A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.
Bröstcancer är den vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet hos kvinnor över hela världen. Levermetastaser är involverad i uppemot 30% av fallen med bröstcancer metastaser, och resulterar i dåliga resultat med medianöverlevnadsgrad av endast 4,8-15 månader. Nuvarande gnagarmodeller av bröstcancermetastaser, inklusive primär tumörcell xenograft och spontana tumörmodeller, sällan metastaserar till levern. Intrakardiell och mjälten injektion modeller resulterar i levermetastaser, men dessa modeller kan förväxlas med samtidig sekundär plats metastaser, eller genom nedsatt immunförsvar på grund av avlägsnande av mjälten för att undvika tumörtillväxt vid injektionsstället. Att ta itu med behovet av förbättrade levermetastaser modeller, en mus portådern injektion metod som levererar tumörceller först och direkt till levern utvecklades. Denna modell ger tumörceller till levern utan komplikationer av samtidiga metastaser i andra organ eller borttagande av mjälten. optimized portvenen protokoll utnyttjar små injektionsvolymer på 5-10 l, ≥ 32 gauge nålar och hemostatisk gasväv på injektionsstället för att kontrollera för blodförlust. Portvenen injektion tillvägagångssätt i Balb / c honmöss med användning av tre syngena brösttumörlinjer av varierande metastatisk potential testades; hög metastatisk 4T1 celler, måttlig metastatiska D2A1 celler och låg metastatiska D2.OR celler. Koncentrationerna av ≤ 10.000 celler / injektion resulterar i en fördröjning av ~ 20 – 40 dagar för utveckling av levermetastaser med högre metastaserande 4T1 och D2A1 linjer, och> 55 dagar för mindre aggressiv D2.OR linje. Denna modell är ett viktigt verktyg för att studera bröstcancer metastaser till levern, och kan tillämpas på andra cancerformer som ofta metastasera till levern, inklusive kolorektal och pankreas adenokarcinom.
Bröstcancer metastas till levern
Levern är en vanlig plats för bröstcancer metastaser, tillsammans med ben och lunga 3/1. Levermetastaser hos bröstcancerpatienter är en oberoende prognostisk faktor för mycket dåliga resultat 4,5, som medianöverlevnad av bröstcancerpatienter med levermetastaser varierar från 4,8 till 15 månader 6-9. Däremot bröstcancerpatienter med lung- eller skelettmetastaser har medianöverlevnadsgrad av 9 till 27,4 månader 8,9 och 16,3 till 56 månader 8,10-12 respektive. Metastas är en flerstegsprocess, som kallas den metastatiska kaskaden, som börjar med tumörcellspridning i den primära tumören och slutar med patientens dödlighet på grund av sådd och utväxt av cirkulerande tumörceller inom en avlägsen organ 13-15. Gnagarmodeller av metastaser har visat att den metastatiska kaskaden är anmärkningsvärt ineffektivt, med endast 0,02 till 10%av cirkulerande tumörceller upprättande overt metastas 16,17. En stor flaskhals av metastaserande ineffektivitet dikteras av de unika vävnadsmikromiljöer på sekundära platser, som kallas metastatiska nischer 18, belyser vikten av att förstå platsspecifika metastaser. Den metastatiska nisch är unik till stället för återkommande, och är, delvis, som kännetecknas av avsättning av distinkta extracellulära matrisproteiner 19,20, infiltration av olika immuncellpopulationer 21-23, och förändrad vävnadshomeostas inklusive dysreglerad produktion av talrika cytokiner, kemokiner och tillväxtfaktorer 15,18,24,25. Således föregår en förståelse för vävnadsspecifika metastaserad nisch en förståelse för hur man riktar metastaserad sjukdom. Men robusta modeller av levermetastaser saknas. Vidare kommer förbättrade modeller av levermetastaser vara avgörande för att identifiera nya mål och effektiva behandlingar för bröstcancerpatienter with levermetastaser.
Etablerade modeller för att studera bröstcancer metastasering till levern
För närvarande tillgängliga modeller för att studera bröstcancer metastaser till levern innefattar humana cancercell xenotransplantat i nedsatt immunförsvar möss. Dessa modeller använder vanligtvis väl studerade humana bröstcancercellinjer såsom MCF-7 och MDA-MB-231 och naken, Rag1 – / -, eller SCID nedsatt immunförsvar murina värdar 26-29. Xenograft-modeller ger fördelen att involvera människor som härrör cancercellinjer, men med tanke på den senaste tidens appreciering för immunceller i metastaser 30-32 och i terapeutiska motstånd 33-35, är studiet av metastaser i en helt immun kompetent värd avgörande. Modeller för att studera bröstcancer metastas till levern i immunkompetenta värdar innefattar orthotopic injektion av syngena tumörceller (t.ex. 4T1 och D2A1 cellinjer) in i bröstfettkudden, med eller utan kirurgiskresektion av primärtumören och efterföljande utvärdering av metastaser 36-38. Notera, är graden av levermetastaser från orthotopic transplantation modeller mycket låg eller obefintlig jämfört med andra metastatiska platser såsom lunga 39,40, eller inträffar efter lungmetastaser är etablerad, vilket komplicerar studie av leverspecifika metastaser 37,39 .
Tumör explantat från spontana genetiskt manipulerade bröstcancer modeller kan återinföras i bröstfettkuddarna hos naiva värdar som syngena tumörceller. Till exempel, har nyligen rapporterat att spontana tumörer från K14 Cre ECAD f / f P53 F / F möss, vilken modell invasiv lobulär bröstcancer, utveckla tumörer när ortotopiskt injiceras i vildtyp värdar. Efter kirurgisk resektion av dessa tumörer när de når 15 mm 2, fortskred 18% av mössen till levermetastaser 40,41. Ett tredje sätt att modellera levermetastaser Återvinnarespontan metastas i genetiskt modifierade möss. Hittills rapporter om spontana musmodeller av bröstcancer metastaser som lätt sprider sig till levern är ovanligt. Undantag inkluderar H19-IGF2, p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre och K14 Cre ECAD f / f P53 f / f genetiskt modifierade musmodeller, där levermetastaser utvecklas i en låg andel av möss 38,41- 43. Således, medan genetiskt manipulerade musmodeller underlätta studier av alla stadier av den metastatiska kaskaden, som ger kraftfulla och kliniskt relevanta modeller, är de begränsade på grund av låga hastigheter av levermetastaser 38.
Flera metastas modeller förbi de första stegen i metastaserande kaskad inklusive spridning av tumörceller från den primära tumören och intravasering. Dessa modeller tillåter utredning de senare stegen i metastaserande kaskad, från extravasation etablering av tumörer på sekundära platser. intracardiac injektion modell levererar tumörceller i vänster kammare, som distribuerar tumörceller i cirkulationssystemet via aorta. Intrakardiell injektion kräver ultraljud guidad avbildning av injektionsstället eller andra avbildningsmetoder såsom bioluminiscens av luciferas taggade celler för att bekräfta lyckad injektion. Tumörcellinjektion via den vänstra ventrikeln kan resultera i ben, hjärna, lunga, och / eller levermetastaser, bland andra organ 44-48. På grund av metastaser flera organ dessa möss behöver ofta avlivas före utveckling av öppen levermetastaser, motverkar möjligheten att fullt ut undersöka metastatisk tillväxt i levern. Ett alternativt tillvägagångssätt som väsentligt minskar utvecklingen av multi-site metastaser är mjälten injektionen modellen. Mjälten injektion levererar tumörceller via mjälten ven som går med den överlägsna tarmkäxvenen att bli portådern 49,50. Djur kan övervakas för outgrowth av metastatiska lesioner i levern eftersom bildningen av metastaser på andra platser är sällsynt, och som ett resultat, är djuret allmänna hälsa bibehålls 49,50. Det är emellertid viktigt att notera att den i mjälten modellen kräver splenektomi för att undvika från mjälte tumörer 49,50, ett förfarande som påverkar immunförsvaret. Till exempel är myokardischemi reperfusionsskada som kännetecknas av infiltration av Ly6C + monocyt delmängder som härrör från mjälte och är ansvariga för fagocytiska och proteolytisk aktivitet under sårläkning efter ischemi 51,52. Med splenektomi, det finns en observerad reduktion i monocyt populationer som bistå vid sårläkningen 52. Vidare har splenektomi visats minska primärtumörtillväxt och lungmetastaser i en icke-småcellig lungcancer modell, särskilt genom en minskning av antalet cirkulerande och inom tumör CCR2 + CD11b + Ly6C + monocytisk Myelosuppressionid cellerna 53. Dessutom, splenektomi efter mjälten injektion av koloncancerceller resulterade i minskade nivåer av anti-tumör naturliga mördarceller i kröslymfknutor och förhöjda levermetastaser 54. Sammanfattningsvis tyder dessa fynd att splenektomi äventyrar immunsystemets roll med efterföljande konsekvenser för metastaserande cell öde.
Portvenen Injektion Modell av levermetastaser
För att undersöka bröstcancer metastaser till levern i en helt immun kompetent värd, under förhållanden där möss inte äventyras på grund av metastaser flera organ var en portådern injektion modell som utvecklats. Intraportal injektion modeller har använts tidigare för att studera levermetastaser av kolorektal 55,56 och melanom 16 cellinjer; Här beskriver vi tillämpning av intraportal injektion för att modellera syngena brösttumörcellmetastaser. Denna modell kan användas för att studerade senare stadierna av metastaserande kaskad inklusive bröstcancercellinje extravasering och sådd, tumörcell öde beslut om död / spridning / dvala, och utväxt i uppenbara skador. I denna modell är syngena brösttumörcellinjer injiceras via portådern av immunkompetenta Balb / c-möss av honkön, en metod som ger tumörceller först och direkt till levern utan avlägsnande av mjälten. Att utveckla denna modell, användning av fyra brösttumörcellinjer som sträcker sig i metastaserad kapacitet från låg till hög användes: D2.OR, D2A1 och 4T1, och har anställt D2A1 märkt med grönt fluorescerande protein (D2A1-GFP) till undersöka tidigt tidpunkter efter tumörcellinjektion. 4T1 är en mycket metastatisk cellinje härledd från 410,4 tumör som spontant uppkom i en MMTV + Balb / c-mus av honkön 36,37 och metastasizes till lunga, lever, hjärna och ben från juverfett pad primära tumörer 39,57,58. D2A1 tumörceller were också ursprungligen härledd från en spontan brösttumör som härrör från en Balb / c-värd efter transplantation av D2 hyperplastiska alveolära knuta celler, och bekräftas vara metastatisk från den primära tumören till lungan 59,60. D2.OR tumörceller är en icke-metastatisk syster linje till D2A1 linjen och, även om de fly den primära tumören och anländer till sekundära platser, de sällan upprätta fjärrmetastaser 60,61.
Dessutom är det viktigt att undvika användning av vanligen använda smärtlindring läkemedel inklusive icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) under eller efter den kirurgiska proceduren. NSAID har antitumöraktivitet i vissa bröstcancer 62-65, och vissa klasser av NSAID öka risken för levertoxicitet 66,67, potentiellt äventyra studiet av levermetastaser och levermetastaserande nisch. Vidare studier tyder på att NSAID direkt påverka vävnadsmikro, minska pro-metastaser extracellular matrixproteiner tenascin-C 68 och fibrillärt kollagen 62,65. Alternativt, användning av en opioid-derivat, buprenorfin, användes på grund av dess effekt i gnagare smärtbehandling 69 och på grund av bristen på bevis att opioider har anti-tumöraktivitet 70. Denna portal ven injektion modell optimerad för mindre injektionsvolymer på 5 – 10 ^ för att undvika onödiga skador på levern. Modellen har också optimerats för att inkludera nålar med mindre diameter (≥ 32 gauge) och användning av BLODS gasväv omedelbart efter injektion för att minimera blodförlust under förfarandet. I motsats till dessa optimerade injektion parametrar, bör antalet celler bestämmas på individuell basis, baserat på tumörframkallande potential cellinje. Men, med början på ≤ 10000 celler / injektion för långtidsstudier rekommenderas. För kortare endpoints (t.ex. 24 timmar efter injektion) betydligt fler tumörceller (t.ex.,1 x 05-01 oktober x 10 6) kan användas om det är befogat. Sammanfattningsvis, portvenen injektions modell beskrivs här utgör ett användbart verktyg för att studera bröstcancer metastaser till levern och kringgår ett antal begränsningar av andra levermetastaser modeller. Denna modell möjliggör studier av tumörcell extravasering, sådd, tidig öde beslut överlevnad, proliferation och dvala och metastaserande utväxt i immunkompetenta murina värdar.
Balb / c-mus portvenen injektion modell tillåter studiet av bröstcancer lesioner i levern i frånvaro av confounding många organ metastasering och i ett fullt immun kompetent värd. Vår protokoll är ett framsteg över tidigare publicerade kirurgiska procedurer som tillåter åtkomst till portvenen för injektion av tumörceller direkt in i levern 16,55,56. En framsteg vi har gjort är att avsevärt minska antalet injicerade tumörceller från ≥ 1 x 10 5 celler / injektion 16,55,56 ner till ≤ 10000 tumörceller / injektion. Vi har också utökat modell för studier av bröstcancer metastaser till levern. Med hjälp av detta protokoll, två bröstcancercellinjer med känd metastatisk potential att utveckla levermetastaser med kortare latens än en mer vilande brösttumör cellinje. Vidare, vid tidiga tidpunkter, är tumörceller fördelade över hela leverparenkymet som enskilda eller små grupper av enstaka cells efter tumörcellinjektion. Modellen är redo att ta itu med frågor om metastatisk effektivitet inklusive tumörceller extravasering, cellöverlevnad, dvala, och spridning – alla fenotyper som bidrar till utvecklingen av mikrometastatisk och öppen metastaserad sjukdom i levern.
Det är viktigt att tänka på många aspekter av portvenen injektionsprotokoll innan man inleder studier. Noggrant besluta om cellinjer, cellkoncentration, totalt cellantal, och slutpunkter av intresse baserat på mindre förberedande studier rekommenderas starkt. Vidare är av yttersta betydelse för att förstå värd-tumörcellinteraktioner användningen av immunkompetenta värdar och syngena cellinjer. Den nyutvecklade "glödande head" mus som uttrycker EGFP och luciferas från den främre hypofysen är ett viktigt verktyg för att eliminera värd svar på exogen EGFP och luciferas, proteiner ofta används för att märka brösttumörlinjer 75 </sup>. Användning av "glödande huvud" mus och syngena märkta tumörceller kommer att underlätta enkel identifiering av enskilda sprids celler och mikrometa härdar med IHC utan bekymmer av inflammatoriska reaktioner på EGFP eller luciferas. På samma sätt väljer strategier smärtlindring noggrant för att säkerställa minimal anti- eller pro-tumör effekt från läkemedelsbehandlingsregim rekommenderas starkt. Kritiska steg i detta protokoll omfattar bibehålla sterila betingelser under operationer för att säkerställa att infektion inte förekommer, eftersom detta kommer att förvirra några resultat. Det är också viktigt att nålen är korrekt placerad i portvenen för att säkerställa att tumörceller levereras till levern. Öva protokollet med färgämnen som tusch kommer att bidra med denna fråga. Tumörtillväxt på huden snittet platsen är den bästa indikatorn att felaktig nål placering inträffade. Slutligen är det viktigt att blodförlust från portalen ven på ett adekvat sätt och upphör helt före suturing djuret. Användningen av hemostatiska gasväv minskar avsevärt risken för okontrollerad blodförlust från portalen ven efter injektion. I våra händer, var förfaranderelaterad mortalitet på grund av blodförlust från portalvenen efter injektion minskas från 30% till 2% av möss med användning av hemostatiska gasväv.
Det är viktigt att notera att portvenen injektion modellen inte replikera den fulla metastaser kaskad, men är begränsad till studiet av tumörcell extravasering, tumörcell-nisch interaktioner vid extravasation och tumörtillväxt. Modeller som exakt efterliknar hela metastaserande kaskad till levern, såsom förekommer i patienter, finns ett stort behov. En ytterligare begränsning av portalen ven injektion modell är att det är skam av effekterna av kirurgi på värden, med sårläkning känd för att påverka sjukdomsprogression 76,77.
Portalen sveninjektion modell representerar en förbättring jämfört med andra injektionmodeller för att studera levermetastaser, inklusive intrakardiell och mjälten modeller. Specifikt möjliggör studier av ett större utbud av sjukdomsprogression än intrakardiell modellen, som ofta begränsas av åtföljande metastaser i andra vävnader portalen sveninjektion modell. Vidare är portvenen modellen inte komplicerat genom avlägsnande av mjälten, vilket görs i den i mjälten modell.
Portvenen injektion modellen kan vara ett användbart verktyg för att studera levermetastaser i allmänhet. Levermetastaser är den vanligaste platsen för metastaser i adenokarcinom övergripande, med särskilt höga nivåer i pankreascancer (85% av metastaser är till levern), tjocktarms- och ändtarms adenokarcinom (> 70%), liksom magen och matstrupen (> 30 %) 1. Även om spontana och orthotopic primära tumörmodeller av pankreatiska och kolon adenokarcinom lättare metastasera till levern 78,79 kan portalsveninjektion modell Prove användbar för att förstå metastatiska processen av dessa cancerformer som kontrollerad leverans av tumörceller möjliggör biokemiska, molekylära och histologiska bedömningar vid bestämda tidpunkter efter tumörcell ankomst. Sammanfattningsvis representerar portalsveninjektion modell en viktig förbättring jämfört med tillgängliga levermetastaser modeller av bröstcancer, och kan också vara tillämplig på levermetastaser området i allmänhet.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 – 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously |
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site |
anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
Heating Pad, x2-3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12°angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |