Abstract
肥胖是一个重大的公共健康问题，以4〜28％的男性和6.2〜36.5％的妇女在欧洲（2003年至2008年）患病。病态肥胖通常与代谢并发症，如2型糖尿病，高血压和血脂异常相关，降低寿命和质量。在没有任何有效的非侵入性的治疗，减肥手术是治疗病态肥胖（体重指数（BMI）“40公斤/米2）一个有价值的治疗选择，从而导致长期的，持续的代谢并发症体重减轻和改善。然而，维持减肥手术的有益效果的底层的细胞和分子机制尚未完全清楚。由于可用众多遗传修饰的菌株，所述的小鼠模型是最方便的动物模型，探讨背后减肥手术的多效性有益效果的分子机制。在这里，我们详细介绍了优化healthc是在小鼠中的两个最广泛使用的减肥手术的方法和手术的协议：该套筒胃和改性空肠Roux-en-Y胃旁路。破译底层减肥手术的治疗作用的分子机制提供了新的识别目标的疗法的承诺。
Introduction
肥胖和糖尿病的全球大流行病是在严重性毁灭性的。全球超过两十亿成年人（占总人口的30％）是超重（BMI> 25公斤/米2）或肥胖（BMI> 30公斤/米2）1。这可以与代谢的并发症，如2型糖尿病，高血压，和血脂异常一起走，导致增加的发病率和死亡率。肥胖会增加整体死亡率和癌症2的患病率。由于缺乏任何有效的无创治疗，减肥手术表示可以导致长期的，持续的体重减轻3,4是唯一的选择。许多不同的手术方法已被开发，但在套筒胃切除术（SG）和空肠Roux-en-Y胃旁路术（RYGB）是在临床实践中最常使用的两个过程。在SG过程，胃的初始体积的80％是拆除;因此，该技术是提高饱限制性手术之一。该RYGB是的制约，吸收不良的技术之一。 RYGB中，创建了一个小胃囊（总胃体积的1-2％）和肠被重新布置成Y形，其中延迟消化和营养物质的吸收。这两种技术导致显著体重减少和普遍改善在频繁相关的合并症（ 例如，高血压，2型糖尿病和血脂异常）3，与RYGB看到一个更高的效率。然而，后面的减肥手术的多效性有益效果的分子机制常常没有完全阐明。由于可用的众多基因改造的菌株，小鼠模型是最方便的动物模型来研究这些分子机制。
然而，减肥手术很难直接适应小动物模型和requirË高外科灵巧。而SG可以容易地在啮齿类动物中具有很好的存活率进行RYGB是在小鼠致死因严重肠梗阻5。不同改性RYGB技术已经被提出来抵消这个问题，特别是oesojejunostomy 5。在这里，我们提出了另一种选择：无胃切除胃空肠造口。本变形RYGB再现大多数的人类中观察到的有益效果（即一个显著体重减少和在葡萄糖和脂质体内稳态的改善）。
此稿件旨在总结和讨论小鼠SG与RYGB的技术和实验细节，并促进这些程序与视频的帮助。具体的亮点将有关的术前和术后保健的协议，使维生素和铁缺乏减少优化进行。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物和住房：获取8周龄C57BL / 6雄性小鼠。在10周龄，给水C57BL / 6小鼠免费接入和高脂肪的饮食（DIO饮食：脂肪35％千卡，25.8％酪蛋白，1.30％的矿物AIN，1.30％的维生素，1.70％，磷酸氢钙，0.7 ％碳酸钙，2.10％柠檬酸钾，0.026％胆碱酒石酸氢盐，8.9％蔗糖，0.384％胱氨酸，6.5％的纤维素，31.7％猪油，3.3％大豆油，和16.29％麦芽糖糊精）8（SG）或14（RYGB）之前的减肥手术周。促进体重增加，给专用于RYGB手术（假＆RYGB）含水20％果糖的小鼠（重量/体积）除了高脂肪的饮食。
伦理学声明：下述所有协议的步骤如下道德委员会对动物实验的指导方针下，自付批准文号01953.01卢瓦尔广场。
1.一般术前准备
- 快小鼠在手术前6小时。凝胶迪等食品给予手术前和手术专用的前一天3天。 （0.4升/分钟双氧）中，用5％异氟醚（0.4升/分钟）和O 2的室诱导麻醉。执行脚趾捏测试，以确认该麻醉是有效的。管理通过皮下注射止痛剂（0.1毫克/千克丁丙诺啡），抗生素（10毫克/千克marbofloxacine），和亲动力学（1毫克/千克胃复安）。
- 分配给外科手术（远离实验室的交通和换气扇），具体的工作区。请用专用的硬表面消毒手术区。广场上的工作空间区域加热垫手术过程中保持鼠标homeothermy。应用清洁，吸水性底垫在加热垫。
- 从胸骨刮腹部用电动剃须刀到骨盆。包装在无菌保鲜膜（ 图1A和2A）鼠标的腹部，并放置在仰卧位将鼠标放在加热p广告。
- 对眼睛应用兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。鼠标放置在鼻锥和保持用2％异氟醚（0.4升/分钟）和O 2（0.4升/分钟）麻醉。
- 在开始手术前，戴上无菌检查袍，一次性磨砂帽，口罩和无菌手套。打开包含消毒手术器械一套，这是需要手术的所有步骤蒸压包。切灭菌保鲜膜一个窗口，并用消毒2次连续聚维酮碘溶液皮肤。
2.胃切除术：手术过程
- 剖腹探查术中位数（图1B）
- 下双目显微镜和用手术刀，执行从胸骨正中切口腹部打开腹腔（不损坏腹肌）的中间。保护带37℃的生理盐水溶液中浸泡过的无菌压缩皮肤。
- 胃曝光（图1C）
- 轻轻地调动使用浸湿，棉签胃。不受用浸湿的棉签或微型剪刀其横向紧密结缔组织附件的胃。
- 轻轻地，完全外部化胃和放置止血胶原压缩胃的后方。缝合沿胃大弯侧幽门和食道艘8.0非吸收缝合线，以避免将来出血（ 图1D和E）。注意：使用止血剂可诱发组织损伤，确保只使用它的组织，旨在切除。
- 胃的心脏区域的切除术（眼底）
- 在目前的幽门区（主体）和胃（眼底）的心脏区域（ 图1F）之间的解剖行执行胃造瘘术。
- 与对待每2浸湿的棉签去除残留的食物胃的一面。采用微型剪刀，切胃沿胃底和胃（ 图1G）的主体之间的边界。
- 按止血胶原大出血的情况下压缩2分钟。关闭从胃oesophagal结用8.0不可吸收缝线的胃开口的切口（ 图1H）结束。
- 胃幽门区切除术（阴茎）
- 完成沿大弯胃切除，以便除去胃中（ 图1I）的大约80％。规范SG的宽度至3毫米。按止血胶原大出血的情况下压缩2分钟。
- 8.0非吸收缝合线（ 图1J）关闭胃幽门区的开放。轻轻摇动朝向胃的每侧2浸湿的棉签，以确保缝合是防漏。
- 在泄漏的情况下，8.0非吸收缝合线完成。除去止血胶原压缩和胃返回到腹腔。发表止血胶原压缩对缝线。
- 关腹
- 用5.0不可吸收缝合线（ 图1K）关闭腹壁的肌肉层。通过减少异氟烷浓度为1％减少麻醉。关闭使用5.0非吸收缝合线（ 图1L）皮肤。
3.空肠Roux-en-Y胃旁路术：手术过程
- 剖腹探查术中位数
- 下双目显微镜和用手术刀，执行从胸骨正中切口腹部打开腹腔（不损坏腹肌）的中间。保护带37℃的生理盐水溶液（ 图2B）浸过的无菌压缩皮肤。
- 胰肢体和消化道肢体
- 外部化肠道（ 图2C）。测量从幽门8厘米并用5.0不可吸收缝合线（图2D）进行肠两个连字。
- 切两结扎线（ 图2E）之间的肠。放置两端的肢体近端在腹部的左上象限。注意：这将被用来作为消化道肢体（ 图2F）。
- 放置面向消化道臂6厘米肢体近端（ 图2F）下面的两个端部的远端肢体。
注意：这将被用作胆肢。
- 空肠-空肠吻合术
- 切两个肢体近端和肠道回路采用微型剪刀和执行相同长度的两个系膜切口（ 图2G和2H）。
- 执行边侧吻合的两个8.0不可吸收的缝线。执行背侧吻合第一（ 图2I），其次是腹侧吻合（ 图2J）。
- 轻轻摇动朝着吻合的每侧2浸湿的棉签，以确保缝合是防漏。在泄漏的情况下，8.0非吸收缝合线完成。
- 胃空肠吻合术
- 用浸湿的棉签轻轻地调动了肚子里。不受用浸湿的棉签或微型剪刀其横向紧密结缔组织附件的胃。
- 轻轻地，完全外部化的肚子，将重新吸收止血胶原压缩胃的后方。执行使用通过采用弧形微型镊子（ 图2K和2L）网膜通过了5.0非吸收缝合线幽门连字。
- 切都胃的腹侧，从幽门1.5厘米，和远侧肢体采用微型剪刀，创建相同的长度（ 图2M）两种切口。
- 具有两个8.0不可吸收的缝合线进行侧 - 侧吻合术。先从背部侧吻合（ 图2N），然后执行腹侧侧吻合（ 图20）。轻轻摇动2朝着吻合的每一侧润湿-棉签，以确保缝合是防漏。在泄漏的情况下，8.0非吸收缝合线完成。
- 关腹
- 收使用5.0不可吸收缝合线（ 图2P）腹壁的肌肉层。通过减少异氟烷浓度为1％降低麻醉。通过皮下注射关闭.Administer 25毫升/公斤的温生理盐水溶液用5.0不可吸收缝合线（ 图2Q）皮肤。
4.一般术后护理
- 停止异氟醚和0.8 L / min的氧气流量继续，直到鼠标完全清醒。直到它重新获得电机控制，由动物开始显示移动在笼子里，并能够站立并没有掉下来走，不要离开鼠标无人值守。
- 将鼠标（仅每笼一只小鼠）在培养箱中30℃的温度条件下，进行5天。
- 维持铁（0.5毫克/公斤/天;皮下注射）和维生素（800毫克/ 180毫升水）补剂在RYGB小鼠直到协议的结束。
- 返回到凝胶减肥食品免费访问：手术后5天（高脂肪凝胶饮食10％猪油，10％液糖，57％的水）。重新引入了坚实的饮食手术后3天。
- 皮下注射丁丙诺啡（0.1毫克/公斤，每日两次，从第0天至手术后第3天），美洛昔康（1毫克/千克，从第0天至手术后第3天），胃复安（1毫克/千克，从第0天到手术后第5天），和marbofloxacine（10毫克/千克，从第0天至第3天AFTE - [R手术）。
5.术后代谢参数评估
- 食物摄入量的测量
- 允许小鼠在手术后1周恢复。屋里的老鼠每笼之一。测量放置在笼子里的固体食物量。重量剩下的食物24小时后。只要需要重复此步骤。
- 口服葡萄糖耐受性试验
- 口服丸前禁食6小时的老鼠。收获从尾部末端的血液滴，并将其应用在血糖仪插入确定时间0的血糖值的葡萄糖条。
- 辖的20％D-葡萄糖溶液（2克/公斤）口服丸剂。测量血液中葡萄糖水平在15，30，60，和120分钟后管饲法。
- 血红蛋白水平分析
- 使用血液系统，测量新鲜血液20微升品尝血红蛋白水平。
- 通过腹膜内注射甲苯噻嗪/氯胺酮溶液（10/80毫克/千克）麻醉小鼠。执行颈椎脱位。通过确保心脏没有跳动和眼球眨眼反射消失验证完整的安乐死。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
大体情况
平均手术时间为SG程序是49.3±1.5分钟。我们除去62.8±5.0毫克胃的，它代表了胃的约80％的百分比。没有老鼠在手术过程中或七天死亡。一个鼠标（7.1％）在11 日术后第二天死了，因为引起的牛黄胃梗阻。
平均手术时间为RYGB手术为89.1±2.8分钟。死亡率RYGB后（P = 0.038 66.6％：25％ 与 RYGB假）是显著高。术后死亡的主要原因是吻合口漏（N = 8），吻合口狭窄（N = 5），麻醉并发症（4例），术后出血（N = 2）。我们还观察到两项长期死于胃肠吻合狭窄慢性阻塞和营养不良。正如图3所示，我们注意到了手术后的存活率的逐步改善整个协议，表示密集外科训练掌握RYGB手术技术要求。
体重，食物摄入，和葡萄糖稳态
老鼠在手术前也有类似的体重。相比于假手术对照组（; P <0.01; 图4A -16.0％：-6.6％与SG假）SG证明手术后14天显著的减肥效果。第14天，手术后-7.9％，并在28日手术后与RYGB -5.1％：第14天，手术后-22.9％-25.5和在％RYGB与来自术后14天（假显著消瘦第28天手术后; 图4B）。在14天的外周的每日食物摄取量减少了35％ OD的SG（ 图4C）以下。相比之下，我们没有观察到假和RYGB小鼠（ 图4D）之间的这种食欲减退作用。我们还报告下列SG和RYGB手术（ 图4E，4F）葡萄糖耐受的改善。
补铁对RYGB诱发贫血有益作用
我们没有观察 （未示出数据）SG手术后14天血红蛋白血症的显著下降。与此相反，严重贫血在RYGB手术的小鼠进行了测定，但它从特定补铁（ 图5A）那样的好处。每日补充铁确实关键和RYGB手术（ 图5B）在28天后避免显著贫血。
/54905/54905fig1.jpg“/>
图1： 袖长胃切除术过程。 （ 一 ）术前准备。 （B）中位数剖腹手术。 （C）胃曝光。 （D）幽门血管缝合。 （ 五 ）食管血管缝合。 （F）初始胃造瘘术。胃的心脏区域的（G）切除术。从胃食管交界处胃开口的切口的端部的（H）的封闭。胃幽门区（I）切除术。幽门区的开放的（J）闭幕。腹壁的肌肉层的（K）的封闭。 （L）皮肤闭幕。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：空肠Roux-en-Y旁路过程。 （ 一 ）术前准备。 （B）中位数剖腹手术。小肠（ 三 ）外部化。 （D），胆胰和消化道肢体连字。 （ 五 ）结扎线之间的小肠部分。 （F）肠肢体定位为空肠-空肠吻合。 （G - 高 ）肢体近端和肠道循环系膜切口。 （Ⅰ）背侧-侧吻合术。 （J）的腹侧边侧吻合。 （K - L）幽门结扎。胃腹侧的（M）切口。远端肢体和背侧侧吻合的（N）的切口。 （O）腹侧-侧吻合术。 （P （Q）闭幕。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：RYGB手术后7天小鼠存活率。数据显示在RYGB手术的小鼠的存活率外科训练的好处。的值显示为平均值±SEM表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：SG 的影响（A，C，D）和RYGB（B，D，F）第Bodyweight，每日进食量，及糖耐量。数据显示为平均值±SEM表示。 NS：不显著; * P <0.05; ** P <0.01（Mann-Whitney检验，ANOVA检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：RYGB 后血浆血红蛋白水平的小鼠无（A）或（B）补铁。数据显示为平均值±SEM表示。 NS：不显著; * P <0.05（Mann-Whitney检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
为了克服肥胖的日益流行，第一减肥手术程序在20世纪60年代出现在美国。自那时以来，全世界每年进行的程序的数量仍增加，今天，这些技术代表了病态肥胖6的管理的最佳治疗选择。之间制定的程序，SG和RYGB是在临床实践4中使用的两种最常用的方法。动物模型，特别是啮齿动物，已被用于破译后面减肥手术后观察到的一般健康状况改善的机制。
破译维持减肥手术的有益的代谢效应的分子机制，我们开发了减肥手术的两种小鼠模型：SG，它通常被定义为一个限制性技术，并且RYGB，其被描述为一个限制性和吸收不良手术。这些小鼠减肥的实现程序需要显微外科经验。这些模型是使用专门的动物手术和人类内脏外科医生的技术人员开发的。从以往的经验，外科培训是必要的RYGB后达到75％的存活率。掌握SG不需要同样多的时间，和学习曲线较短，死亡率在95％左右。相比之下，RYGB是一个更复杂的技术，并且需要6至8周的培训，以达到可接受的术后存活率。
在文献中，有各种各样的啮齿动物减肥手术是先前已经描述7，8，9。在此SG技术中，我们取出胃的心脏区域（也称为眼底），不存在于人类。其目的是要去除胃的约80％。 RYGB模型大鼠的袋尺寸范围为<5％到>初始胃尺寸的20％。一些STudies使用鼠标RYGB模型，呈现胃10中 ，一个小胃囊5，或总胃改道5的任一个完整保存。在一个非常全面的研究，邓平贤和他的同事评估了RYGB的不同小鼠模型，并报告说，小鼠的胃没有被解剖适应于建立一个胃囊5。对于我们的RYGB手术中，我们选择不伐胃进行空肠Roux-en-Y。作为限制，我们的模型不诱导食物摄入，其中对比了它在RYGB人模型中观察到的减少。
RYGB手术后的存活率大鼠很少通过文献中，作者提到的，但它似乎平均11达到约30％至35％。在我们的手中，死亡主要是由于吻合口瘘或狭窄或术后晚期gastrojejunal吻合小号tenosis，导致慢性阻塞持续性过度减肥，这损害动物福利。 RYGB需要特定的围手术期管理，包括在前三术后天凝胶饮食和疼痛管理制度。手术后改善长期生存，我们添加维生素术后，特别是脂溶性维生素和铁，预防贫血。相反，老鼠并不需要脂溶性维生素补充剂SG之后，因为它只是一个限制性程序。在以前的文章中，作者并没有术后过程中描述手术动物的健康状况。因为它是一个大手术，我们不能假设在这些研究动物的系统福祉。
总之，无论是限制性的（SG）的小鼠模型或限制性-吸收不良（RYGB）减肥手术是可行的，但需要显微训练用的学习曲线，特别是为RYGB手术。柯EP身体健康，围手术期管理是RYGB程序中非常重要，尤其是在疼痛方面的动物，而且在补充维生素条款。通过实现更快的，无菌的手术，并通过使用显微训练，可以大大改善术后存活率。这些模型是非常有用和必要的工具来了解减肥手术的代谢作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| High Fat diet | DIO diet | Safe | |
| Isoflurane | Forane | Baxter | |
| Buprenorphin | Buprecare | Animalcare | |
| Marbofloxacine | Marbocyl | Vetoquinol | |
| Ammonium iron citrate, vitamins PP-B12 | Fercobsang | Vetoquinol | |
| Vitamins A-D3-E-K-B | Vita Rongeur | Virbac | |
| NaCl 0.9% | NaCl 0,9% | ||
| Povidone solution | Betadine Scrub | Betadine | |
| Povidone solution | Betadine Solution | Betadine | |
| Carboptol 980 NF | Ocrygel | TVM | |
| Name | References | Company | Comments |
| Sutures | |||
| Prolene® | 8.0, 6,5 mm | Ethicon | |
| Prolene® | 5.0, 13 mm | Ethicon | |
| Name | References | Company | Comments |
| Surgical equipments | |||
| Scissors | FST | ||
| Needle holder | Olsen-Hegar | FST | |
| Micro scissors | Vannas | FST | |
| Micro forceps | Graefe | FST | |
| Micro forceps curved | Graefe | FST | |
| Curved micro needle holder | Castroviejo | FST | |
| Hemostatic collagen compress | Pangen | Urgo | |
| Absorbent underpads | VWR | ||
| Name | References | Company | Comments |
| Specific equipments | |||
| Hematology system | Hemavet 950FS | Hemavet | |
| Glucose strips and glucometer | One touch Verio | Life scan | |
| Stereo microscope | MZ6 | Leica |
References
- Ng, M., Fleming, T., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. The Lancet. 384 (9945), 766-781 (2014).
- Calle, E. E., Thun, M. J., Petrelli, J. M., Rodriguez, C., Heath, C. W. Body-mass index and mortality in a prospective cohort of U.S. adults. The New England Journal of Medicine. 341 (15), 1097-1105 (1999).
- Sjöström, L., Lindroos, A. K., et al. Lifestyle, diabetes, and cardiovascular risk factors 10 years after bariatric surgery. The New England Journal of Medicine. 351 (26), 2683-2693 (2004).
- Buchwald, H., Avidor, Y., et al. Bariatric surgery: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 292 (14), 1724-1737 (2004).
- Yin, D. P., Gao, Q., et al. Assessment of different bariatric surgeries in the treatment of obesity and insulin resistance in mice. Annals of surgery. 254 (1), 73-82 (2011).
- Buchwald, H., Oien, D. M. Metabolic/Bariatric Surgery Worldwide 2008. Obesity Surgery. 19 (12), 1605-1611 (2009).
- Liu, W., Zassoko, R., et al. Establishment of duodenojejunal bypass surgery in mice: A model designed for diabetic research. Microsurgery. 28 (3), 197-202 (2008).
- Lan, Z., Zassoko, R., et al. Development of techniques for gastrojejunal bypass surgery in obese mice. Microsurgery. , (2010).
- Schlager, A., Khalaileh, A., et al. A mouse model for sleeve gastrectomy: Applications for diabetes research. Microsurgery. 31 (1), 66-71 (2011).
- Troy, S., Soty, M., et al. Intestinal Gluconeogenesis Is a Key Factor for Early Metabolic Changes after Gastric Bypass but Not after Gastric Lap-Band in Mice. Cell Metabolism. 8 (3), 201-211 (2008).
- Seyfried, F., Lannoo, M., et al. Roux-en-Y gastric bypass in mice--surgical technique and characterisation. Obesity surgery. 22 (7), 1117-1125 (2012).
