A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.
Brystkræft er den hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed hos kvinder på verdensplan. Levermetastaser er involveret i op mod 30% af tilfældene med brystkræft metastaser, og resulterer i dårlige resultater med median overlevelse på kun 4,8 til 15 måneder. Aktuelle gnavermodeller for brystkræft metastase, herunder primær tumorcelle xenograft og spontane tumormodeller, sjældent metastaserer til leveren. Intracardiel og milten injektion modeller resulterer i levermetastaser, men disse modeller kan beskæmmes ved samtidig sekundær-site metastase eller ved kompromitteret immunitet på grund af fjernelse af milten for at undgå tumorvækst på injektionsstedet. For at imødekomme behovet for forbedrede levermetastaser modeller, en muse portal vene injektion metode, der leverer tumorceller først og direkte til leveren blev udviklet. Denne model leverer tumorceller til leveren uden komplikationer af samtidige metastaser i andre organer eller fjernelse af milten. optimized portal vene protokol beskæftiger små injektionsvolumener på 5 – 10 pi, ≥ 32 gauge nåle, og hæmostatisk gaze på injektionsstedet til at kontrollere for blodtab. Portåren injektion tilgang i Balb / C hunmus under anvendelse af tre syngene brysttumor linier af varierende metastatisk potentiale blev testet; høj-metastatisk 4T1 celler, moderat-metastatiske D2A1 celler og lav metastatiske D2.OR celler. Koncentrationer på ≤ 10.000 celler / injektion resulterer i en latenstid på ~ 20 – 40 dage for udvikling af levermetastaser med de højere metastatisk 4T1 og D2A1 linjer, og> 55 dage for mindre aggressiv D2.OR linje. Denne model er et vigtigt redskab til at studere brystkræft metastaser til leveren, og kan gælde for andre kræftformer, der ofte metastaserer til leveren, herunder kolorektal og pancreas adenokarcinomer.
Breast Cancer metastaser til leveren
Leveren er et fælles sted for brystkræft metastase, sammen med knoglen og lunge 1-3. Levermetastaser hos brystkræftpatienter er en uafhængig prognostisk faktor for meget dårlige resultater 4,5, som median overlevelse brystkræftpatienter med levermetastaser varierer fra 4,8 til 15 måneder 6-9. I modsætning hertil brystkræftpatienter med lunge eller knoglemetastaser har median overlevelse på 9 til 27,4 måneder 8,9 og 16,3 til 56 måneder 8,10-12 hhv. Metastase er en flertrinsproces, benævnt metastatisk kaskade, som begynder med formidling tumorcelle i den primære tumor og slutter med dødelighed patient på grund af såning og udvækst af cirkulerende tumorceller i et fjernt organ 13-15. Gnavermodeller for metastase har afsløret, at den metastatiske kaskade er bemærkelsesværdigt ineffektivt, med blot 0,02 – 10%af cirkulerende tumorceller oprettelse åbenlys metastase 16,17. En væsentlig flaskehals af metastatisk ineffektivitet er dikteret af de unikke væv mikromiljøer på sekundære sites, kaldet metastatiske nicher 18, fremhæver betydningen af forståelse stedsspecifik metastaser. Den metastatiske niche er unikt til stedet for tilbagefald, og er til dels karakteriseret ved aflejring af forskellige ekstracellulære matrixproteiner 19,20, infiltration af forskellige immun cellepopulationer 21-23, og ændret vævshomeostase herunder dysreguleret produktion af talrige cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer 15,18,24,25. Således er en forståelse af den vævsspecifikke metastatisk niche forud en forståelse af, hvordan man målretter metastatisk sygdom. Imidlertid er robuste modeller af levermetastaser mangler. Desuden vil forbedrede modeller for levermetastaser være afgørende for at identificere nye mål og effektive behandlinger for brystkræftpatienter with levermetastaser.
Etableret modeller til at studere Breast Cancer Metastase til leveren
For øjeblikket tilgængelige modeller til at studere brystkræft metastaser til leveren omfatter menneskelige kræftceller xenografter i immunkompromitterede mus. Disse modeller anvender typisk velundersøgte humane brystcancercellelinier såsom MCF-7 og MDA-MB-231 og Nude, RAG1 – / -, eller SCID immunsvækkede murine værter 26-29. Xenograftmodeller giver den fordel at inddrage menneskelige afledt kræft cellelinjer, men i betragtning af den seneste påskønnelse for immunceller i metastaser 30-32 og i terapeutisk modstand 33-35, studiet af metastaser i et helt immun kompetent vært er altafgørende. Modeller til at studere brystkræft metastase til leveren i immunkompetente værter indbefatter ortotopisk injektion af syngene tumorceller (f.eks 4T1 og D2A1 cellelinier) i brystfedtpuden, med eller uden kirurgiskresektion af den primære tumor, og efterfølgende vurdering af metastase 36-38. Notatet hastigheden af levermetastaser fra ortotopisk transplantation modeller er meget lav eller ikke-eksisterende i forhold til andre metastatiske steder såsom lunge 39,40, eller sker efter lunge metastase er etableret, komplicerer undersøgelse af lever-specifik metastaser 37,39 .
Tumor eksplanteret fra spontane gensplejsede brystkræft modeller kan re-injiceres i yverfedt puder af naive værter som syngene tumorceller. For eksempel blev det for nylig rapporteret, at spontane tumorer fra K14 Cre ECAD f / f P53 f / F mus, hvilken model invasive luftrør mammacancer, udvikle tumorer når orthotopisk indsprøjtes i vildtype værter. Efter kirurgisk resektion af disse tumorer, når de når 15 mm 2, 18% af musene skred til levermetastaser 40,41. En tredje fremgangsmåde til at modellere levermetastaser udnytterspontan metastase i genetisk modificerede mus. Til dato rapporter om spontane murine modeller af brystkræft metastase, som let spredes til leveren er ualmindelige. Undtagelser omfatter H19-IGF2, p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre, og K14 Cre ECAD f / f P53 f / f gensplejsede musemodeller, hvor levermetastaser udvikler i en lav procentdel af mus 38,41- 43. Således, mens gensplejsede musemodeller lette undersøgelsen af alle stadier af metastatisk kaskade, der giver stærke og klinisk relevante modeller, er de begrænset på grund af lave levermetastaser 38.
Adskillige metastase modeller omgå de indledende trin i den metastatiske kaskade herunder formidling af tumorceller fra den primære tumor og intravasation. Disse modeller tillader undersøgelse de senere trin i den metastatiske kaskade, fra ekstravasation til etablering af tumorer på sekundære sites. intracardiac injektion model leverer tumorceller i den venstre ventrikel, som fordeler tumorceller i kredsløbssystemet via aorta. Intrakardial injektion kræver ultralydvejledt billeddannelse af injektionsstedet eller andre billeddiagnostiske modaliteter såsom bioluminescens af luciferase mærkede celler for at bekræfte vellykket injektion. Tumorcelleinjektion via den venstre ventrikel kan resultere i knogler, hjerne, lunge, og / eller levermetastaser, blandt andre organer 44-48. På grund af multi-organ metastaser, disse mus ofte skal aflives før udvikling af åbenlys levermetastaser, bevirke, at evnen til fuldt ud at undersøge metastatisk vækst i leveren. En alternativ metode, der væsentligt minimerer udviklingen af multi-site metastaser er den milten injektion model. Milten injektion leverer tumorceller via milten vene, der slutter med den overlegne mesenteriske vene til at blive portalen vene 49,50. kan overvåges Dyr for outgrowth af metastatiske læsioner i leveren, fordi dannelsen af metastaser ved andre steder er sjældne, og som et resultat, er dyrets generelle sundhed opretholdes 49,50. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at milten model kræver splenektomi at undgå milt tumorer 49,50, en procedure, der påvirker immunforsvar. For eksempel er myocardial iskæmisk reperfusionsbeskadigelse karakteriseret ved infiltration af Ly6C + monocyt delmængder, der stammer fra milten og er ansvarlige for fagocytisk og proteolytisk aktivitet i løbet af sårheling efter iskæmi 51,52. Med splenektomi, der er en observeret reduktion i monocyt populationer, der hjælpe med sårheling 52. Endvidere har splenektomi vist sig at reducere primær tumor vækst og lungemetastaser i en ikke-småcellet lungekræft model, specielt gennem en reduktion i antallet af cirkulerende og intra-tumor CCR2 + CD11 + Ly6C + monocytisk myeloid celler 53. Derudover splenektomi efter milten injektion af coloncancerceller resulterede i reducerede niveauer af anti-tumor naturlige dræberceller i mesenteriske lymfeknuder og forhøjet levermetastaser 54. I sum, disse resultater tyder på, at splenektomi kompromiser immunsystemets rolle med efterfølgende konsekvenser for metastatisk celle skæbne.
Portal Vein Injection Model af levermetastaser
For at undersøge brystkræft metastase til leveren i en helt immun kompetent vært, under betingelser, hvor mus ikke er kompromitteret på grund af multi-organ metastaser, blev en portal vene injektion model udviklet. Intraportal injektion modeller er tidligere blevet anvendt til at studere levermetastaser af colorektal 55,56 og melanom 16 cellelinier; her beskriver vi anvendelsen af intraportal injektion for at modellere syngen brystkirtler tumorcellemetastase. Denne model kan anvendes til at studerede senere stadier af metastatisk kaskade herunder brystkræft celle ekstravasation og såning, tumor celle skæbne beslutninger om døden / spredning / vækstdvale, og udvækst i åbenlyse læsioner. I denne model er syngene brysttumorcellelinier injiceret via portåren af immunkompetente Balb / c-hunmus, en fremgangsmåde, der leverer tumorceller først og direkte til leveren uden fjernelse af milten. At udvikle denne model, brug af fire brysttumorcellelinier, der varierer i deres metastatiske kapacitet fra lav til høj var ansat: D2.OR, D2A1, og 4T1, og har ansat D2A1 mærket med grønt fluorescerende protein (D2A1-GFP) til undersøge tidlig tid-point efter tumorceller injektion. 4T1 er en meget metastatisk cellelinie afledt fra 410,4 tumor, som spontant opstod i en MMTV + Balb / c hunmus 36,37 og metastaserer til lunge, lever, hjerne og knogle fra brystfedtpude primære tumorer 39,57,58. D2A1 tumorceller were ligeledes oprindeligt stammer fra en spontan brysttumor hidrører fra en Balb / c-vært efter transplantation af D2 hyperplastiske alveolære knuder celler og bekræftet at være metastatisk fra den primære tumor til lungen 59,60. D2.OR tumorceller er en ikke-metastatisk søster linje til D2A1 linje og, selvom de undslippe den primære tumor og ankommer til sekundære steder, de sjældent etablere fjerne metastaser 60,61.
Desuden er det vigtigt at undgå brugen af almindeligt anvendte smertebehandling lægemidler, herunder ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) under eller efter den kirurgiske procedure. NSAID har anti-tumor aktivitet i visse brystcancere 62-65, og nogle klasser af NSAID øger risikoen for hepatotoksicitet 66,67, potentielt kompromittere studiet af levermetastaser og leveren metastatisk niche. Yderligere undersøgelser tyder på, at NSAID direkte indflydelse vævet mikromiljø, reducerer pro-metastatisk extracellular matrixproteiner tenascin-C 68 og fibrillært collagen 62,65. Alternativt brug af en opioid-derivat, buprenorphin, blev brugt på grund af dens effektivitet i smerte gnaver styring 69 og på grund af manglende beviser, at opioider har antitumoraktivitet 70. Denne portal vene injektion model blev optimeret til mindre injektionsvolumener på 5 – 10 pi at undgå unødig skade på leveren. Modellen blev også optimeret til at omfatte nåle med mindre diameter (≥ 32 gauge) og anvendelse af hæmostatisk gaze umiddelbart efter injektion for at minimere blodtabet under proceduren. I modsætning til disse optimerede injektion parametre bør celleantal bestemmes på individuel basis, baseret på det tumorigene potentiale cellelinie. Dog starter ved ≤ 10.000 celler / injektion for langtidsstudier anbefales. For kortere endepunkter (f.eks 24 timer efter injektion) betydeligt flere tumorceller (f.eks,1 x 10 5 – 1 x 10 6) kan anvendes, hvis berettiget. Sammenfattende portåren injektion model beskrevet her betegner et nyttigt værktøj til undersøgelse af brystkræft metastase til leveren og omgår en række begrænsninger andre levermetastaser modeller. Denne model letter undersøgelse af tumorceller ekstravasation, såning, tidlige skæbne beslutninger for overlevelse, proliferation og vækstdvale, og metastatisk udvækst i immunkompetente murine værter.
Balb / c-mus portal vene injektion model tillader studiet af brystkræftcellers læsioner i leveren i fravær af confounding multiorgansystemer metastase og i en helt immun kompetent vært. Vores protokol er en fremrykning af tidligere offentliggjorte kirurgiske procedurer, der tillader adgang til portåren til injektion af tumorceller direkte ind i leveren 16,55,56. Et avancement vi har gjort, er at reducere antallet af injicerede tumorceller fra ≥ 1 x 10 5 celler / injektion 16,55,56 ned til ≤ 10.000 tumorceller / injektion. Vi har også udvidet modellen for studiet af brystkræft metastase til leveren. Ved hjælp af denne protokol, to mammae cancer cellelinjer med kendt metastatisk potentiale udvikle levermetastaser med kortere ventetid end en mere hvilende brystkirtler tumor cellelinje. Endvidere ved tidlige tidspunkter, tumorceller fordelt over hele leverparenkym som enkelte eller små grupper af enkelt ceLLS efter tumorcelleinjektion. Modellen er klar til at behandle spørgsmål af metastatisk effektivitet herunder tumorceller ekstravasation, celleoverlevelse, hviletilstand, og proliferation – alle fænotyper, der bidrager til udviklingen af mikro-metastatisk og åbenlys metastatisk sygdom i leveren.
Det er vigtigt at overveje mange aspekter af den inden der påbegyndes undersøgelser portal vene injektionsprotokol. Omhyggeligt træffes beslutning om cellelinjer, koncentration celle, total celle nummer, og de endelige interessepunkter baseret på mindre forundersøgelser er stærkt anbefales. Endvidere er anvendelsen af immunkompetente værter og syngene cellelinjer er af største betydning for forståelsen vært-tumor celle-interaktioner. Den nyudviklede "glødende hovedet" mus, der udtrykker eGFP og luciferase fra den forreste hypofyse er et vigtigt redskab til at fjerne vært reaktioner på eksogene eGFP og luciferase, proteiner ofte bruges til at mærke brysttumor linier 75 </sup>. Anvendelse af "glødende hovedet" mus og syngene mærkede tumorceller vil lette nem identifikation af enkelte formidles celler og mikrometastatisk foci ved IHC uden bekymring af inflammatoriske reaktioner på eGFP eller luciferase. Ligeledes, at vælge smerte ledelsesstrategier omhyggeligt for at sikre minimal anti- eller pro-tumor effekt af narkotika behandlingsregime anbefales kraftigt. Kritiske trin i denne protokol omfatter opretholdelse af sterile forhold i hele kirurgi for at sikre, at infektionen ikke forekommer, da dette vil forvirre nogen resultater. Det er også vigtigt, at nålen er korrekt placeret i portvenen at sikre, at tumorceller leveres til leveren. Øve protokollen med farvestoffer som Indien blæk vil hjælpe med dette problem. Tumor vækst på huden incisionssted det er den bedste indikator for, at forkert nål placering indtraf. Endelig er det afgørende, at blodtab fra portåren tilstrækkeligt kontrolleret, og ophører helt inden suturing dyret. Anvendelsen af hæmostatiske gaze spænder mindsker risikoen for ukontrolleret blodtab fra portåren efter injektion. I vores hænder, blev proceduremæssig relateret mortalitet som følge af blodtab fra portåren efter injektion reduceret fra 30% til 2% af musene med brugen af hæmostatisk gaze.
Det er vigtigt at bemærke, at portåren injektion model ikke replikere hele metastatisk kaskade, men er begrænset til studiet af tumorcellen ekstravasation, tumor celle-niche interaktioner efter ekstravasation og tumorvækst. Modeller, der præcist replikerer den fulde metastatisk kaskade til leveren, såsom forekommer i patienter, der er et presserende behov for. En yderligere begrænsning af portalen vene injektion model er, at den er forstyrret af virkningen af kirurgi på værten, med sårheling vides at påvirke sygdommens progression 76,77.
Portalen vene injektion model repræsenterer en forbedring på anden injektionmodeller til at studere levermetastaser, herunder intrakardiale og milten modeller. Specifikt portåren injektion model giver mulighed for studiet af et større udvalg af sygdomsprogression end intrakardial model, som ofte begrænset af samtidige metastaser i andre væv. Endvidere er portåren modellen ikke kompliceres ved fjernelse af milten, som det sker i den milten model.
Portalen vene injektion model kan vise sig et nyttigt redskab for studiet af levermetastaser i almindelighed. Levermetastaser er den hyppigste sted for metastase i adenocarcinomer samlet, med særligt høje frekvenser i pancreascancer (85% af metastaser er til leveren), colon og rektal adenocarcinomer (> 70%), samt mave og esophageal (> 30 %) 1. Selvom spontane og ortotopisk primære tumor modeller af pancreas og colon adenokarcinomer lettere metastaserer til leveren 78,79, kan portalen vene injektion model prove nyttigt at forstå den metastatiske proces af disse kræftformer kontrolleret levering af tumorceller tillader biokemiske, molekylære og histologiske vurderinger på bestemte tidspunkter efter tumor celle ankomst. Sammenfattende portalen vene injektion model repræsenterer en vigtig forbedring på tilgængelige levermetastaser modeller af brystkræft, og kan også være gældende for den levermetastaser område i almindelighed.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 – 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously |
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site |
anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
Heating Pad, x2-3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12°angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |