 내측 후방 대퇴골에 과두 및 자사의 삽입에 그 기원에 의해 후방 하체에있는 비복근 근육을 확인종골 건을 통해 종골.
- 비복근의 종골 건 잘라 진행합니다. 뒤몽 포셉과 비복근의 선단을 잡고 그 기원을 향해 근육 배를 당기십시오. 가위를 이용하여 대퇴골에 최대한 가깝게 원점 근육 잘랐다. 접시에 근육을 놓습니다. 즉시 달아 액체 질소에서 튜브를 동결.
참고 : 비복근과 함께 가자미 근육을 절제하지 않도록해야합니다. 그가 발생하면, 조심스럽게 부드럽게 집게로를 당겨 가자미를 제거합니다.
- 비복근의 종골 건 잘라 진행합니다. 뒤몽 포셉과 비복근의 선단을 잡고 그 기원을 향해 근육 배를 당기십시오. 가위를 이용하여 대퇴골에 최대한 가깝게 원점 근육 잘랐다. 접시에 근육을 놓습니다. 즉시 달아 액체 질소에서 튜브를 동결.
- 식별하고 경골과 원위 건을 통해 내측 설형 문자에서의 삽입의 외측 표면에 그 기원에서 경골근 근육을 절제로 이동합니다.
- 영향력을 갖기 위해, 집게 손가락과 엄지 손가락으로 자리 잡고 다리를 길게. 즉시 경골의 표면 원위부 건에서 뒤몽 포셉의 끝을 삽입하고 같은 BL이있는 집게를 이동UNT면은 기본 결합 조직에서 경골 근육 배를 분리 할 수 있습니다.
- 미세 곡선 가위를 사용하여 원위 건 절단 후 경골에 가능한 한 가깝게, 원점에서 근육을 잘랐다.
- 단지 다이어프램 위의 절개를 정지의 하복 지역에서 시작하는 시상 절개를 수행하고, 상복부 지역 우량 이동하여 복강을 엽니 다.
참고 : 절개의 깊이는 복부 근육 벽과 기본 복막 근막을 위반하기에 충분합니다. - 조심스럽게 무딘로 만들어진 집게로 파악하여 간을 제거하고 공동으로 간을 준수하는 혈관이나 결합 조직을 멀리 해부 미세 곡선 가위를 사용합니다. 뒤에 어떤 로브를 떠나지 않도록주의하십시오. 달아 액체 질소에서 튜브에 간을 동결 스냅.
- , 무딘 스쳐 집게를 사용하여 장을 멀리 이동 한 다음 제거 섬세하게 노출 및비장. 무딘 밀고 집게로 부드럽게 비장을 잡고 공동으로 비장을 준수하는 모든 결합 조직이나 혈관을 멀리 해부 미세 곡선 위의 후면 또는 무딘면을 사용합니다. 달아 액체 질소에서 튜브를 동결 스냅.
- (여성의) (수컷) 부고환에 인접 또는 자궁 성선 지방 패드를 확인합니다. 조심스럽게 무딘 스쳐 집게와 함께 부고환 지방 패드를 잡고 공동에서 조직을 잡아 당깁니다. 미세 곡선 가위를 사용하여 지방 패드에 부착 될 수있는 생식선 조직을 절취. 지방 패드를 달아 액체 질소에서 튜브를 동결 스냅.
주 : 일반적으로,이 지방 세포는 마우스에서 전체 체지방 질량 대표 간주 악액질로 중량 감소된다. 기타 지방 패드 마찬가지로 식별 해부 제거 및 칭량 할 수있다. - 동물의 가슴을 열 곡선 미세 가위를 사용합니다. 존스 양 측면 테두리에 부착 된 갈비뼈를 절단ernum. 흉골을 제거합니다. 포셉 두 쌍을 사용하여, 흉곽의 양쪽을 잡고 흉강을 열고 옆으로 양쪽을 잡아 당깁니다.
- 섬세 포셉과 마음을 잡아 당깁니다. 조심스럽게 좌심방에서 대동맥을 절단하여 곡선 미세 가위로 마음을 절제. 섬세 일부 흡수 용지에 그것을 블로 팅에 의해 잔류 혈액의 기관을 비우해야합니다. 달아 액체 질소에서 튜브를 동결 스냅.
5. 근육 냉동 및 설치
- 액체 질소로 펜탄을 포함하는 소형 플라스틱 비이커 (50 ㎖)의 하부 절반을 담금. 이 약간 점성이있게하여 백색 고체 적층 라이닝을 비커의 내부를 형성하는 경우 펜탄 사용할 준비 (온도 : -160 ℃).
참고 : 항상 청동, 알루미늄 손 도구를 nonsparking 사용합니다. 제품의 증기를 흡입하지 않도록. 적절한 환기와 함께 사용합니다. 유출 처리 및 환기가 불가능하거나 impractic 경우알은, 적절한 호흡 보호구를 착용 할 것. - 이소 펜탄에 잠시 (10 초)를 침지하여 척 (코르크)에 일부 포함 매체를 동결.
- 섬유의 배향을 유지하고 단면을 허용하기 위해 코르크 대하여 수직 힘줄에 의해 그것을 유지함으로써 근육 (예., 경골이나 비복근)를 핸들.
- 조심스럽게 냉동 매립 매체 위에 신선한 근육의 단부를 위치.
주 : 근육이 붙어 있습니다. 완전히 매체를 삽입과 근육을 둘러싸하지 않는 것이 중요합니다. 이 단면적이어서 대한 수직 배향을 유지하는 것도 중요하다. - 이소 펜탄 욕조에 부착 된 근육을 가진 척 (- 시편 크기와 조성에 따라, 15 초 보통의 동결 시간이 7) 찍어.
참고 : 냉동 솔루션에 집중 완전히 표본을 동결하는 데 필요한 것보다 더 지속되지해야합니다. 너무 오래 의지 FRAC 냉동너무 짧은 시간이 얼음 결정의 형성을 야기 반면, 조직 블록 진짜야. 잘 고정 된 표본은 백악질 흰색 될 것입니다. - 시편을 고정한 후, 작은 플라스틱 가방이나 시료 튜브 (50 mL)에 배치하고 즉시 -80 ℃에서 또는 액체 질소에서 냉동고에 보관.
원시 데이터 6. 분석
- (FBW)를 생쥐의 크기 변화를 제어하는 최종 체중을 정상화하기 위해; 종양이없는 체중; 및 카 커스, 오르간, 초기 체중 (IBW) 상기 (g로 표현) 조직의 무게 및 "중량 / 100 mg의 IBW"로 표현한다.
참고 : 또는 일부 연구자들은 경골의 길이에 근육 질량을 정상화. - 데이터 분석을위한 소프트웨어를 사용합니다. 정규화 된 가중치의 평균과 SD를 찾을 수 있습니다. 컨트롤 및 C26 베어링 쥐 사이의 짝이 학생의 t- 테스트와 통계 분석을 수행합니다.
참고 : 결과는 IBW (몸에 상대적으로 제시 될 수있다종양이없는) FBW, 종양, 기관 및 조직의 무게.
7. 근육 단면
- 약 -23 ° C에 저온 유지 장치 내부 챔버의 작동 온도를 설정합니다.
- 작동 온도 (몇 시간이 충분해야한다)에 순응하는 (이전에 -80 ° C에 저장) 시편을 허용합니다.
- 잘라 여러 시편 (바람직하게는 전 경골근 또는 비복근 근육)과 유리 슬라이드에 그들을 수집의 8 μm의 두께 섹션.
참고 : 근육의 중간 배꼽 부위에 부분을 잘라. 또한, 정확도를 위해, 장착 축에 수직 섹션을 자른다. - 그라 이오 스탯 챔버 내부의 유리 슬라이드를 유지합니다. 목적은 IF / IHC 연구 또는 효소 염색을 수행하는 경우이를 해동시키지 마십시오.
- 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
라미닌 면역 형광에 의해 근섬유 크기의 8. 평가 (대안 1)
(19)를 결정합니다. 근육 단면의 H & E 염색 형태의 분석을위한 가치있는 편리한 방식을 나타내고 있지만,는 IF 방법 (14)의 사용은 훨씬 빠르게 및 H & E 기반 방법보다 알맞은 더 정확하다. H & E 방법은 아래에 설명되어 있습니다.
- 그라 이오 스탯 또는 -80 ° C에서 저장하거나 조직 절편을 제거하고 실온으로 평형 수 (약 5-10 분).
주 : 생쥐에서 발생하는 일차 항체와 연관된 비특이적 상호 작용을 피하기 위해서는, 어느 이용 항체는 다른 종에서 발생하는 또는 시판되는 "마우스에서 마우스"면역 키트를 활용하는 것이 바람직하다. - 사전 멋진의 섹션을 빠져에드 메탄올 (-20 ° C) 10 분.
- 5 분 동안 PBS 1X 실온에서 섹션을 씻으십시오.
- PBS를 제거하고 슬라이드에 섹션을 둘러싸 면역 애플리케이션을위한 펜을 사용합니다. 임의의 지점에서 절 완전히 건조하게하지 마십시오.
- RT에서 1 시간 동안 부분에 - (8 % FBS PBS 또는 PBS 중 5 % 염소 혈청 5) 적합한 블로킹 완충액을 적용한다.
- 차단 버퍼를 제거합니다.
- 습기 챔버에서 토끼 항 라미닌 (1:30)을 또는 실온에서 2 시간 동안 부분에 버퍼를 차단에서 마우스 항 - 디스트로핀 (1:30)을 차 항체 (또는 밤새 4 ° C에서)를 적용합니다.
- 5 분 동안 1X PBS로 섹션을 씻으십시오.
- 세척 버퍼를 제거하고 5 분 동안 1X PBS에 다시 섹션을 씻는다.
- 세척 완충액을 제거하고 적절한 형광 이차 항체 적용 RT에서 1 시간 동안 습윤 챔버에 섹션 (1 버퍼 블로킹 1000).
- 이차 항체를 제거하고 5 1X PBS로 섹션을 씻어분.
- 세척 버퍼를 제거하고 5 분 동안 1X PBS로 세척을 반복합니다. 세척 완충액을 제거하고, 수계 매체를 사용하여 커버 유리 부분을 커버.
- 스테인드 섹션의 디지털 이미지를 사용하여 근육의 형태 학적 특징을 확인합니다. 이를 위해 대한 반전 형광 현미경을 사용하는 IF 부 (10 배 또는 20 배 배율의 대물 렌즈가 적합), 디지털 카메라 및 이미지 캡처 소프트웨어와 함께. 각 디지털 이미지의 눈금 막대를 배치 - CSA에의 정량을 용이하게하기 위해 (20 ~ 30 랜덤 필드는 각 근육 섹션을 권장합니다). 이미지는 ImageJ에 프로그램을 사용하여 이미지 분석 소프트웨어와 호환되도록 .TIF 형식으로 저장되어야한다.
- endomysium (20)의 형광 차 항체의 존재를 통해 수축성 조직 (근섬유 크기)에서 결합 조직을 구별하기 위해 ImageJ에 매크로를 사용합니다.
참고 : 매크로 및 지침은 인증에서 사용할 수 있습니다ORS, 리처드 리버와 섀넌 램너. - 바탕 화면에서 아이콘을 두 번 클릭하여 ImageJ에 프로그램을 엽니 다.
- 은 "플러그인"탭을 한 번 클릭하여 CSA 매크로를로드합니다. 한 번 클릭하여 "설치"옵션을 선택 커서를 아래로 이동합니다.
- "열기"를 클릭 한 후가에 저장되어있는 폴더에서 선택하여 단면 매크로를로드합니다.
- 매크로가 개방되면, ImageJ에 도구 모음에서 "파일"다음 "열기"를 클릭하여 눈금 막대가 포함 된 조직 학적 이미지를 엽니 다.
- 이미지가 열리면, 직선과 아이콘을 클릭하여 ImageJ에 프로그램에서 "직선"도구를 선택합니다.
- 은 "직선 도구"를 선택하면, 스케일 바의 가장 왼쪽 끝에 한 번 클릭 한 다음 규모 표시 줄의 가장 오른쪽 끝에 한 번 클릭합니다. 제대로하면 눈금 막대에 중첩 노란색 라인이 있어야한다.
- 여보 쇼는 것을 확인w 라인이 여전히 규모 표시 줄에 중첩되고, 한 번 클릭하여 ImageJ에 도구 모음에서 "분석"탭을 선택합니다.
- 은 "분석"탭에서 아래로 커서를 이동하고 한 번 클릭하여 "설정 규모"를 선택합니다.
- 은 "설정 규모"창에서 상자 "거리 (픽셀 단위)의"의 값을 변경하지 마십시오. "알려진 거리"상자에서 스케일 바의 알려진 거리를 입력합니다. 스케일 바 단위 (즉, 마이크로 미터 = μm의)에 해당하는 "단위 길이의"상자에 단위를 변경합니다. 마지막으로, 한 번 "글로벌"의 왼쪽에있는 상자를 클릭하여 "글로벌"을 선택합니다.
- 은 "설정 규모"창을 닫습니다.
- 첫 번째 이미지를 열고하는 키보드의 "O"버튼을 누름에 의해 측정된다. . 사용자가가에 저장되어있는 폴더에서 측정 할 찾아 이미지를 선택할 수있는 창이 팝업을 준수 클릭 한 다음 한 번에 클릭하여 이미지를 선택 "열기." <리> 개봉 후, 창이 CSA 측정과 원형의 허용 범위의 선택에 나타납니다.
- CSA에 범위와 원형을 설정 한 후, "임계 값"창 빨간색 픽셀에 덮여 이미지를 관찰한다. 근육 섬유를 정확하게 적색 화소에 충전 될 때까지 "임계"창에서 막대를 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다.
참고 : 서로 접촉하지 않는 섬유의 가장 큰 수를 얻기 위해 시도; 섬유가 접촉하는 경우, 그들은 하류 편집해야 할 하나의 큰 섬유로 측정한다. - 임계 값을 설정 한 후, 근섬유 측정 키보드의 "1"버튼을 누른다.
- 노란색 라인 개별 근육 섬유에 동그라미.이미지를 통해 이동과 유물 또는 프로그램에 의해 선택되었습니다 이중 섬유를 제거합니다. 이렇게하려면 한 번에를 클릭하여 섬유없는 구조를 선택한 후 키보드의 "D"버튼을 누릅니다. 이 측정에서 삭제됩니다.
- 선택하고에서 측정을 복사 "측정 값 창"및 추가 분석을 위해 스프레드 시트에 붙여 넣습니다.
주 : 얻어진 값은 또한 일반적으로 종양 성장 작은 근육 섬유를 향해 이동을 촉진하는 여부를 결정하는 데 유용한 파라미터를 나타내는 광 분포 분석, 평가할 수있다. - 윈도우의 왼쪽 상단 모서리에있는 "X"를 클릭하여 ImageJ에있는 열려있는 창을 모두 닫습니다.
- 8.29 - 새로운 이미지를 엽니 다하는 "O"를 눌러 단계 8.24을 반복하여 측정한다.
참고 :이 설정은 보통 기본값으로 남아 있습니다. 하나는 이러한 설정을 변경하고자하는 경우, 실험 측정 할 각 연속적인 이미지에 대해 동일한 값을 유지해야합니다.
평가 H & E 스테인드 섹션에서 근섬유 크기의 9 (대안 2)
- 유리를 배치코 플린 항아리에 슬라이드는 8 분 동안 해리스 헤 마톡 실린 필터링 함유.
주 : 덜 강한 염색이 필요한 경우 또는, 메이어 헤 마톡 실린이 사용될 수있다. - 탈 이온수에 슬라이드를 씻어.
- 최대 5 분 동안 수돗물의 슬라이드를 찍어.
- 빨리 탈 이온수를 세척 한 다음 미만 2 분에 대해 필터링 1 % 에오신 용액을 품어.
참고 더 강한 염색이 필요한 경우, 추가 1 - 에오신 용액에 아세트산 2 방울 (0.01 % 이하). - 탈수 단계를 시작합니다. 이하 1 분간 70 % 에탄올에 슬라이드를 헹군다.
- 1 분 동안 90 % 에탄올에서 슬라이드 딥.
- 1 분 동안 95 % 에탄올에서 슬라이드 딥.
- 2 분 동안 100 % 에탄올 슬라이드 딥.
- 2 분 동안 크실렌의 슬라이드를 찍어. 더 2 분 신선한 크실렌을 포함하는 다른 코플리 항아리에 슬라이드를 이동합니다.
주 :이 coverslipped 때까지 (더 이상 1 시간 미만) 크실렌에 슬라이드를 유지합니다. - coversli 배치Permount 또는 선택의 크실렌 계 장착 매체를 이용하는 근육 부에 PS.
- 20 배의 배율 현미경으로 H & E 염색 유리 슬라이드를 관찰하고, 전체 근육 단면적의 사진을 얻을. 밝은 광 현미경, 디지털 카메라, 및 화상 캡쳐 소프트웨어를 이용하여 화상을 얻었다.
참고 : 동일한 배율에서 찍은 마이크로 미터의 규모 바나 화상의 존재는 CSA를 결정해야한다. 상기와 같이, 기록 적어도 20 - 각 근육 섹션 (30) 임의의 필드. - ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 근섬유 크기를 평가한다. 모든 디지털 이미지를 엽니 다. 상기와 규모를 설정합니다. 태블릿 입력 장치 및 펜 빠르게 입력하는 마우스 섬유 둘레 추적은 자유형 선택 도구를 사용하여 근육 당 적어도 1,500-2,000 근섬유를 측정하거나.
10. 데이터 수집 및 분석
- 근육 섬유의 크기를 설정하기 위해서는, 평균 섬유 "영역을 평가한다."면적과 Feret 지름을 모두 포함하여 각 근육에 대해 얻어진 측정 수단 및 SD를 계산한다. 또한하기 실험 설정하거나 더 작거나 더 클 근섬유쪽으로 시프트와 연관되는지 여부를 평가하기 위해 분석"섬유 분포 . "
- 두 그룹의 부대 T 테스트를 수행하여 결과의 중요성을 평가한다. C26 마우스 군과 대조군에 대해 얻어진 값 사이의 비율을 결정한다. 수단의 SD 섬유 크기의 변화를 보여주는 목표 주파수 분포 / 히스토그램보고 그래프의 값을 플롯.
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Representative Results
(- 5 4 D) 지수 세포 성장 하였다 주사 후 8 D - C26 종양 성장 동력학은 제 7 래그 상을 나타낸다. 종양 덩어리는 최후 (도 1A-B는 약 2 g)을 ~ 체중의 10 %에 도달한다. 첫 번째 단계에서, 종양은 촉진하여 위치 될 수 있으며, 피부의 작은 돌기로 나타난다. 두 번째 단계에서, 종양은 피하 대량으로 관찰되었다. 드물게 종양은 개방 상처의 결과로, 궤양이된다 없습니다 이 경우, 마우스는 실험 그룹에서 제외 인도적으로 안락사된다.
체중 첫 번째 단계에서 그대로이지만, 10에 도달 할 때 크게 두 번째 단계에서 감소 - 초기 체중의 15 % (종양 부담 중량의 경우 30 %;도 1a 참조). 담암 마우스 낭비하고 끝에 흐트러진 모피 하였다 나타나는신체 조건 (BC)와 실험 기간은 1 18 (그림 1C)와 같은 점수. BC1은 골격 구조가 분명하고 척추가 명확하게 분할되어 심한 수척 마우스를 나타냅니다. 체중 감소는 주로 두 골격 근육과 지방 조직의 낭비 (그림 1B)에 의해 회계. 비복근 특히 골격근 질량의 30 %, 전 경골근 및 대퇴사 두근 (도 2) - 체중 감소는 약 20의 감소와 일치한다. 다른 골격근 (도 2)과 비교할 때, 심근은 상당히 비록 적은 정도로 경량화되어있다. 골격 근육과 유사한 체지방량, 심각하게 고갈되는 동안 흥미롭게도, 간 비대 (+ 16 %, P <0.01) 및 비장 비대 (+ 110 %, P <0.01)는 일반적으로 종양 호스트에서 발견된다 (70 %, P <0.001 도 3).
(도 4A-B)에 의해 근섬유 CSA의 형태 학적 평가 후에 관찰 "1"> 골격근 감량은 일관성 있고 근섬유 크기의 감소에 비례하여도된다. 특히, 도수 분포 해석 따라서 전체 근육이 C26 종양 (도 4C)의 존재 하에서 위축을 겪는 것을 시사 C26 - 함유 마우스에서 작은 크기의 섬유 방향의 변화를 나타냈다. 암의 성장과 관련된 근육 CSA의 변화의 크기가 IF 조금씩 (38 % 컨트롤 대 다른 p <0.01이더라도 유사한 결과, 섬유 크기 정량 전통적인 H & E 기반 방법을 이용하여 관찰 될 수있다 기반 방법, 제어 대 -18 %, p <가 H & E 기반 방법에 대해 0.01도 5).
그림 1 : 제어 및 C26 베어링 쥐의 몸 무게. 제어 C26-에서 제어 및 전체 실험 기간 동안 C26 호스트 (십사일 종양 주사 후). B) 초기 체중 (IBW) 최종 종양없는 체중 (FBW) 종양 중량 A)의 체중 곡선 베어링 동물. C) 종양 접종 후 희생 (일 14시의 제어 및 C26-베어러 대표 이미지). 데이터는 평균 표준 편차로 표현된다. n은 차이 6. 유의 사항 : * P <0.05, ** p <학생의 t-test를 이용하여 대조군에 비해 0.01, *** p <0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 제어 및 C의 근육 무게26 베어링 마우스는. 제어 및 C26의 종양 소지자의 경골근, 비복근, 대퇴사 두근, 심장 무게는 체중 / 100 mg을 IBW로보고됩니다. 데이터는 평균 SD로 나타낸다. N = 차이 항 의미 ** p <0.01 *** p <스튜던트 t-test를 이용하여 대조군에 비해 0.001.
그림 3 :. 통제의 장기 무게 마우스를 C26은 베어링이는 간, 제어 및 C26의 종양 소지자에 비장 및 부고환 지방 패드의 무게는 체중 / 100 mg을 IBW로보고됩니다. 데이터는 평균 SD로 나타낸다. N = 차이 항 의미 ** 대조군 대비 p <0.01.
그림 4 : 면역 형광에 의해 근섬유의 크기 형태 계측. A) 제어 및 C26 호스트에서 항 디스트로핀 항체 (벡터 연구소)를 사용하여 경골 부분의 형광 면역 반응. 배율 : 10X. 크기 막대 :. 100 μm의 B) 제어 및 C26 베어링 쥐의 경골 근육 CSA의 ImageJ에 매크로 C) 주파수 분배 측정 경골 근육 CSA의 정량화.. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현된다. n은 각 그룹에 대해 6. 차이의 유의성 ** 스튜던트 t-test를 이용하여 대조군에 비해 p <0.01.
그림 5 : H & E에 의해 근섬유 크기 형태 계측. 제어 및 C26 호스트에서 경골 섹션 A) 헤 마톡 실린 및 에오신 염색. 배율 : 20X. 크기 막대 :. 100 μm의 B)의 정량 및 주파수 분배경골 근육 CSA. 데이터는 평균 SD로 나타낸다. N = 차이 항 의의 : *** 스튜던트 t-test를 이용하여 대조군에 비해 p <0.001.
| 저자 | 마우스 스트레인 | 마우스 성별 | 휴대폰 번호 | 유래 | 고형 종양으로 이식? | 주사의 사이트 | 일 |
| 나사로 등., 1999 | CD2F1 | 엠 | 5 × 10 5 | NCI | 아니 | 등의 영역 | (17) |
| 알 - 마지드와 맥카시, 2001 | CD2F1 | 에프 | 2.5 × 106 | OSUMC | 아니 | 등의 영역 | (17) |
| 사무엘 등., 2001 | BALB / c를 | 엠 | 0.5 g / ㎖ 종양 현탁액 | NS | 예 | 등의 영역 | 최대 11 |
| Acharyya 등., 2004 | CD2F1 | 엠 | 1 × 10 (7) | OSUMC | 아니 | 우익 | 최대 24 |
| Aulino 등. 2010 | BALB / c를 | NS | 0.5 mm 3 | NCI | 예 | 등의 영역 | (21) |
| 베니-Klimek 외. 2010 | CD2F1 | 에프 | 1 × 10 (6) | OSUMC | 아니 | 등의 영역 | (14) |
| BONETTO 등, 2011.; 2,012 | CD2F1 | 에프 | 1 × 10 (6) | OSUMC | 아니 | 등의 영역 | |
| Cosper 및 Leinwand 2010 | CD2F1 | M + F | 5 × 10 5 | NS | 아니 | 우익 | 최대 27 |
| 머피 등. 2012 | CD2F1 | NS | 5 × 10 5 | NCI / OSUMC | 아니 | 등의 영역 | (14) |
| 콘웰 등. 2014 | CD2F1 | 엠 | 5 × 10 5 | NCI | 아니 | 오른쪽 및 왼쪽 측면 | 최대 26 |
| 아씨 등. 2016 | BALB / c를 | NS | 1 × 10 (6) | 세포주 서비스 | 아니 | 등의 영역 | 최대 22 |
표 1. C26 주입에 사용되는 다른 프로토콜 비교 DifferenC26 주입 t 프로토콜이 사용 된 마우스 스트레인 특히 참조하여 제공되며, 셀 번호 접종 종양 유형, 세포 기원 주사 부위 및 실험 기간의 길이. OSUMC : 오하이오 주립 대학 의료 센터. NCI : 국립 암 연구소 (National Cancer Institute). 상업 세포주 서비스 NS : 지정되지 않았습니다.
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Discussion
특히 최근의 단계에서, 결장암이 불량한 결과 및 환자의 삶의 질에서의 감소에 대한 책임이 악액질의 발전과 관련된다. 많은 연구는 암에 이차적 상태의 치료에 초점을 맞추고있다; 그러나,이 방향으로 많은 노력에도 불구하고, 여전히 암 악액질 (21)에 대한 승인 된 치료가 없습니다. 동물 모델 결과의 번역을 최대화하기 위해 가능한 한 가깝게 인간 병리 닮은 따라서, 필수적이다.
C26 종양 보유 마우스는 암 악액질 22-24의 일반적으로 사용되는 실험 모델이다. 이 모델은 밀접하게 몸, 근육, 지방 질량뿐만 아니라 근육 섬유 위축의 감소와 염증 유전자와 마크 단백질 hypercatabolism 2,5과 일치 유비퀴틴 리가의 발현 증가를 보여, 인간의 질병과 유사합니다. 그럼에도 불구하고, 데이터를 몇 격차 암 patie에서 얻어진국세청은 25, 26를보고되었다. 실제로, 비 - 생리적 성장 환경을 포함하는 모델의 일부 기능, 다른 모델 (예 : 유전자 또는 정위 주사에 비해 상대적으로 짧은 실험 기간 (예, 자궁외 종양은 위장관에 주입 동소 피하 대신 성장) 종양), IL-6 작용에 의존하며 심각한 한계를 나타낼 수 있고, 결과의 해석을 제한 할 수 CD2F1 또는을 Balb / c 마우스의 필요한 용도.
현재 프로토콜은 서로 다른 지리적 위치에 다른 연구자 3,10하여 동일한 특성을 유지하고 서로 다른 시간에 얻어진 결과 사이의 비교를 허용 실험실에서 수행되는 다양한 실험에 걸쳐 높은 재현성이 입증되었다. 그러나, 데이터의 재현성을 촉진하기 위해서는, 투명한 공통 가이드 라인을 확립하는 것이 중요하다.
gathere로문헌에서 d를, 몇 가지주의 사항이 두 개의 서로 다른 실험실에서 동일한 데이터의 재생되지 않을 수 있습니다. 동일한 이유로, 다른 프로토콜의 사용은 충돌 및 의심스러운 결과 상이한 표현형 및 결과뿐만 아니라,지도를 생성 할 수있다. 실제로, 이러한 동물 모델을 행하는 차이는 주로 균주 (의 Balb / C 또는 CD2F1) 2,5,27-29 또는 마우스 성으로 인해,보고 된 17 사용될 주입 된 종양의 유형 (세포 현탁액 3 29보다 그래프트 2,30)의 고형 종양, 종양 원 (NCI, ATCC 또는 OSUMC) 주사 하였다 C26 셀의 수, 주사 또는 주입 부위 (측면 6,17, (31) 또는 지느러미 지역 3,10,32). 다른 소스 (NCI 대 주로 OSUMC)에서 얻은 C26 셀 라인의 주입과 관련된 효과를 직접 비교는 이제까지 따라서 어떤 결정적인 conclusi 그리기에서 우리를 방지 수행되지 않았습니다기능. 그러나 세포의 원천의 선택도 크게 기대 결과에 영향을 미칠 수있는 것으로 보인다. 여성 대 남성의 선택을 고려할 때, 연구자가 결과에 큰 차이를 생각 나게한다. Cosper 및 Leinwand (17)에 의해보고 된 사실, 말레 종양 보유 마우스는 에스트로겐의 부재로 인해, 더 큰 심장 질량 손실 및 사망률 종양에보다 강력한 친 염증 반응을 포함한 여성보다 심한 표현형을 보여줄 수도 , 더 큰 심장 자식 작용.
특히이 모델에 익숙하지 않은 및 초기 전력 분석과 우리의 이전 경험, 실험 조건에 따라 최소 6 동물 (N = 6) 통계적으로 검출하기 위해 좋습니다의 사용 양에 따라 문제를 직면 할 수있는 그 연구자에 대한 유의 한 차이. 무작위가 실험 동물에서 그 초기 체중 때문에, 신중하게 수행하는 것이 또한 중요하다그룹 사이에 유의 한 차이가 없습니다. 유사하게, 운영자 간 변동을 피하기 위해, 동일 연구자 모든 동물의 조직과 기관 수집을 수행하는 것이 권장된다. 또한, 조직 (특히 근육) 연구의 목표는 유전자 발현을 평가하기 위해 또는 효소 활성을 평가하는 경우에는 특히 상기의 RNA 및 효소의 구조와 활성을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 냉동하는 것이 필수적이다. 또한, 근육의 CSA를 결정하려는 시도에서, 우리는 섬유 영역 리포팅 일반적으로 인정 근육 섬유 크기를 나타내는 것으로 나타났다. 여기, 우리는 근육 CSA를 평가하기 위해 두 가지 방법을 제시한다. 도 4-5에 도시 된 바와 같이, 소모도가 나타나 있지만 다른 두 방법은 제어 및 종양 호스트 사이 근섬유 크기의 상당한 감소를 검출 할 수 있었다.
이 차이는 두 가지 방법이 엉덩이에 허용되는 방법을 있지만, 사실에서 발생할 수 있습니다S 근육 섬유 사이즈, H & E 염색 된 슬라이드의 근육 특성의 정량화는 대부분 여전히 노동 집약적이고 시간 소모적 인, 제한된 정밀도의 영향이 수동 또는 반자동 과정이다. 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 IF 기반의 방법은 근육 CSA를보고 더 정확한 방법이라고 생각합니다. 사실,이 기술을 이용하여 자동으로 측정 할 수있는 섬유의 수는 이와 같이하여 측정의 정확도를 높일 상당히 크다. 참고로, 두 가지 기술은 Reporting 근육의 크기의 대안적인 방법은 Feret 지름을 평가한다. 흥미롭게도, 이는이 파라미터 절편의 각도는 거의 독립적이라는 사실에 매우 안정 도구 여겨진다. 예컨대 "최소 내경"및 "최소 외경"와 같은 다른 파라미터도 절편의 평면에 둔감하고, FIB의 다른 표시로 Feret 지름 대신 사용될 수있다어 크기입니다.
악액질 커뮤니티 명확 종양 - 관련 근 소모성의 연구 이상의 생체 모델을 확립 할 필요가 있지만, 결론적으로, 우리는 C26 결장 암종 베어링 마우스 분자량 변화를 조사하기 위해 잘 표준화하고 사용하기 쉬운 모델을 나타내고 있다고 생각 생리 이상은 일반적으로 종양의 발생 후 발견했습니다. 미래의 응용 프로그램은 대장에 C26 세포의 소성을 주입은 대장 암 악액질의 적절하고 더 생리 학적 모델을 나타낼 수 있는지 여부의 조사를 포함 할 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
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