Introduction
La atrofia muscular es una complicación grave de diversas condiciones clínicas tales como el cáncer, sepsis, hígado, cirrosis, insuficiencia cardíaca y renal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y el SIDA. En particular, el desgaste muscular es evidente en al menos 50% de los pacientes con cáncer de 1. La pérdida de músculo esquelético en el cáncer resulta de una mayor degradación de las proteínas debido a la sobre-activación de los sistemas proteolíticos del músculo esquelético y / o de disminución de la síntesis de proteínas 6. La lipólisis es también evidente, lo que lleva a la disminución de tejido adiposo. Clínicamente, la caquexia está asociada con una reducción de la calidad y la duración de la vida y se estima que es la causa de la muerte en 20 - 30% de los pacientes de cáncer de 7. El uso de modelos experimentales que se asemejan a la enfermedad humana tan estrechamente como sea posible sería beneficioso. Un modelo animal óptima se caracteriza por una alta reproducibilidad, así como por la interferencia limitada de diferentes terapias y los factores impredecibles dela dieta, el sexo y los antecedentes genéticos que se asocian generalmente con la condición clínica 8. Hasta el momento, la caquexia del cáncer se ha estudiado principalmente en modelos animales que se caracterizan por el trasplante de células de cáncer o de inyección de carcinógenos, aunque un nuevo método es el uso de ratones modificados genéticamente susceptibles al desarrollo de cáncer.
Los ratones que llevan el carcinoma C26 (también referidos como de colon-26 y adenocarcinoma) representar un modelo bien caracterizado y utilizado ampliamente de la caquexia del cáncer de 2,5. El crecimiento de los resultados C26 tumorales en el cuerpo y la pérdida de peso muscular, principalmente mediante el aumento de la grasa y el catabolismo proteico 9. Generalmente, un peso del tumor 10% versus el peso corporal total se asoció con una reducción de 20-25% en peso del músculo esquelético y un mayor agotamiento de la grasa de 3,10. Hepatomegalia y esplenomegalia también se observan con el crecimiento tumoral, junto con la activación de la respuesta de fase aguda y la elevación de pro-inflalos niveles de citoquinas mmatory 3,11. Entre estos, se sabe que la IL-6 juega un papel fundamental en la mediación de pérdida de masa muscular en el modelo C26, a pesar de que esta citocina no es probablemente el único inductor de caquexia 12. Elevada IL-6 causa atrofia muscular a través de la activación de la vía de JAK / STAT3, y la inhibición de este factor de transcripción puede prevenir atrofia muscular 3,4.
Durante pérdida de masa muscular inducida por C26, como en muchas condiciones de atrofia muscular, la masa muscular se pierde en gran medida a través de reducciones en el contenido de proteína del músculo a través de las fibras musculares, no a través de la muerte celular o pérdida de fibras 13. En C26 caquexia, un cambio hacia áreas de sección transversal más pequeñas se observa tanto en glucolíticas y oxidativas fibras 2. Esto también es coherente con una reducción de la fuerza muscular 5. Muchos grupos de todo el mundo han aprovechado el modelo C26 con el fin de descubrir nuevos mediadores de la pérdida de masa muscular o fármacos clínicamente relevantes para el cáncer cacHexia. Sin embargo, se ha informado de muchos procedimientos diferentes para el uso de este modelo, aumentando las preocupaciones acerca de la consistencia de los datos obtenidos y que presenta obstáculos al reproducibilidad en diferentes condiciones experimentales. Aquí mostramos un uso típico de este modelo para el estudio de la caquexia por cáncer que produce datos estandarizados y reproducibles.
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Protocol
Declaración de Ética: Todos los estudios descritos fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Thomas Jefferson y la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana.
1. C26 crecimiento celular y Preparación
- Obtener células de cáncer colorrectal C26 (Universidad Estatal de Ohio Medical Center (OSUMC)) y preparar el medio de crecimiento completo (es decir, alta glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1 mM, 1% glutamina y 1% de estreptomicina / penicilina).
NOTA: Con el fin de permitir una mejor reproducibilidad inter-experimental, es preferible utilizar células C26 en un pasaje tan bajo como sea posible. - Use un contador de células disponible en el mercado a la placa 50.000 células / cm 2 en frascos con medio de crecimiento completo. Incubarlos en una atmósfera húmeda a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta sub-confluente. Evitar su cultivo a alta densidad para Prevent diferenciación y la deriva de los fenotipos celulares.
- Después de que el primer pasaje, suficientes células de la placa para ser implantados en el número previsto de los animales. En el día de la implantación de células, disociar las células por tripsinización con solución de tripsina-EDTA 0,02 ml de 0,25% por cm 2, neutralizar la tripsina mediante la adición de al menos 3 ml de medio fresco por ml de tripsina, determinar la concentración de células en células / ml , y resuspender el número de células necesarias para el experimento (1 x 10 6 células por ratón) en PBS estéril.
NOTA: las células alcanzan la confluencia C26 cuando la densidad es de aproximadamente 500.000 células / cm 2.
2. Los ratones
- Selección aleatoria de adultos CD2F1 ratones (al menos 8 semanas de edad) en grupos (normalmente controla y tumorales portadores) con al menos n = 6 por grupo.
NOTA: Los tumores C26 crecen en ratones Balb / c así. Sin embargo, basándonos en nuestra experiencia, los ratones CD2F1 representan una serie más versátil y económica para este modelo de tumor en particular. Además,similar a los entornos clínicos y los resultados reportados en otros modelos experimentales de músculo asociada al cáncer perdiendo 14-16, las diferencias de sexo en la respuesta a la caquexia C26 también se puede observar 17 (véase también la Tabla 1). - Anestesiar al ratón usando isoflurano por inhalación (3% en oxígeno). Mantener el animal bajo anestesia exclusivamente durante el tiempo necesario para llevar a cabo la inoculación del tumor. Asegúrese de que el ratón se encuentra sobre una almohadilla caliente con el fin de evitar la pérdida de calor del cuerpo. Antes de iniciar el procedimiento de la inyección del tumor, confirmar la anestesia adecuada pellizcando suavemente los dedos de los pies traseros.
NOTA: Debido a la duración de este procedimiento (por lo general unos pocos segundos), no se requiere el uso de ungüento oftálmico veterinario. Por la misma razón, no se espera que los animales de control sometidos al simulacro de operación para bajar de peso. - Usando una jeringa estéril de insulina de 1 ml con una aguja de calibre 26, se inyectan rápidamente 250 l de la solución que contiene el tumor células por vía subcutánea y intrascapularly en la almohadilla de grasa del ratón.
NOTA: Los animales de control reciben 250 l de solución salina estéril intrascapularly en la almohadilla de grasa. - Coloque la parte posterior animal en su jaula. Directamente observar el ratón, al menos una vez cada 15 minutos hasta que se pueda responder a una manipulación suave y ha recuperado un reflejo de enderezamiento.
NOTA: No deje desatendido el ratón, y mantenerlo en una jaula de recuperación tibia que contiene un sustrato sólido. Por otra parte, no devuelva el ratón a la sala de los animales hasta que esté totalmente recuperado de la anestesia. En general, los ratones no necesitan ser alojados por separado a menos que el investigador tiene como objetivo evaluar la ingesta de alimentos individual. Si este es el caso y el uso de jaulas metabólicas automatizados no está disponible, el registro manual de consumo de alimentos debe realizarse, posiblemente a diario y al mismo tiempo cada día. - Compruebe los ratones diariamente y registrar su peso corporal.
NOTA: El registro de la condición corporal ycomportamientos jaula pueden diferenciar grados de la caquexia y la enfermedad del comportamiento, que es útil para los estudios de tratamiento 18.
3. La eutanasia y la extracción de sangre
- Cuando la pérdida de peso corporal en los anfitriones tumorales frente a los controles alcanza el 5%, 10% o 15% (caquexia leve, moderada y grave, respectivamente) en comparación con sus pesos corporales iniciales, la eutanasia a los ratones.
NOTA: Un experimento típico se llevará a cabo hasta que un grupo alcanza 10% de pérdida de peso, en la que el tiempo se sacrifican todos los grupos. la pérdida de peso corporal se evaluó midiendo el peso del cuerpo inclusive del tumor. - Coloque el ratón bajo anestesia general con isoflurano (3% en oxígeno). Extraer la sangre por medio de una punción cardiaca (aproximadamente 1 - 1,5 ml).
- Recoger la sangre en K 2 EDTA (18 mg) tubos vacíos y colocarlos en hielo. Centrifugar la sangre (2000 xg durante 15 min a 4 ° C) y recoger el plasma / suero.
- La eutanasia el ratón por medio de cdislocación ervical. Proceder a la extirpación de tejido y la recolección de órganos.
4. Escisión de Tejidos y Órganos
NOTA: Para el uso de los tejidos en los ensayos de biología molecular o bioquímica, el plan para pesar cada órgano y tejido y colocar un fragmento de inmediato en criotubos pre-etiquetados. Snap congela en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
- Con el fin de evitar la contaminación de las muestras de tejido con la piel, rocíe 70% de etanol en todo el cuerpo.
- Coloca el ratón sobre un lecho de disección en posición supina y se extienden verticalmente por una extremidad de colocar el pie a una pinza de bureta elevada.
- Agarre la piel de la extremidad inferior con unas pinzas Dumont y utilizar las tijeras finas curvas para eliminar suavemente la piel y la fascia, la exposición de los vientres musculares subyacentes de la extremidad inferior.
- Identificar el músculo gastrocnemio en el miembro posterior inferior por su origen en los cóndilos medial y lateral en el fémur posterior y su inserción enel calcáneo a través del tendón calcáneo.
- Proceder a cortar el tendón calcáneo gastrocnemio. Tome el extremo distal del gemelo con pinzas Dumont y tire del vientre muscular hacia su origen. Con unas tijeras, corte el músculo en el origen lo más cerca posible al fémur. Coloque el músculo en un plato. Pesar inmediatamente y congelarlo en un tubo en nitrógeno líquido.
NOTA: Asegúrese de no cortar el músculo sóleo junto con el gastrocnemio. Si esto ocurre, retire con cuidado el sóleo, tirando de él con los fórceps.
- Proceder a cortar el tendón calcáneo gastrocnemio. Tome el extremo distal del gemelo con pinzas Dumont y tire del vientre muscular hacia su origen. Con unas tijeras, corte el músculo en el origen lo más cerca posible al fémur. Coloque el músculo en un plato. Pesar inmediatamente y congelarlo en un tubo en nitrógeno líquido.
- Proceder a identificar y extirpar el músculo tibial anterior desde su origen en la superficie anterolateral de la tibia y su inserción en la cuña medial a través de su tendón distal.
- Con el fin de tener influencia, mantener el pie agarrando los dígitos con el dedo índice y el pulgar. Inserte la punta de pinzas Dumont inmediatamente debajo del tendón distal superficial del tibial y mover las pinzas de tal manera que el bllado unt se puede utilizar para separar el vientre del músculo tibial desde el tejido conectivo subyacente.
- Cortar el tendón distal usando las tijeras curvas finas, y luego se corta el músculo en el origen, lo más cerca posible a la tibia.
- Abra la cavidad abdominal mediante la realización de una incisión sagital a partir de la región hipogástrica y moviendo superiormente a la región epigástrica, parando la incisión justo por encima del diafragma.
NOTA: La profundidad de la incisión sólo debe ser suficiente para romper la pared del músculo abdominal y la fascia peritoneal subyacente. - Retirar con cuidado el hígado, sujetándola con las pinzas de punta roma, y utilizar las tijeras curvas finas como para diseccionar los vasos sanguíneos o tejido conectivo que se adhieren al hígado a la cavidad. Tenga cuidado de no dejar ninguna lóbulos atrás. Pesar y congelamiento rápido del hígado en un tubo en nitrógeno líquido.
- El uso de las pinzas de punta roma, alejarse del intestino, y luego exponer y retirar delicadamenteel bazo. Agarre el bazo suavemente con las pinzas de punta roma y utilizar la parte posterior o lateral romo de las tijeras curvas finas como para diseccionar los tejidos conectivos o los vasos sanguíneos adheridos al bazo a la cavidad. Pesar y encaje congelarlo en un tubo en nitrógeno líquido.
- Identificar las almohadillas de grasa gonadales, adyacentes al epidídimo (en hombres) o el útero (en las mujeres). agarre suavemente la almohadilla de grasa del epidídimo con las pinzas de punta roma y tirar del tejido fuera de la cavidad. El uso de las tijeras curvas finas, cortar y retirar cualquier tejido gonadal que puede ser instalado en la almohadilla de grasa. Se pesa la almohadilla de grasa y encaje congelarlo en un tubo en nitrógeno líquido.
NOTA: Por lo general, este tejido adiposo se considera representativa de la masa total de grasa corporal en ratones y la disminución de peso con caquexia. Otros almohadillas de grasa pueden ser identificados de manera similar, disecados, retirados, y se pesaron. - Use las tijeras finas curvas para abrir el pecho del animal. Cortar las costillas unidas a ambos bordes laterales de la sternum. Retire el esternón. El uso de dos pares de pinzas, agarre a cada lado de la caja torácica y tirar de cada lado lateralmente para abrir la cavidad torácica.
- Delicadamente tire del corazón con los fórceps. escindir con cuidado el corazón con las tijeras finas curvadas por el corte de la aorta en la aurícula izquierda. Asegúrese de vaciar el órgano de la sangre residual mediante delicadamente secante contra un poco de papel absorbente. Pesar y encaje congelarlo en un tubo en nitrógeno líquido.
5. La congelación del músculo y de montaje
- Sumergir la mitad inferior de un pequeño vaso de precipitados de plástico (50 ml) que contiene isopentano en nitrógeno líquido. El isopentano está listo para usar cuando se vuelve ligeramente viscosa y forma un sólido revestimiento laminado blanco el interior del vaso de precipitados (temperatura: -160 ° C).
NOTA: Utilice siempre que no forman chispas herramientas de mano de bronce o aluminio. Evitar respirar el vapor de producto. Use con ventilación adecuada. Si se trata de un derrame y la ventilación es imposible o impractical, use un respirador adecuado. - Congelar algunos medio de inclusión en un mandril (corcho) sumergiéndola brevemente (10 seg) en isopentano.
- Manejar el músculo (por ejemplo., El tibial o gastrocnemio) sujetándola por el tendón, verticalmente en relación con el corcho, con el fin de mantener la orientación de las fibras y para permitir secciones transversales.
- posicionar cuidadosamente la porción de extremo del músculo fresco en la parte superior del medio de incrustación congelado.
NOTA: El músculo se pegará. Es importante NO rodean por completo el músculo con el medio de inclusión. También es importante para mantener la orientación vertical para la determinación posterior de la superficie de sección transversal. - Sumergir el mandril con el músculo adjunto en el baño de isopentano (el tiempo de congelación habitual es de 7 a 15 seg, dependiendo del tamaño y la composición de la muestra).
NOTA: La inmersión en la solución de congelación no debe durar más de lo necesario para congelar completamente la muestra. La congelación demasiado tiempo frac voluntadtura del bloque de tejido, mientras que un tiempo demasiado corto hará que la formación de cristales de hielo. Un espécimen bien congelados serán de color blanco tiza. - Después de congelar la muestra, colocarla en una pequeña bolsa de plástico o tubo de muestra (50 ml) e inmediatamente almacenarla en un congelador a -80 ° C o en nitrógeno líquido.
6. Análisis de los datos en bruto
- Para controlar las variaciones en el tamaño de los ratones, normalizar el peso corporal final (FBW); peso corporal libre de tumor; y la carcasa, de órganos, y el peso del tejido (expresada en gramos) de acuerdo con el peso corporal inicial (PCI), y los expresan como "peso / 100 mg IBW".
NOTA: Como alternativa, algunos investigadores a normalizar la masa muscular a la longitud de la tibia. - Utilice un software para el análisis de datos. Encuentre la media y la desviación estándar de los pesos normalizados. Realizar el análisis estadístico con pruebas t de Student no pareada entre los controles y los ratones portadores de C26.
NOTA: Los resultados se pueden presentar con respecto al cuerpo (IBWy los pesos FBW) libre de tumor, tumores, órganos, y tejidos.
7. Músculo Seccionamiento
- Ajuste la temperatura de trabajo de la cámara interior del criostato a alrededor de -23 ° C.
- Permitir que la muestra (previamente almacenado a -80 ° C) para que se aclimate a la temperatura de trabajo (un par de horas debería ser suficiente).
- Múltiple de corte 8-m de espesor secciones de la muestra (preferiblemente el tibial anterior o los músculos gastrocnemio) y recogerlos en portaobjetos de vidrio.
NOTA: Cortar la sección en la región media del vientre del músculo. Además, en aras de la exactitud, cortar las secciones perpendicularmente al eje de montaje. - Mantener las placas de vidrio dentro de la cámara del criostato. No deje que se descongelen si el objetivo es llevar a cabo estudios de SI / o IHC tinción enzimática.
- Almacenar las diapositivas a -80 ° C para análisis posteriores.
8. Evaluación de las miofibras Tamaño por laminina inmunofluorescencia (Alternativa 1)
19. Aunque la tinción H & E de secciones de músculo representa un método valioso y conveniente para el análisis de la morfología, el uso de un enfoque de IF 14 es significativamente más rápido y modestamente más preciso que el método basado en E H &. métodos H & E se describen a continuación.
- Retire las secciones de tejido, ya sea del criostato o el almacenamiento -80 ° C y dejar que se equilibren a temperatura ambiente (aproximadamente de 5 - 10 min).
NOTA: Con el fin de evitar interacciones no específicas asociadas con anticuerpos primarios planteados en ratones, es aconsejable, ya sea anticuerpos uso criados en otra especie o para hacer uso de kits de inmunodetección disponibles en el mercado "ratón-sobre-ratón". - Sumergir las secciones de pre-enfriamientometanol ed (-20 ° C) durante 10 min.
- Lavar las secciones en la temperatura ambiente 1x PBS durante 5 min.
- Retire el PBS y utilizar una pluma para aplicaciones de inmunohistoquímica para rodear las secciones de la diapositiva. NO permitir que las secciones completamente seco en cualquier momento.
- Aplicar un tampón adecuado de bloqueo (5-8% de FBS en PBS o 5% suero de cabra en PBS) sobre las secciones durante 1 hora a RT.
- Retire el amortiguador de bloqueo.
- Aplicar o bien un anti-laminina de conejo (1:30) o un anti-distrofina de ratón (1:30) anticuerpo primario en tampón de bloqueo a las secciones durante 2 horas a RT (o durante la noche a 4 ° C) en una cámara húmeda.
- Se lavan las secciones con 1x PBS durante 5 min.
- Eliminar el tampón de lavado y lavar las secciones de nuevo en 1 x PBS durante 5 min.
- Eliminar el tampón de lavado y aplicar un anticuerpo secundario fluorescente adecuada (1: 1000 en tampón de bloqueo) a las secciones en una cámara húmeda durante 1 hora a RT.
- Retire el anticuerpo secundario y se lavan las secciones con 1x PBS durante 5min.
- Retirar el tampón de lavado y repetir el lavado con 1 x PBS durante 5 min. Eliminar el tampón de lavado y cubrir las secciones con una cubierta de vidrio utilizando un medio de base acuosa.
- Identificar las características morfológicas de los músculos mediante el uso de imágenes digitales de la sección teñida. Con el fin de hacerlo, utilizar un microscopio de luz fluorescente invertida para SI secciones (un objetivo de aumento de 10X o 20X es apropiado), junto con una cámara y software de captura de imágenes digitales. Coloca una barra de escala en cada imagen digital (20 - Se recomiendan 30 campos al azar para cada sección del músculo) para facilitar la cuantificación de la CSA. Las imágenes deben ser guardados en formato .TIF para ser compatible con el software de análisis de imágenes utilizando el programa ImageJ.
- Utilice una macro ImageJ para distinguir tejido conectivo a partir de tejido contráctil (tamaño de miofibras) a través de la presencia del anticuerpo secundario fluorescente en el endomisio 20.
NOTA: La macro y las instrucciones están disponibles en la autenticaciónORS, Richard Lieber y Shannon Bremner. - Abra el programa ImageJ haciendo doble clic en el icono en el escritorio.
- Cargar la macro CSA haciendo clic una vez en la ficha "Plugins". Mover el cursor hacia abajo para seleccionar la opción "Instalar" haciendo clic en él una vez.
- Cargar la macro de la sección transversal mediante la selección de la carpeta que se ha guardado en, y luego haga clic en "Abrir".
- Una vez que la macro ha sido abierto, abra la imagen histológica que contiene la barra de escala haciendo clic en "Archivo" y luego "Abrir" en la barra de herramientas ImageJ.
- Una vez abierta la imagen, seleccione la "Herramienta de línea recta" en el programa ImageJ haciendo clic en el icono con la línea recta.
- Una vez seleccionada la "herramienta de línea recta", haga clic una vez en el extremo más a la izquierda de la barra de escala y haga clic una vez sobre el botón derecho del más extremo de la barra de escala. Cuando se hace correctamente, no debe haber una línea amarilla superpuesta en la barra de escala.
- Asegurarse de que el yellolínea w todavía se superpone sobre la barra de escala, seleccione la ficha "Analizar" de la barra de herramientas ImageJ haciendo clic en él una vez.
- En la ficha "Analizar", mueva el cursor hacia abajo y seleccione "escala establecida" haciendo clic en él una vez.
- En la ventana de "escala de Ajuste", NO cambiar el valor del campo "Distancia en píxeles" caja. Introduzca la distancia conocida de la barra de escala en el cuadro de "distancia conocida". Cambiar las unidades en el cuadro "Unidad de longitud" que se correspondan con las unidades de la barra de escala (es decir, micrómetros = M). Por último, seleccione "global" haciendo clic en la casilla a la izquierda de "Global" una vez.
- Cierre la ventana de "escala de Ajuste".
- Abrir la primera imagen que se desea medir pulsando el botón "O" en el teclado. Observar una ventana emergente que permite al usuario buscar y seleccionar la imagen que se mide desde la carpeta en la que se ha guardado. Seleccione la imagen haciendo clic una vez sobre ella y haciendo clic en "Abrir". <li> Una vez abierto, una ventana debería aparecer para la selección de la gama aceptable para las mediciones de CSA y de circularidad.
- Después de ajustar el rango de CSA y la circularidad, observar la imagen en píxeles de color rojo cubierto con una ventana "Umbral". Ajustar el umbral de la imagen utilizando las barras en la ventana de "umbral" hasta que las fibras musculares se llenan con precisión en píxeles rojos.
NOTA: intentar obtener el mayor número de fibras que no se toquen entre sí; si las fibras están en contacto, se medirán como una fibra grande, lo que tendrá que ser editado aguas abajo. - Después de ajustar el umbral, pulse la tecla "1" en el teclado para medir las fibras musculares.
- Con un círculo las fibras musculares individuales con una línea amarilla.Mover a través de la imagen y eliminar los artefactos o dobles fibras que han sido seleccionados por el programa. Para ello, seleccione las estructuras que no son fibras haciendo clic en ellos una vez, y luego presione el botón "D" en el teclado. Esto eliminarlos de las mediciones.
- Seleccionar y copiar las mediciones de la "ventana de valores de medición", y pegarlos en una hoja de cálculo para su posterior análisis.
NOTA: Los valores obtenidos también se pueden utilizar para evaluar el análisis de distribución de fibras, que generalmente representa un parámetro útil para determinar si el crecimiento del tumor promueve un cambio hacia las fibras musculares más pequeños. - Cierre todas las ventanas abiertas en ImageJ haciendo clic en la "X" en la esquina superior izquierda de las ventanas.
- Abrir una nueva imagen para medirse con la tecla "O" y repitiendo los pasos 8.24 a 8.29.
NOTA: Estos ajustes se suelen dejar a sus valores predeterminados. Sin embargo, si se desea cambiar esta configuración, asegúrese de mantener los valores de la misma para cada imagen consecutiva a ser medido en el experimento.
9. Evaluación del tamaño miofibrilar de H & E manchadas secciones (Alternativa 2)
- Colocar el vasose desliza en frascos Coplin con filtran hematoxilina de Harris durante 8 minutos.
NOTA: Como alternativa, Mayer hematoxilina se puede utilizar si se desea una mancha menos intensa. - Enjuague los portaobjetos en agua desionizada.
- Sumergir los portaobjetos en agua del grifo durante un máximo de 5 minutos.
- enjuagar rápidamente en agua desionizada, y luego incubar en solución filtrada eosina 1% durante menos de 2 min.
NOTA: Si se desea una mancha más intensa, añadir 1 - 2 gotas de ácido acético (0,01% o menos) a la solución de eosina. - Comience las etapas de deshidratación. Enjuague los portaobjetos en etanol al 70% durante menos de 1 min.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 90% durante 1 min.
- Sumergir los portaobjetos en 95% de etanol durante 1 min.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 2 min.
- Sumergir los portaobjetos en xileno durante 2 min. Mover las diapositivas a otro frasco que contiene Copley xileno fresco durante 2 minutos más.
NOTA: Mantenga los portaobjetos en xileno (no más de 1 hora) hasta que se cubrieron. - Coloque el coverslips en las secciones musculares utilizando Permount o un medio de montaje a base de xileno de elección.
- Los portaobjetos de vidrio teñidos con H & E bajo un microscopio con un aumento de 20X, y adquirir imágenes de todo el área de la sección del músculo. La obtención de imágenes mediante el uso de un microscopio de luz brillante, cámara digital y software de captura de imágenes.
NOTA: La presencia de una barra de escala o la imagen de un micrómetro tomada en la misma ampliación se requerirá para determinar la CSA. Como el anterior, ficha al menos 20 - 30 campos al azar para cada sección del músculo. - Evaluar el tamaño miofibrilar utilizando el software ImageJ. Abrir cada imagen digital. Establecer la escala que el anterior. Medir al menos 1.500-2.000 fibras musculares por músculo usando la herramienta de selección a mano alzada, la localización de la circunferencia de la fibra con un ratón o, para la entrada más rápido, con un dispositivo de entrada de tableta y el lápiz.
10. Data Collection y Análisis
- Para establecer el tamaño de la fibra muscular, evaluar el área media de las fibras "."Calcular medios y SD para las mediciones obtenidas para cada músculo, que incluye tanto el área y el diámetro de Feret. Además, con el fin de evaluar si la configuración experimental se asocia con un cambio hacia las fibras musculares, ya sea más pequeñas o más grandes, analizar la" distribución de fibra ".
- Evaluar la importancia del resultado mediante la realización de un T-test no pareado para dos grupos. Determinar las relaciones entre los valores obtenidos para el grupo de ratones C26 y para el grupo control. Colocar los valores en un gráfico informar de la SD medios y la frecuencia de distribución / histograma destinado a demostrar el cambio en las dimensiones de fibras.
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Representative Results
C26 cinética de crecimiento de tumores muestran una fase de latencia para la primera 7-8 d después de la inyección, seguido por un crecimiento celular exponencial (4-5 d). La masa tumoral llega finalmente ~ 10% del peso corporal (alrededor de 2 g; Figura 1A-B). Durante la primera fase, el tumor puede ser localizado por palpación solamente y aparece como una pequeña protuberancia de la piel. En la segunda fase, el tumor se observa como una masa bajo la piel. En raras ocasiones, el tumor se ulcera, resultando en una herida abierta; en este caso, el ratón se excluye del grupo experimental y se practicó la eutanasia humanitariamente.
El peso corporal no se ha modificado en la primera fase, pero se reduce significativamente en la segunda fase, cuando alcanza 10 a 15% del peso corporal inicial (30% en el caso de peso libre de tumor; Figura 1A). ratones portadores de tumores aparecen desperdician y mostraron piel disheveled al final de laperiodo experimental, con una condición corporal (CC) puntuación igual a 1 18 (Figura 1C). BC1 representa un ratón gravemente demacrada, donde las estructuras esqueléticas son evidentes y las vértebras son claramente segmentado. Pérdida de peso corporal se explica principalmente por tanto pérdida de masa muscular y grasa del tejido esquelético (Figura 1B). La pérdida de peso corporal es consistente con una reducción de aproximadamente 20 - 30% en peso del músculo esquelético, en particular en el gastrocnemio, tibial anterior y cuádriceps (Figura 2). El músculo cardiaco también se reduce significativamente en peso, aunque en menor medida en comparación con los otros músculos esqueléticos (Figura 2). Curiosamente, hepatomegalia (+ 16%, p <0,01) y esplenomegalia (+ 110%, p <0,01) se detectan generalmente en huéspedes tumorales, mientras que la masa grasa, similar a la del músculo esquelético, que se agota severamente (-70%, p <0,001 ; Figura 3).
(Figura 4A-B). En particular, el análisis de la distribución de frecuencia mostró un cambio hacia las fibras de menor tamaño en ratones C26-cojinete, lo que sugiere que todo el músculo sufre atrofia en presencia de un tumor C26 (Figura 4C). Resultados similares pueden observarse mediante el aprovechamiento de una metodología basada en E H & tradicional para la cuantificación de tamaño de la fibra, aunque la magnitud del cambio en la CSA muscular asociada con el crecimiento del cáncer es ligeramente diferente (38% versus control, p <0,01 para el IF método basado; -18% frente al control, p <0,01 para el método basado en E H &; Figura 5).
Figura 1: Los pesos corporales en el Control y ratones portadores de C26. A) curva de peso corporal en el control y hosts C26 durante todo el período experimental (14 días después de la inyección del tumor). B) peso corporal inicial (IBW), último peso corporal libre de tumor (FBW), y el peso del tumor en el control y C26- animales portadores. C) imágenes representativas de los controles y C26 portadores en el momento del sacrificio (día 14 después de la inoculación del tumor). Los datos se expresan como la media SD. n = 6. Importancia de las diferencias: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 frente al grupo control utilizando la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pesos musculares en el Control y la C26 ratones portadores. Los tibiales, gemelos, cuádriceps, y los pesos del corazón en el control y C26 de tumores portadores son reportados como el peso / 100 mg de peso corporal ideal. Los datos se expresan como la media SD. n = 6. Importancia de las diferencias: ** p <0,01 y *** p <0,001 frente al grupo control utilizando la prueba t de Student.
Figura 3:. Pesos de los órganos de control y ratones C26-cojinete El hígado, el bazo y el epidídimo pesos capa de grasa en el control y C26 de tumores portadores son reportados como el peso / 100 mg de peso corporal ideal. Los datos se expresan como la media SD. n = 6. significación de las diferencias: ** p <0,01 frente al grupo de control.
Figura 4: La morfometría de miofibrilar Tamaño por inmunofluorescencia. A) reacción inmunohistoquímica fluorescente de secciones tibial utilizando un anticuerpo anti-distrofina (Vector Laboratories) de control y hosts C26. Ampliación: 10 veces. Bar Tamaño:. 100 micras B) Cuantificación de CSA en el músculo tibial medido con la distribución de frecuencia ImageJ macro C) de la CSA en el músculo tibial de control y ratones portadores de C26.. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. n = 6 para cada grupo. Significación de las diferencias: ** p <0,01 frente al grupo control utilizando la prueba t de Student.
Figura 5: La morfometría de miofibrilar Tamaño de H & E. A) Hematoxilina y eosina tinción de secciones de control y tibiales anfitriones C26. Ampliación: 20X. Bar Tamaño:. 100 micras B) Cuantificación de distribución y frecuencia deCSA en el músculo tibial. Los datos se expresan como la media SD. n = 6. Importancia de las diferencias: *** p <0,001 frente al grupo control utilizando la prueba t de Student.
| autores | cepa de ratón | ratón de género | Numero de celular | Origen | Implantado como tumor sólido? | Sitio de la inyección | Días |
| Lázaro et al., 1999 | CD2F1 | METRO | 5 x 10 5 | NCI | NO | región dorsal | 17 |
| Al-Majid y McCarthy, 2001 | CD2F1 | F | 2,5 x 10 6 | OSUMC | NO | región dorsal | 17 |
| Samuels et al., 2001 | Balb / c | METRO | 0,5 g / ml de suspensión de tumor | ns | SÍ | región dorsal | Hasta 11 |
| Acharya et al., 2004 | CD2F1 | METRO | 1 x 10 7 | OSUMC | NO | flanco derecho | Hasta 24 |
| Aulino et al., 2010 | Balb / c | ns | 0,5 mm 3 | NCI | SÍ | región dorsal | 21 |
| Benny-Klimek et al., 2010 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NO | región dorsal | 14 |
| Bonetto et al., 2011; 2012 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NO | región dorsal | |
| Cosper y lienzo de 2010 | CD2F1 | H + M | 5 x 10 5 | ns | NO | flanco derecho | Hasta 27 |
| Murphy et al., 2012 | CD2F1 | ns | 5 x 10 5 | NCI / OSUMC | NO | región dorsal | 14 |
| Cornwell et al., 2014 | CD2F1 | METRO | 5 x 10 5 | NCI | NO | Derecho y Flanco izquierdo | Hasta 26 |
| Assi et al., 2016 | Balb / c | ns | 1 x 10 6 | Servicio de línea celular | NO | región dorsal | Hasta 22 |
Tabla 1:. La comparación de los diferentes protocolos utilizados para la implantación C26 Differense proporcionan protocolos para t C26 implantación, con particular referencia a la cepa de ratón utilizado, el número de células y tipo de tumor inoculado, el origen de célula, el sitio de la inyección, y la duración del período experimental. OSUMC: Centro Médico de la Universidad del Estado de Ohio. NCI: Instituto Nacional del Cáncer. línea celular NS servicio comercial: no especificado.
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Discussion
Especialmente en sus últimas etapas, el cáncer colorrectal se asocia con el desarrollo de la caquexia, que es responsable de los resultados y las reducciones en la calidad de vida del paciente más pobres. Muchos estudios se han centrado en el tratamiento de condiciones secundarias al cáncer; Sin embargo, a pesar de muchos esfuerzos en este sentido, aún no existe una terapia aprobada para la caquexia por cáncer 21. Por lo tanto, es imperativo que los modelos animales se asemejan a la patología humana tan estrechamente como sea posible a fin de maximizar la traducción de los resultados.
Ratones portadores de tumores C26 son un modelo experimental de uso común de la caquexia del cáncer 22-24. Este modelo se parece mucho a la enfermedad humana, mostrando reducciones en el cuerpo, los músculos y la masa grasa, así como la atrofia de las fibras musculares y aumento de la expresión de genes inflamatorios y ligasas de ubiquitina consistentes con hipercatabolismo marcada proteína 2,5. A pesar de esto, unas cuantas diferencias con los datos obtenidos en Patie cáncernts se han reportado 25,26. De hecho, algunas de las características del modelo, incluyendo el entorno de crecimiento no fisiológicos (por ejemplo, un tumor ectópico cultivaron subcutáneamente en lugar de ortotópicamente implantado en el tracto GI), el período experimental relativamente corto en comparación con otros modelos (por ejemplo, inyección, genética o ortotópico de tumores), la dependencia de la acción de IL-6, y el uso necesario de ratones CD2F1 o Balb / c puede representar limitaciones severas y podría limitar la interpretación de los resultados.
El protocolo actual ha demostrado ser altamente reproducible a través de muchos experimentos realizados en nuestro laboratorio, manteniendo las mismas características y permitiendo comparaciones entre los resultados obtenidos en diferentes momentos, en diferentes ubicaciones geográficas, y por diferentes investigadores 3,10. Sin embargo, con el fin de promover la reproducibilidad de los datos, es importante establecer directrices claras y comunes.
como gathered de la literatura, varias advertencias podría impedir la reproducción de los mismos datos en dos laboratorios diferentes. Por las mismas razones, el uso de diferentes protocolos puede generar diferentes fenotipos y resultados, así como llevar a resultados contradictorios y cuestionables. De hecho, se ha informado de las diferencias en la realización de este modelo animal, lo que resulta principalmente de la cepa (Balb / c o CD2F1) 2,5,27-29 o el sexo de ratones utilizados 17, el tipo de tumor que se implantó (una suspensión celular 3 , 29 en lugar de un tumor sólido en un injerto de 2,30), la fuente de tumor (NCI, ATCC, o OSUMC), el número de células C26 que se inyecta, y el sitio de inyección o implantación (los flancos 6,17, 31 o en la región dorsal 3,10,32). No comparación directa de los efectos asociados con la implantación de líneas celulares C26 obtenidos de diferentes fuentes (principalmente OSUMC frente NCI) nunca se ha realizado, lo que nos impide dibujo cualquier conclusi definitivaons. Sin embargo, es probable que la elección de la fuente de células también puede influir de manera significativa los resultados esperados. Al considerar la elección de los varones que en mujeres, los investigadores se les debe recordar a las diferencias significativas en los resultados. De hecho, según lo informado por Cosper y Leinwand 17, los ratones portadores de tumores masculinos, debido a la ausencia de estrógenos, pueden mostrar un fenotipo más grave que las hembras, incluyendo una mayor pérdida de la masa cardíaca y la mortalidad, una respuesta pro-inflamatoria más robusto al tumor y una mayor autofagia cardiaca.
Especialmente para los investigadores que no están familiarizados con este modelo y pueden enfrentarse inicialmente problemas, basada tanto en un análisis de poder y nuestra experiencia anterior, el uso de al menos 6 animales por condición experimental (n = 6) es aconsejable con el fin de detectar estadísticamente diferencias significativas. También es fundamental que la aleatorización se realiza con cuidado, de modo que los pesos corporales iniciales en los animales de experimentaciónno difieren significativamente entre los grupos. Del mismo modo, se aconseja que, con el fin de evitar la variabilidad inter-operador, el mismo investigador realice la recogida de tejido y órgano de cada animal. Además, es imperativo que los tejidos (particularmente musculares) se congelan lo más rápido posible con el fin de preservar los ARN y la estructura y la actividad enzimática, en especial si el objetivo del estudio es evaluar la expresión génica o para evaluar actividades enzimáticas. Por otra parte, en el intento de determinar la CSA muscular, hemos demostrado que informar de la zona de la fibra es generalmente aceptado y representante del tamaño de la fibra muscular. A continuación, presentamos dos métodos distintos para evaluar la CSA muscular. Como se muestra en las Figuras 4-5, ambos métodos fueron capaces de detectar una reducción significativa en miofibras tamaño entre los controles y los host tumorales, aunque el grado de perder apareció diferente.
Esta discrepancia puede deberse al hecho de que, aunque ambos métodos son formas aceptables para evaluartamaño de la fibra muscular s, la cuantificación de las características musculares de portaobjetos teñidos con H y E sigue siendo un proceso manual o semiautomática, lo más a menudo mucha mano de obra, que consume tiempo, y están afectadas por una precisión limitada. Sobre la base de nuestra experiencia, creemos que el método basado en el SI es una técnica más precisa para informar CSA muscular. De hecho, el número de fibras que se pueden medir de forma automática mediante el aprovechamiento de esta técnica es significativamente mayor, lo que aumenta la exactitud de la medición. Es de destacar que, para las dos técnicas, un método alternativo de tamaño del músculo de informes está evaluando el diámetro de la Feret. Curiosamente, esto se considera una herramienta muy fiable debido al hecho de que este parámetro es en gran medida independiente del ángulo de corte. Otros parámetros, tales como el "diámetro interior mínimo" y el "diámetro exterior mínimo" también son insensibles al plano de seccionamiento y se pueden utilizar en lugar del diámetro de la Feret como indicaciones alternativas de la fibtamaño er.
En conclusión, aunque la comunidad caquexia claramente necesita establecer modelos más fisiológicos para el estudio del desgaste muscular asociado a un tumor, creemos que los ratones que llevan el carcinoma de colon C26 representan un modelo bien estandarizada y fácil de usar para investigar las alteraciones moleculares y anormalidades fisiológicas generalmente detectan después de la aparición de un tumor. Las aplicaciones futuras implicar la investigación de si la implantación ortotópico de células C26 en el colon podría representar un modelo adecuado y más fisiológico de la caquexia por cáncer colorrectal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
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