Introduction
Muskelsvinn er en alvorlig komplikasjon av forskjellige kliniske tilstander så som kreft, sepsis, lever, skrumplever, hjerte og nyresvikt, kronisk obstruktiv lungesykdom, og AIDS. Spesielt er muskelsvinn tydelig i minst 50% av pasienter med cancer en. Tap av skjelettmuskulatur hos kreft resultater fra økt protein degradering på grunn av over-aktivering av skjelettmuskel proteolytiske systemer og / eller fra redusert proteinsyntese 6. Lipolyse er også tydelig, noe som fører til uttømming av fettvev. Klinisk, kakeksi er assosiert med redusert kvalitet og levetid og er beregnet for å være årsaken til død hos 20 - 30% av kreftpasienter 7. Bruk av eksperimentelle modeller som ligner den humane sykdommen så tett som mulig ville være fordelaktig. En optimal dyremodell er kjennetegnet ved høy reproduserbarhet, så vel som ved begrenset interferens fra forskjellige behandlinger, og de uforutsigbare faktorenekosthold, sex, og genetisk bakgrunn som vanligvis er forbundet med den kliniske tilstanden 8. Så langt har kreft kakeksi blitt studert i dyremodeller hovedsakelig kjennetegnet ved transplantasjon av kreftceller eller injeksjon av kreftfremkallende, selv om en ny metode er å bruke genetisk modifiserte mus som er mottakelige for utvikling av kreft.
Mus som bærer C26 karsinom (også referert til som kolon-26 og adenokarsinom) representerer en godt karakterisert og brukt i stor utstrekning modell av kreft kakeksi 2,5. Veksten av C26 tumor resultater i kropp og muskler vekttap, hovedsakelig gjennom økt fett og protein katabolisme 9. Vanligvis er en 10% tumorvekten i forhold til den totale kroppsvekten i forbindelse med en reduksjon på 20-25% i skjelettmuskel vekt og en større nedbryting av fett 3,10. Hepatomegali og splenomegali er også observert med tumorvekst, sammen med aktiveringen av akutt faserespons og heving av pro-oppblåstmmatory cytokin nivåer 3,11. Blant disse er det vel kjent at IL-6 spiller en sentral rolle som formidler muskelsvinn i C26-modellen, selv om dette cytokin er nok ikke den eneste induser av kakeksi 12. Forhøyet IL-6 forårsaker muskelatrofi gjennom aktivering av JAK / STAT3 vei, og hemme denne transkripsjonsfaktor kan forebygge muskel sløse 3,4.
Under C26-indusert muskelsvinn, som i mange tilstander i muskler atrofi, er muskelmasse tapt i stor grad gjennom reduksjoner i muskelproteininnhold på tvers av muskelfibrene, ikke gjennom celledød eller tap av fibre 13. I C26 kakeksi, er en dreining mot mindre tverrsnittsareal observert i både glykolytiske og oksidative fibre 2. Dette er også i overensstemmelse med redusert muskelstyrke 5. Mange grupper over hele verden har tatt fordel av C26-modellen for å oppdage nye mediatorer av muskelsvinn eller klinisk relevante legemidler for kreft cachexia. Imidlertid har mange forskjellige prosedyrer for bruk av denne modellen har blitt rapportert, heve bekymringer om konsistensen av de innhentede data og poserer barrierer for å reproduserbarhet i ulike eksperimentelle forhold. Her kan vi rapportere en typisk anvendelse av denne modell for studiet av kreft kakeksi som gir standardiserte og reproduserbare data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle studiene beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer Thomas Jefferson University og Indiana University School of Medicine.
1. C26 cellevekst og klargjøring
- Oppnå C26 kolorektal kreftceller (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) og forberede komplett vekstmedium (dvs. høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 1% glutamin og 1% streptomycin / penicillin).
NB: For å tillate bedre inter-eksperimentelle reproduserbarhet, er det foretrukket å benytte C26-celler ved en passasje så lav som mulig. - Bruke et kommersielt tilgjengelig celleteller til platen 50.000 celler / cm2 i kolber med fullstendig vekstmedium. Inkuber dem i en fuktig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO2 inntil undersammenflytende. Unngå å dyrke dem med høy tetthet til prevent differensiering og drifting av celle fenotyper.
- Etter den første passasje, plate nok celler til å bli implantert i den planlagte antall dyr. På dagen for celle implantasjon, dissosiere cellene ved trypsinering med 0,02 ml 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning per cm 2, nøytralisere trypsin ved å tilsette minst 3 ml ferskt medium pr ml av trypsin, bestemme cellekonsentrasjonen i celler / ml og resuspender antall celler som er nødvendig for forsøket (1 x 10 6 celler per mus) i steril PBS.
MERK: C26 cellene når konfluens når tettheten er ca 500 000 celler / cm2.
2. Mus
- Tilfeldig voksne CD2F1 mus (minst 8 ukers alder) inn i grupper (vanligvis styrer og kreftbærere) med minst n = 6 per gruppe.
MERK: C26 svulster vokse i Balb / c-mus i tillegg. Men basert på vår erfaring, CD2F1 mus representerer en mer allsidig og økonomisk vert for denne tumormodellen. Viderelik den kliniske settinger og til funn som er rapportert i andre eksperimentelle modeller for kreft-assosiert muskelsvinn 14-16, kan kjønnsforskjeller i responsen på C26 kakeksi også observeres 17 (se også tabell 1). - Anesthetize musen med isofluran ved innånding (3% i oksygen). Oppretthold dyret under narkose eksklusivt for nødvendig tid til å utføre tumorinokulasjon. Kontroller at mus ligger på en oppvarmet pute for å hindre tap av kroppsvarme. Før du starter svulsten injeksjonsprosedyren, bekrefte riktig anesthetization ved å forsiktig klemme bak tærne.
MERK: På grunn av varigheten av denne prosedyren (som regel noen få sekunder), er bruk av veterinær øye salve ikke nødvendig. Av samme grunn er kontrolldyr som gjennomgår den falske operasjon ikke forventes å tape vekt. - Ved hjelp av en steril 1 ml insulinsprøyte med en 26-gauge nål, raskt å injisere 250 ul av oppløsningen inneholdende tumor celler subkutant og intrascapularly i fettpute av musen.
MERK: Kontrolldyrene vil motta 250 mL sterilt saltvann intrascapularly i fettpute. - Plasser dyret tilbake i buret. Direkte observere musen minst en gang hvert 15 min før den kan svare på milde manipulasjon og har gjenvunnet en rettende refleks.
MERK: Ikke la musen uten tilsyn, og oppbevar den på et varmt recovery bur som inneholder en solid underlag. Videre ikke tilbake musen til dyret rommet før det er fullt restituert fra anestesi. Vanligvis gjør mus ikke trenger å være individuelt plassert med mindre undersøkeren tar sikte på å vurdere enkelte matinntak. Hvis dette er tilfelle og ved bruk av automatiserte metaboliske bur ikke er tilgjengelig, må manuell registrering av matforbruk skal utføres, kanskje daglig, og på samme tid hver dag. - Sjekk mus daglig og registrere sine kroppsvekt.
MERK: Ta opp kroppens tilstand score oghjem bur atferd kan differensiere grader av kakeksi og sykdom atferd, som er nyttig for behandlingsstudier 18.
3. Eutanasi og Blodprøvetaking
- Når vekttap i tumor vert versus kontroller når 5%, 10% eller 15% (mild, moderat og alvorlig cachexia, henholdsvis) i forhold til sin opprinnelige kroppsvekt, avlive musene.
MERK: En typisk eksperiment vil bli utført til en gruppe når 10% vekttap, hvorpå tid alle grupper avlives. Kroppsvekttap blir vurdert ved å måle kroppsvekten inklusive av tumoren. - Plasser musen i henhold isofluran narkose (3% i oksygen). Trekke blod ved hjelp av en hjertepunktering (ca. 1 - 1,5 ml).
- Samle blod i K 2 EDTA (18 mg) tomme rør og plassere dem på is. Sentrifuger blodet (2000 xg i 15 min ved 4 ° C) og samle plasma / serum.
- Avlive musen ved hjelp av cervical forvridning. Fortsett til vev excision og orgel samling.
4. vev og organ Eksisjon
MERK: For bruk av vev i biokjemiske eller molekylærbiologiske analyser, har tenkt å veie hvert organ og vev og plassere et fragment umiddelbart inn i pre-merket cryotubes. Snap fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.
- For å unngå forurensning av vevsprøver med pels, spray 70% etanol i løpet av hele kroppen.
- Plasser musen på en disseksjon seng i liggende stilling og utvide en lem vertikalt ved å feste foten til en forhøyet Buret klemme.
- Ta tak i huden på underekstremitet med Dumont pinsett og bruke de buede gode saks til å forsiktig fjerne huden og fascia, utsette de underliggende muskel magen til den nedre lem.
- Identifiser gastrocnemius muskelen på bakre nedre lem av sin opprinnelse i de laterale og mediale kondylene på bakre femur og dens innsetting påcalcaneus via calcaneal sene.
- Fortsett å kutte gastrocnemius calcaneal sene. Ta tak i distal ende av gastrocnemius med Dumont pinsett og dra muskelbuken mot sin opprinnelse. Ved hjelp av saks, kuttet muskelen i origo så nært som mulig til femur. Plasser muskel i en skål. Vei den umiddelbart og fryse den i et rør i flytende nitrogen.
MERK: Pass på å ikke skjære soleus muskelen sammen med gastrocnemius. Hvis det skjer, fjern forsiktig soleus ved å trekke det forsiktig av med tang.
- Fortsett å kutte gastrocnemius calcaneal sene. Ta tak i distal ende av gastrocnemius med Dumont pinsett og dra muskelbuken mot sin opprinnelse. Ved hjelp av saks, kuttet muskelen i origo så nært som mulig til femur. Plasser muskel i en skål. Vei den umiddelbart og fryse den i et rør i flytende nitrogen.
- Fortsett å identifisere og eksisere tibialis anterior muskel fra sin opprinnelse på anterolaterale overflaten av tibia og dens innsetting i mediale kileskrift via sin fjerne senen.
- For å ha innflytelse, hold foten ved å ta tak sifrene med pekefingeren og tommelen. Sett spissen av Dumont tang umiddelbart under overfladiske distal senen av tibialis og flytte pinsett slik at blunt side kan anvendes for å koble den tibialis muskel buk fra det underliggende bindevev.
- Skjær den distale sene ved hjelp av de fine buede saks, og deretter kuttet i muskelen i origo, så nær som mulig til tibia.
- Åpne bukhulen ved å utføre en sagittal snitt starter i hypogastric regionen og flytte overlegent til midten av magesekken, stopper snittet like over membranen.
MERK: Dybden av snittet bør bare være nok til å bryte abdominal muskel veggen og den underliggende peritoneal fascia. - Fjern forsiktig leveren ved å gripe den med stump-tipped tang, og bruke de fine buede saks for å dissekere bort noen blodkar eller bindevev som fester leveren til hulrommet. Pass på å ikke la noen lapper bak. Vei og knipse fryse leveren i et rør i flytende nitrogen.
- Bruke sløv-tipped tang, bevege seg bort tarmen, og deretter avsløre og delikat fjernmilten. Ta tak i milt forsiktig med stump-tipped pinsett og bruke baksiden eller sløv siden av de fine buede saks for å dissekere bort noen bindevev eller blodkar man følger milten til hulrommet. Vei og smekk fryse den i et rør i flytende nitrogen.
- Identifiser gonadale fettputer, som grenser til bitestikkelen (hos menn) eller livmoren (hos kvinner). Forsiktig tak i epididymal fett puten med stump-tipped tang og trekk vev ut av hulrommet. Ved hjelp av de fine buede saks, klippe bort noen gonadal vev som kan være festet til den fettputen. Vei fettpute og smekk fryse den i et rør i flytende nitrogen.
MERK: Vanligvis er dette fettvev anses representativ for den samlede kroppsfett masse hos mus og avtar i vekt med kakeksi. Andre fettputer kan på lignende måte identifisert, dissekert, fjernet og veid. - Bruk buede fin saks for å åpne brystet av dyret. Skjær bort ribbeina knyttet til både laterale grenser sternum. Fjern sternum. Ved hjelp av to par pinsett, ta tak i hver side av brystkassen og trekk hver side sidelengs for å åpne brysthulen.
- Delikat trekke hjerte med pinsett. skjære forsiktig hjerte med de buede gode saks av kuttet aorta til venstre atrium. Sørg for å tømme organ for eventuelle gjenværende blod ved delikat blotting det mot noen absorberende papir. Vei og smekk fryse den i et rør i flytende nitrogen.
5. Muskel Frysing og Montering
- Dypp den nederste halvdelen av et lite plastbeger (50 ml) inneholder isopentan i flytende nitrogen. Den isopentan er klar til bruk når det blir litt tyktflytende og danner en solid hvit laminat fôr innsiden av begeret (temperatur: -160 ° C).
MERK: Bruk alltid gnistfritt bronse eller aluminium håndverktøy. Unngå innånding av produktdamp. Brukes med tilstrekkelig ventilasjon. Hvis du arbeider med et spill og ventilasjon er umulig eller impractical, ha en egnet åndedrettsvern. - Fryse litt innstøpningsmediet på en chuck (kork) ved å dyppe det kort (10 sek) i isopentan.
- Håndtak muskelen (f.eks., Tibialis eller gastrocnemius) ved å holde det ved i senen, vertikalt i forhold til korken, for å opprettholde orienteringen av fibrene og for å tillate tverrsnitt.
- posisjonere nøye endeparti av frisk muskel på toppen av det frosne innstøpningsmediet.
MERK: Muskelen vil holde. Det er viktig å ikke helt omgir muskelen med innstøpningsmediet. Det er også viktig å opprettholde vertikal orientering for påfølgende bestemmelse av tverrsnittsarealet. - Dypp chuck med den vedlagte muskelen inn i isopentan bad (det vanlig å fryse tiden er 7 - 15 s, avhengig av prøvestørrelse og sammensetning).
MERK: Nedsenking i iskaldt oppløsningen bør ikke vare mer enn det som er nødvendig for fullstendig å fryse prøven. Frysing altfor lenge vil fracture vevet blokken, mens for en kort tid vil føre til iskrystalldannelse. En godt frosne prøven vil være kritthvite. - Etter frysing prøven, legg den i en liten plastpose eller prøverør (50 ml) og umiddelbart lagre den i en dypfryser ved -80 ° C eller i flytende nitrogen.
6. Analyse av Rådata
- For å kontrollere for variasjoner i størrelsen på mus, normalisere den endelige kroppsvekt (FBW); tumorfri kroppsvekt; og carcass, orgel, og vekt vev (uttrykt i gram) i henhold til den opprinnelige kroppsvekt (IBW), og uttrykke dem som "vekt / 100 mg IBW".
MERK: Du kan også noen etterforskere normalisere muskelmasse til tibia lengde. - Bruke en programvare for dataanalyse. Finn gjennomsnittet og SD av de normaliserte vekter. Utføre statistisk analyse med uparede Student t-tester mellom kontroller og C26-bærende mus.
MERK: Resultatene kan presenteres i forhold til kroppen (IBWog tumor-free FBW), tumor, orgel og vev vekter.
7. Muskel Seksjonering
- Sett arbeidstemperatur kryostaten indre kammeret til rundt -23 ° C.
- Tillat prøven (tidligere lagret ved -80 ° C) for å akklimatisere ved arbeidstemperaturen (et par timer bør være tilstrekkelig).
- Cut flere 8-mikrometer tykke seksjoner av prøven (helst tibialis anterior eller gastrocnemius muskler) og samle dem på glassplater.
MERK: Skjær delen på midten av magen regionen av muskelen. Også av hensyn til nøyaktighet, skåret seksjonene vinkelrett til monteringsaksen. - Hold glassplater inne i cryostat kammer. Ikke la dem tine dersom målet er å utføre IF / IHC studier eller enzymatisk farging.
- Oppbevar lysbilder ved -80 ° C for videre analyser.
8. Evaluering av Myofiber størrelse ved Laminin immunfluorescens (Alternativ 1)
19. Selv om H & E farging av muskel seksjoner utgjør et verdifullt og praktisk metode for analyse av morfologi, ved bruk av en tilnærming IF 14 er vesentlig raskere og mer nøyaktig enn beskjedent H & E-basert metode. H & E fremgangsmåter er beskrevet nedenfor.
- Fjern vevssnitt fra enten kryostaten eller -80 ° C for oppbevaring og la dem ekvilibrere til romtemperatur (omtrent 5 - 10 min).
MERK: For å unngå ikke-spesifikke interaksjoner forbundet med primære antistoffer dannet i mus, er det tilrådelig å enten bruke antistoffer oppvokst i en annen art, eller for å gjøre bruk av kommersielt tilgjengelige "mus-on-mus" immuno-deteksjons- kits. - Fordyp delene i pre-cooled metanol (-20 ° C) i 10 minutter.
- Vask delene i romtemperatur 1x PBS i 5 min.
- Fjern PBS og bruke en penn for immunhistokjemiske programmer for å omringe seksjonene på lysbildet. IKKE la seksjoner helt tørr på noe punkt.
- Anvende en egnet blokkerende buffer (5 - 8% FBS i PBS eller 5% geiteserum i PBS) på seksjonene i 1 time ved RT.
- Fjern blokkering buffer.
- Anvende enten et kanin-anti-laminin (1:30) eller et mus anti-dystrofin (01:30) primære antistoff i blokkeringsbuffer til seksjonene i 2 timer ved romtemperatur (eller over natten ved 4 ° C) i et fuktighetskammer.
- Vask 1x seksjoner med PBS i 5 minutter.
- Fjerne vaskebufferen og vask delene igjen i 1 x PBS i 5 min.
- Fjerne vaskebufferen og anvende et passende fluorescerende sekundært antistoff (1: 1000 i blokkeringsbuffer) til seksjonene i et fuktig kammer i 1 time ved RT.
- Fjern det sekundære antistoff og vask seksjonene med 1 x PBS i 5min.
- Fjerne vaskebufferen og gjenta vask med 1 x PBS i 5 min. Fjerne vaskebufferen og dekker deler med et dekkglass ved bruk av et vannbasert medium.
- Identifiser de morfologiske funksjoner i muskel ved hjelp av digitale bilder av de fargede delen. For å gjøre dette, må du bruke en invertert fluorescerende lys mikroskop for IF seksjoner (en 10X eller 20X forstørrelse Målet er hensiktsmessig), sammen med et digitalt kamera og bildeopptak programvare. Plasser en skala i hvert digitalt bilde (20 - 30 tilfeldige områder er anbefalt for hver muskel avsnitt) for å lette kvantifisering av CSA. Bilder bør være lagret i TIF-format for å være kompatibel med bildeanalyse programvare ved hjelp av ImageJ programmet.
- Bruke en ImageJ makro for å skille bindevev fra kontraktile vev (myofiber størrelse) ved nærvær av den fluorescerende sekundært antistoff i endomysium 20.
MERK: makro og instruksjoner er tilgjengelig fra authORS, Richard Lieber og Shannon Bremner. - Åpne ImageJ programmet ved å dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
- Last CSA makroen ved å klikke én gang på "Plugins" -kategorien. Flytt markøren nedover for å velge alternativet "Install" ved å klikke på det en gang.
- Last tverrsnitts makro ved å velge den fra mappen det er lagret i, og klikk deretter "Open".
- Når makro har blitt åpnet, åpner histologisk bilde som inneholder målestokken ved å klikke på "File" og deretter "Open" fra verktøylinjen ImageJ.
- Når bildet er åpnet, velger du "rett linje verktøy" i ImageJ programmet ved å klikke på ikonet med den rette linjen.
- Når "Rett linje funksjonen" er valgt, klikk en gang på venstre mest enden av skalaen linjen, og klikk deretter en gang på høyre mest enden av skalaen bar. Når det gjøres riktig, bør det være en gul linje kledde på målestokken.
- Å sørge for at Yellow linjen er fortsatt kledde på målestokken, velg "Analyser" fanen fra verktøylinjen ImageJ ved å klikke på det en gang.
- I "Analyser" -fanen, flytte markøren ned og velg "set skala" ved å klikke på det en gang.
- I "Sett scale" vindu, endrer ikke verdi i «Avstand i piksler" boksen. Angi kjent distanse av skalaen bar i "Kjent avstand" boksen. Endre enheter i "Enhet for lengde" boksen for å korrespondere med målestokken enheter (dvs. mikrometer = mikrometer). Til slutt velger du "global" ved å klikke i boksen til venstre for "global" en gang.
- Lukk "Set skala" -vinduet.
- Åpne det første bildet som skal måles ved å trykke på "O" -knappen på tastaturet. Observer et vindu pop-up som tillater brukeren å finne og velge bildet som skal måles fra mappen det er lagret i. Velg bildet ved å klikke på det en gang, og deretter klikke "Open". <li> Etter åpning bør et vindu vises for valg av det akseptable området for CSA målinger og for sirkularitet.
- Etter innstilling av CSA rekkevidde og sirkularitet, observere bildet dekket i røde piksler med en "terskel" -vinduet. Juster terskelen av bildet ved hjelp av barene i "Threshold" vinduet til muskelfibrene blir nøyaktig utfylt med røde piksler.
MERK: Forsøk på å oppnå størst antall fibre som ikke berører hverandre; hvis fibrene berører hverandre, vil de bli målt som en stor fiber, som vil trenge å bli redigert nedstrøms. - Etter innstilling terskelen, trykk på "1" -knappen på tastaturet for å måle muskelfibrene.
- Sirkel de enkelte muskelfibre med en gul linje.Flytt gjennom bildet og fjerne gjenstander eller doble fibrer som er blitt valgt av programmet. For å gjøre dette, velger de strukturene som ikke fibrene ved å klikke på dem en gang, og trykk deretter på "D" på tastaturet. Dette vil slette dem fra målingene.
- Velg og kopier målingene fra "Måleverdi vindu" og lime dem inn i et regneark for videre analyse.
Merk: De oppnådde verdier kan også brukes til å vurdere den fiberfordelingen analyse, som vanligvis utgjør en nyttig parameter for å bestemme om tumorvekst fremmer en dreining mot mindre muskelfibre. - Lukk alle åpne vinduer i ImageJ ved å klikke på "X" i øverste venstre hjørne av vinduene.
- Åpne et nytt bilde som skal måles ved å trykke "O" og gjenta trinn 08.24 til 08.29.
MERK: Disse innstillingene er vanligvis igjen til standardverdiene. Men hvis man ønsker å endre disse innstillingene, sørg for å holde verdiene de samme for hvert påfølgende bilde som skal måles i forsøket.
9. Evaluering av Myofiber størrelse fra H & E Stained §§ (alternativ 2)
- Plasser glassglir inn Coplin krukkene inneholder filtrert Harris hematoxylin i 8 min.
MERK: Alternativt kan Mayer hematoxylin brukes hvis en mindre intens flekken er ønskelig. - Skyll lysbildene i avionisert vann.
- Dypp lysbildene i vann fra springen i opptil 5 min.
- Raskt å skylle dem i avionisert vann, og deretter inkubere dem i filtrert 1% eosin-løsning for mindre enn 2 min.
MERK: Hvis en mer intens flekken er ønskelig, tilsett 1 - 2 dråper eddiksyre (0,01% eller mindre) til eosin løsning. - Begynn tørketrinn. Skyll lysbilder i 70% etanol for mindre enn 1 min.
- Dypp lysbilder i 90% etanol i 1 min.
- Dypp lysbilder i 95% etanol i 1 min.
- Dypp lysbilder i 100% etanol i 2 min.
- Dypp lysbilder i xylen for 2 min. Flytt lysbilder til en annen Copley krukke inneholder frisk xylen for 2 mer min.
MERK: Hold lysbilder i Xylen (ikke lenger enn en time) før de er coverslipped. - Plasser coverslips på muskeldelene med Permount eller en Xylen-baserte montering medium av valget.
- Observer H & E-fargede glassplater under et mikroskop med en 20X forstørrelse, og skaffe bilder av hele muskelen delen området. Få bilder ved hjelp av en lys-lys mikroskop, digitalt kamera, og bildeopptak programvare.
MERK: Tilstedeværelsen av en skala bar eller et bilde av en mikrometer tatt på samme forstørrelse vil være nødvendig for å fastslå CSA. Som ovenfor, ta minst 20 - 30 tilfeldige felt for hver muskel seksjon. - Vurdere myofiber størrelse ved hjelp ImageJ programvare. Åpent hver digitalt bilde. Sett skala som ovenfor. Mål minst 1,500-2,000 muskelfibre per muskel bruker frihåndsmarkeringsverktøy, sporing fiber omkrets med en mus eller, for raskere inngang, med en tablet inndataenhet og penn.
10. Datainnsamling og analyse
- For å etablere muskel fiber størrelse, vurdere den gjennomsnittlige fiber "område."Beregn midler og SD for de målinger som oppnås for hver muskel, inkludert både området og Feret største diameter. I tillegg, for å vurdere hvorvidt den eksperimentelle omgivelser er forbundet med en dreining mot enten mindre eller større muskelfibre, analysere" fiberfordelingen . "
- Vurdere betydningen av resultatet ved å utføre en uparet t-test for to grupper. Bestemme forholdene mellom verdiene oppnådd for C26 mus gruppe og for kontrollgruppen. Plott verdiene på en graf rapportering midler SD og frekvensfordeling / histogram sikte på å demonstrere skiftet i fiber størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C26 tumorvekstkinetikk viser et etterslep fase for den første 7 - 8 d etter injeksjon, etterfulgt av eksponensiell cellevekst (4 - 5 d). Tumormassen kommer til slutt ~ 10% av kroppsvekt (ca. 2 g; Figur 1A-B). Under den første fase, kan tumoren være plassert ved palpasjon bare og ser ut som en liten utvekst av huden. I den andre fasen, er svulsten observert som en masse under huden. Sjelden blir svulsten sårdannelse, noe som resulterer i et åpent sår; i dette tilfellet er mus ekskludert fra forsøksgruppen og er humant avlives.
Kroppsvekt er uendret i den første fase, men det er betydelig redusert i den andre fase, når den når 10 - 15% av den opprinnelige kroppsvekt (30% i tilfelle av tumorfrie vekt, figur 1A). Tumor-bærende mus vises bortkastet og viste samtidig var pels ved slutten avforsøksperioden, med en kropp tilstand (BC) scorer lik en 18 (figur 1C). BC1 representerer en alvorlig avmagret mus, hvor skjelettstrukturer er tydelig og ryggvirvlene er tydelig segmentert. Body vekttap er i hovedsak forklares av både skjelettmuskulatur og fettvev vinn (figur 1B). Kroppsvekttap er forenlig med en reduksjon på ca 20 - 30% i skjelettmuskel vekt, spesielt i gastrocnemius, tibialis anterior og lårmuskelen (figur 2). Hjertemuskelen blir også betydelig redusert i vekt, selv om i mindre grad i forhold til de andre skjelettmuskulaturen (figur 2). Interessant, hepatomegali (+ 16%, p <0,01) og splenomegali (+ 110%, p <0,01) blir vanligvis detektert i tumor verter, mens fettmassen, lik skjelettmuskulatur, er sterkt utarmet (-70%, p <0,001 ; figur 3).
(figur 4A-B). Spesielt frekvensfordelingsanalyse viste en dreining mot mindre størrelse fibre i C26-bærende mus, noe som tyder på at hele muskelen undergår atrofi i nærvær av en C26 tumor (figur 4C). Tilsvarende resultater kan observeres ved å utnytte en tradisjonell H & E-basert metode for kvantifisering av fiber størrelse, selv om størrelsen av endringen i muskelen CSA forbundet med cancer vekst er litt forskjellig (38% sammenlignet med kontroll, p <0,01 for mellomfrekvens -basert metode; -18% sammenlignet med kontroll, p <0,01 for H & E-baserte metode, figur 5).
Figur 1: kroppsvekt i kontroll og C26-bærende mus. A) Kroppsvekt kurve i kontroll og C26 vertene over hele forsøksperioden (14 dager etter tumorinjeksjon). B) Initial kroppsvekt (IBW), slutt tumorfri kroppsvekt (FBW), og tumorvekten i kontroll og C26- bærende dyr. C) Representative bilder av kontroller og C26-bærere på tidspunktet for offer (dag 14 etter tumorinokulasjon). Data er uttrykt som gjennomsnitt SD. n = 6. Betydningen av forskjellene: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001 versus kontrollgruppen ved hjelp av t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Muskel Vekter i Kontroll og C26-bærende mus. Tibialis, gastrocnemius, quadriceps og hjerte vekter i kontroll og C26 tumor bærere rapporteres som vekten / 100 mg IBW. Dataene er uttrykt som middelverdi SD. n = 6. Betydningen av forskjellene: ** p <0,01 og *** p <0,001 sammenlignet med kontrollgruppen ved hjelp av Student t-test.
Fig. 3: organvekt i kontroll og C26-bærende mus Lever, milt, og bitestiklenes fettputevekt i kontroll og C26 tumor-bærere er rapportert som vekt / 100 mg IBW. Dataene er uttrykt som middelverdi SD. n = 6. Betydningen av forskjellene: ** p <0,01 sammenlignet med kontrollgruppen.
Figur 4: morfometri for Myofiber størrelse ved immunfluorescens. A) Fluorescent immunhistokjemiske reaksjon av tibialis seksjoner ved hjelp av en anti-dystrophin antistoff (Vector Laboratories) fra kontroll- og C26 verter. Forstørrelse: 10X. Størrelse bar. 100 mikrometer B) Kvantifisering av CSA i tibialis muskelen målt med ImageJ makro C) Frekvensfordeling av CSA i tibialis muskel av kontroll og C26-bærende mus.. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. n = 6 for hver gruppe. Signifikans av forskjellene: ** p <0,01 sammenlignet med kontrollgruppen ved hjelp av Student t-test.
Figur 5: morfometri for Myofiber Størrelse av H & E. A) Hematoxylin & eosin farging av tibialis seksjoner fra kontroll og C26 verter. Forstørrelse: 20X. Størrelse bar. 100 mikrometer B) Kvantifisering og frekvensfordeling avCSA i tibialis muskel. Dataene er uttrykt som middelverdi SD. n = 6. Betydningen av forskjellene: *** p <0,001 sammenlignet med kontrollgruppen ved hjelp av Student t-test.
| Forfattere | musestamme | mus kjønn | Telefonnummer | Opprinnelse | Implantert som solid tumor? | Injeksjonsstedet | Dager |
| Lazarus et al., 1999 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | NEI | dorsal region | 17 |
| Al-Majid og McCarthy, 2001 | CD2F1 | F | 2,5 x 10 6 | OSUMC | NEI | dorsal region | 17 |
| Samuels et al., 2001 | Balb / c | M | 0,5 g / ml av suspensjon tumor | ns | JA | dorsal region | Opp til 11 |
| Acharyya et al., 2004 | CD2F1 | M | 1 x 10 7 | OSUMC | NEI | høyre flanke | Opp til 24 |
| Aulino et al., 2010 | Balb / c | ns | 0,5 mm 3 | NCI | JA | dorsal region | 21 |
| Benny-Klimek et al., 2010 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NEI | dorsal region | 14 |
| Bonetto et al, 2011.; 2012 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NEI | dorsal region | |
| Cosper og Leinwand 2010 | CD2F1 | M + F | 5 x 10 5 | ns | NEI | høyre flanke | Opp til 27 |
| Murphy et al., 2012 | CD2F1 | ns | 5 x 10 5 | NCI / OSUMC | NEI | dorsal region | 14 |
| Cornwell et al., 2014 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | NEI | Høyre og Venstre flanke | Opp til 26 |
| Assi et al., 2016 | Balb / c | ns | 1 x 10 6 | Cell Line Service | NEI | dorsal region | Opp til 22 |
Tabell 1:. Sammenligning av ulike protokoller som brukes for C26 Implantasjon different protokoller for C26 implantasjon er forsynt, med særlig henvisning til musestamme anvendes, celle antall og type tumor inokulert, cellen opprinnelse, injeksjonsstedet, og lengden av den eksperimentelle perioden. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NCI: National Cancer Institute. Kommersiell cellelinje tjeneste NS: ikke spesifisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spesielt i sin nyeste stadier, er tykktarmskreft assosiert med utvikling av kakeksi, som er ansvarlig for dårligere utfall og reduksjon i pasientens livskvalitet. Mange studier har fokusert på behandling av tilstander som sekundært til cancer; Men til tross for mange forsøk i denne retningen, er det fortsatt ingen godkjente behandling for kreft kakeksi 21. Således er det viktig at dyremodeller ligner den humane patologi så tett som mulig for å maksimere den oversettelse av funnene.
C26 tumorbærende mus er en vanlig brukt eksperimentell modell av kreft kakeksi 22-24. Denne modellen ligner den humane sykdommen, viser reduksjoner i kropps, muskel og fettmasse, samt muskel atrofi fiber og økt ekspresjon av inflammatoriske gener og ubiquitin-ligaser i samsvar med merkede protein hyperkatabolisme 2,5. Til tross for dette, noen ulikheter med data innhentet i kreft PatieNTS har blitt rapportert 25,26. Faktisk, noen av funksjonene i modellen, inkludert ikke-fysiologisk vekst miljø (for eksempel en ektopisk tumor dyrket subkutant i stedet for orthotopically implantert i mage-tarmkanalen), den relativt korte forsøksperioden sammenlignet med andre modeller (f.eks genetisk eller orthotopic injeksjon av tumorer), avhengigheten av IL-6 handling, og den nødvendige bruk av CD2F1 eller Balb / c-mus kan representere alvorlige begrensninger og kan begrense tolkningen av resultatene.
Den nåværende protokoll har vist seg å være meget reproduserbar over mange eksperimenter utført i vårt laboratorium, å opprettholde de samme egenskaper og tillate sammenligninger mellom resultatene som ble oppnådd ved forskjellige tider, i forskjellige geografiske steder, og av forskjellige forskere 3,10. Imidlertid, for å fremme reproduserbarheten av data, er det viktig å etablere klare og felles retningslinjer.
som gathered fra litteraturen, kanskje flere begrensninger hindre reproduksjon av de samme data i to forskjellige laboratorier. Av samme grunner, kan bruk av ulike protokoller generere ulike fenotyper og resultater, samt føre til motstridende og tvilsomme resultater. Faktisk forskjeller i å utføre denne dyremodell har blitt rapportert, hovedsakelig som følge av stammen (Balb / c eller CD2F1) 2,5,27-29 eller kjønn hos mus benyttet 17, typen av tumor som ble implantert (en cellesuspensjon tre , 29 i stedet for en fast tumor i et pode 2,30), tumor kilden (NCI, ATCC, eller OSUMC), antallet C26 celler som ble injisert, og injeksjons eller implantering (flankene 6,17, 31 eller den dorsale regionen 3,10,32). Direkte sammenligning av effektene knyttet til implantering av C26 cellelinjer hentet fra ulike kilder (hovedsakelig OSUMC versus NCI) har noensinne blitt utført, og dermed hindre oss fra å tegne noen definitive conclusions. Det er imidlertid sannsynlig at valg av kilden til cellene, kan også i betydelig grad påvirke de forventede resultater. Når det gjelder valg av menn kontra kvinner, bør etterforskere bli minnet om signifikante forskjeller i resultatene. Faktisk, som rapportert av Cosper og Leinwand 17, hann tumor-bærende mus, på grunn av fravær av østrogener, kan imidlertid ha en mer alvorlig fenotype enn hunner, inkludert økt hjerte massetap og dødelighet, en mer robust pro-inflammatorisk respons til tumoren og større hjerte autofagi.
Spesielt for de etterforskere som ikke er kjent med denne modellen, og kan i utgangspunktet står overfor problemer, basert på både en maktanalyse og vår tidligere erfaring, bruk av minst 6 dyr per eksperimentell tilstand (n = 6) er tilrådelig for å påvise statistisk signifikante forskjeller. Det er også viktig at randomiseringen utføres omhyggelig, slik at opprinnelige kroppsvekt i forsøksdyreneskiller seg ikke vesentlig blant grupper. Tilsvarende er det anbefalt at, for å unngå interoperatør-variabilitet, på samme søkeren utføre vev og organ samling på hvert dyr. Videre er det viktig at vev (særlig muskel) er frosset så fort som mulig for å bevare RNA og enzymatisk struktur og aktivitet, spesielt hvis målet med studien er å vurdere genuttrykk eller å evaluere enzymatiske aktiviteter. Dessuten, i forsøket på å bestemme muskel CSA viste vi at rapporteringen fiberen området er generelt akseptert og representative for muskelfiberstørrelse. Her presenterer vi to forskjellige metoder for å vurdere muskel CSA. Som vist i figurene 4-5, begge metoder var i stand til å detektere en betydelig reduksjon i myofiber størrelse mellom kontroller og tumor verter, selv om graden av sløse først på forskjellig.
Dette avviket kan skyldes det faktum at selv om begge metodene er akseptable måter å assess muskelfiberstørrelse, kvantifisering av muskel egenskaper fra H & E-fargede objektglass er fortsatt en manuell eller halvautomatisk prosess, mest ofte arbeidskrevende, tidkrevende, og påvirkes av begrenset nøyaktighet. Basert på vår erfaring, tror vi at IF-baserte metoden er en mer nøyaktig metode for å rapportere muskel CSA. Faktisk er det antall fibre som kan måles automatisk ved å utnytte denne teknikk betydelig større, og dermed øke nøyaktigheten av målingen. Av notatet, for begge teknikkene, er en alternativ metode for rapportering muskelstørrelse vurdere Feret diameter. Interessant nok er dette ansett som en meget pålitelig verktøy på grunn av det faktum at denne parameteren er i stor grad uavhengig av vinkelen til seksjonering. Andre parametere, slik som den "minimale indre diameter" og "minimal ytre diameter» er også ufølsomme for planet for seksjonering og kan brukes i stedet for Feret diameter som alternative indikasjoner på fiber størrelsen.
I konklusjonen, selv om kakeksi samfunnet klart behov for å etablere flere fysiologiske modeller for studier av tumor-assosiert muskelsvinn, tror vi at mus som bærer C26 tykktarmskreft utgjør et godt standardisert og enkel å bruke modellen til å undersøke molekylære endringer og fysiologiske forandringer vanligvis oppdages etter forekomst av en svulst. Fremtidige søknader vil innebære gransking av hvorvidt orthotopic implantasjon av C26 celler i tykktarmen kan representere en skikkelig og mer fysiologisk modell av tykktarmskreft cachexia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
- Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
- Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
- Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
- Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
- Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
- Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
- Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
- Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
- Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
- Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
- Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
- Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
- Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
- Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
- Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
- Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
- Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
- Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
- Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
- Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
- Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
- Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
- Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
- Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
- al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
- Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
- Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
- Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
