En protokoll for å bruke Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensorer måle mekaniske krefter over hele Nuclear LINC Complex
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Kraft-følsomme, har genetisk kodede FRET sensorer nylig dukket opp som et viktig verktøy for å måle strekk-krefter basert på levende celler, gir innsikt i hvordan mekaniske krefter som påføres på tvers av proteiner 1, 2, 3, 4. Med disse verktøyene, kan forskerne ikke-invasiv bilde intracellulære krefter i levende celler ved hjelp av konvensjonelle lysrør mikroskoper. Disse sensorene består av et FRET-par (donor og akseptor fluorescerende proteiner, oftest en blå donor og akseptor gul) adskilt av en elastisk peptid 3. I motsetning til C- eller N-terminal merking, innføres denne sensoren inn i et indre område av et protein for å måle den mekaniske kraft som overføres på tvers av protein, oppfører seg som en molekylær strekklapp. Økt mekanisk spenning over sensoren resulterer i en øket avstand mellom de FRET-pluft, noe som resulterer i redusert FRET 3. Som et resultat, er FRET omvendt relatert til strekkspenning.
Disse fluorescerende-baserte sensorer har blitt utviklet for fokale adhesjonsproteiner (vinculin 3 og talin 4), cytoskjelettproteiner (α-aktinin 5), og celle-celle-junction-proteiner (E-cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, og PECAM 8). Det mest brukte og godt karakterisert elastisk linker i slike biosensorer er kjent som TSmod og består av en repeterende sekvens av 40 aminosyrer, (GPGGA) 8, som ble avledet fra spideren silke protein flagelliform. TSmod er blitt vist å oppføre seg som en lineær elastisk nano-fjær, med FRET respons på 1 til 5, pN av strekkraft tre. Forskjellige lengder av flagelliform kan brukes til å endre den dynamiske range av TSmod FRET-kraft følsomhet 9. I tillegg til flagelliform, gjentar spektrin 5 og villin headpiece peptid (kjent som HP35) 4 er blitt anvendt som de elastiske peptidene mellom FRET-par i tilsvarende kraft biosensorer 4. Endelig en fersk rapport viste at TSmod kan også brukes til å oppdage kompresjonskrefter 10.
Vi har nylig utviklet en kraftsensor for linkeren til den nucleo-cytoskjelettet (LINC) kompleks protein Nesprin2G ved hjelp TSmod innsatt i en tidligere utviklet avkortet Nesprin2G protein som kalles mini-Nesprin2G (figur 2C), som oppfører seg på samme måte som endogent Nesprin-2G 11. Den LINC Komplekset inneholder flere proteiner som fører fra utsiden til innsiden av kjernen, som forbinder den cytoplasmatiske cytoskjelettet på atom lamina. Nesprin-2G er et strukturelt protein å binde seg til bådeaktin cytoskjelettet i cytoplasma og til sol proteiner i perinukleære plass. Ved hjelp av vår biosensor, var vi i stand til å vise at Nesprin-2G er underlagt actomyosin avhengig spenning i NIH3T3 fibroblaster 2. Dette var første gang at styrken ble målt direkte over et protein i den kjernefysiske LINC komplekse, og det er sannsynlig å bli et viktig verktøy for å forstå hvilken rolle kraft på kjernen i mechanobiology.
Protokollen nedenfor gir en detaljert metodikk for hvordan man skal bruke Nesprin-2G kraftsensor, inkludert ekspresjonen av Nesprin spenningsføleren (Nesprin-TS) i pattedyrceller, samt innsamling og analyse av FRET bilder av celler som uttrykker Nesprin- TS. Ved hjelp av et invertert konfokalt mikroskop utstyrt med en spektral-detektor, gnage en beskrivelse av hvordan man skal måle sensibiliserte emisjon ved bruk av spektral unmixing og ratiometrisk FRET avbildning er gitt. Utgangs Proporsjonal Bildene kan brukes til å lage relativ quantitative kraft sammenligninger. Selv om denne protokollen er fokusert på ekspresjon av Nesprin-TS i fibroblaster, er det lett tilpasses til andre pattedyrceller, innbefattende begge cellelinjer og primære celler. Videre kan denne protokoll som det er relatert til bildeinnsamling og FRET analyse lett tilpasses andre FRET-baserte kraft biosensorer som er blitt utviklet for andre proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En fremgangsmåte og demonstrasjon av levende celle avbildning av mekanisk spenning over Nesprin-2G, et protein som i det kjernefysiske LINC-komplekset, ble beskrevet ovenfor. Forut for dette arbeidet, forskjellige teknikker, for eksempel mikropipette aspirasjon, magnetisk-perle-cytometri, og mikroskopisk laser-ablasjon, er blitt benyttet for å påføre belastning på cellekjernen og for å måle dens bulkmaterialegenskaper 16, 17, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeid ble støttet av Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memoria Trust (DEC) og NIH gi R35GM119617 (DEC). Det konfokale mikroskop avbildning ble utført ved VCU nano Karakterisering Kjerne (NCC) Facility.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
