Abstract
림프구는 다시 급속한 세포 증식, 이동 및 분화 및 사이토 카인 생산에 이르게 세포 내 신호 전달 경로를 활성화하여 자극의 다양한 반응한다. 이들 이벤트 모두는 밀접 전지의 에너지 상태에 연결되며, 따라서 에너지 생산 경로를 연구하는 것은 이들 세포의 전반적인 기능에 대한 단서를 제공 할 수있다. 세포 외 유동 분석기는 많은 세포 유형에서 해당 작용 및 미토콘드리아 호흡의 성능을 평가하기위한 일반적으로 사용되는 장치이다. 이 시스템은 몇 게시 된 보고서에서 면역 세포를 연구하는 데 사용되었습니다, 아직 림프구를 위해 특별히 최적화 된 포괄적 인 프로토콜이 부족하다. 림프구는 생체 조건에서 제대로 살아남을 깨지기 쉬운 세포이다. 때때로 림프구 서브 세트는 드문, 낮은 세포 수로 작업하는 것은 불가피하다. 따라서, 이러한 어려움을 해결하는 실험적인 전략이 필요합니다. 여기, 우리는 프로토콜을 제공즉, 림프 조직에서 실행 가능한 림프구의 신속한 분리를 허용하고, 세포 외 플럭스 분석기에서의 대사 상태의 분석. 또한, 우리는 다른 세포 밀도에서 여러 림프구 아형의 신진 대사 활동을 비교 하였다 된 실험의 결과를 제공합니다. 이러한 관찰 우리 프로토콜에도 낮은 세포 농도에서 일관 잘 표준화 된 결과를 달성하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서, 면역 세포 대사 사건의 특성에 초점을 맞춘 미래 연구에서 다양한 애플리케이션을 가질 수 있음을 시사한다.
Introduction
항원에 대한 면역 반응은 면역 활성화 및 면역 억제 사이의 긴밀하게 조절 균형이다. 면역 억제는 단순히 이러한 사건을 억제하므로 불필요한 면역 반응 1-6 방지에 중요한 반면, 면역 활성은 자극에 반응하여 신속하게 세포 증식 및 이동뿐만 아니라, 사이토 카인 생산, 항체 분비를 증가 식세포를 구동한다. 최근 연구에 직접 링크가 면역 세포의 활성화 상태 및 각종 대사 경로 (7)의 활성 사이에 존재하는 것으로 나타났다. 면역 세포 및 오프 에너지 생산 경로를 전환하여 휴식과 활성화 상태 사이를 전환 할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 면역 세포 유형의 활성화 과정들이 증가 에너지 수요 연료를 다른 대사 전략을 사용할 수 있음이 관찰되었다. 예를 들어, 동시에 T 림프구의 활성화는 거의 8 당분 상태로 셀을 지시 9,10의 균형을 사용한다. 이러한 연구들은 세포 대사의 면역 세포 활성화 효과를 조사의 중요성을 지적한다.
실시간은 산화 적 인산화와 같은 당분 지표 산소 소모율 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 동시 측정은 에너지 생산 경로 11-13의 상태를 해결하는 일반적인 방법이다. 이를 달성하기 위해, 예컨대 해마 XF 96 세포 외 유동 분석기는, 일상적으로 사용된다. 이러한 장비는 빠른 속도로 세포 유형에서 또는 다른 자극 조건에 OCR과 ECAR의 변화를 비교할 수 있습니다. 지금까지 면역 세포를 포함한 여러 세포 유형은 이러한 장치를 이용하여 연구되었다. 그러나, 특히 면역 세포 위해 설계된 최적화 된 프로토콜을 사용할 수 없습니다.
면역 세포, 특히 림프구, 오티 다를몇 가지 중요한 방법으로 그녀의 세포 유형. 림프구는 생체 조건 14-16 긴 기간 생존하지 않는 깨지기 쉬운 세포이다. 이것은 그들이 최적 성장 배지는 세포 유동 분석에 사용 된 것과 같은 필수 영양소를 결여에서 배양 더 큰 문제이다. 대 식세포 많은 세포주는 달리, 림프구는 플라스틱 표면에 부착하지 않는다; 따라서 스트레스를 생성하지 않고 분석 판에 첨부하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 일부 림프구 소집단는 매우 드문 일 수 있으며, 필요한 최적의 양에 그들을 수확은 17-19 어려울 수 있습니다.
여기, 우리는 특히 림프구를 위해 개발 된 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 우리 differen 그들의 휴지 상태 및 산화 적 인산화 해당 작용의 특성을 표시 노드 (20), 마우스의 비장 및 림프절로부터 분리 된 비장 세포, B 림프구 및 나이브 CD4 + T 림프구를 사용하여T 세포 밀도. 데이터는 물론 세포 수에 정비례 하였다 최종 분석 파쇄 단백질 농도를 측정하여 각각의 초기 세포 수의 차이를 고려하여 표준화 하였다. 우리 프로토콜뿐만 아니라 세포 유동 분석을위한 가능한 림프구의 신속한 분리를위한 가이드 라인을 제공 할뿐만 아니라, 데이터의 품질을 손상시키지 않고 최적 세포 농도에서 작동 가능하다.
Protocol
모든 동물 실험은 NIAID 동물 보호 및 사용위원회에 의해 승인 된 LIG -4- 동물 프로토콜에 따라 수행 하였다.
시약 1. 준비
- 자기 분리 (MS) 버퍼를 준비한다 : 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA 또는 0.5 % BSA로 보충 자동 분리 용액이 보충 된 PBS (PH 7.2). 2-8 ℃에서 살균 필터 (0.22 μm의) 저장.
- RF10 매체 준비 : RPMI 1640, 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 μM 스트렙토 마이신, 1 mM 피루브산 나트륨, 2mM L- 글루타민, 0.1 mM 비 필수 아미노산이 보충 된 50 μM이 메르 캅토 에탄올, 10 mM의 HEPES. 멸균 시약을 사용합니다. 2-8 ℃에서 살균 필터 및 저장.
- 1 mM의 피루브산 나트륨, 2mM L- 글루타민 및 25 mM의 글루코오스가 보충 XF베이스 매체 미토콘드리아 스트레스 시험 배지를 준비한다.
- 해당 작용 스트레스 테스트 매체를 준비합니다 XF 기본 매체 supplemen을2 mM의 L- 글루타민과 테드.
- 2-8 ℃에서 7.4, 살균 필터 및 저장소에 미토콘드리아와 해당 작용 스트레스 테스트 매체 모두의 pH를 조정합니다. 사용 (37 ° C에서 pH 측정을 수행) 전에 37 ° C와 따뜻한 미디어 pH를 재 조절합니다.
주 : XF 매체를 이용하여, 중탄산 결여 중요하다. 외 플럭스 분석기 내의 분위기 만이 주위의 CO가 포함되어 있기 때문에, 매체의 임의 중탄산은 해당 작용의 부산물로서 방출 양자의 결합시에 CO 2 및 물을 형성하기 위해 해리된다. CO 2 할 당분 산성화 신호를 가릴 것 pH의 표류를 일으키는 실험 기간 동안 탈기. - oligomycin 준비 : 10 밀리미터에게 DMSO의 주식 솔루션을 준비; -20 ° C에서 보관.
- 2,4-DNP 준비 : DMSO 1 M 주식 솔루션을 준비; -20 ° C에서 보관.
- antimycin A를 준비 : 10 밀리미터에게 DMSO의 주식 솔루션을 준비; -20 ° C에서 보관.
- 로테 논을 준비 : 10 밀리미터의 준비DMSO의 째깍 솔루션; -20 ° C에서 보관.
- 글루코스 준비 : 250 mM의 용액을 형성 당분 스트레스 테스트 배지에서 포도당의 수용액; 각 실험 전에 신선 준비하고 동결하지 않습니다.
- 2-DG 준비 : 500 mM의 용액을 형성 당분 스트레스 테스트 배지에서 2 DG 고체 녹이고; 각 실험 전에 신선 준비하고 동결하지 않습니다.
2. 마우스에서 수확 비장과 림프절
- 자궁 경부 전위 다음 CO 2 질식하여 마우스를 안락사.
- 70 % 에탄올로 마우스를 분무.
- 후속 T 세포 분리의 경우, 비장, 피상적 인 자궁 경부, 표면 / 깊은 겨드랑이, 하악, 사타구니 및 장간막 림프절을 수확.
- 후속 B 세포 분리를 위해 수확 만 비장.
주 : 바이오 안전성 캐비닛을 사용하여 처리 될 때까지 얼음에 PBS 또는 RF10 미디어에서 수확 된 장기를 유지합니다. 모든 처리 및 ISOL에 대한 멸균 실험 실용 및 무균 기술을 사용하여ATION 단계. 분리 효율을 증가시키고, 세포 사멸을 감소 얼음 모든 버퍼 및 미디어 보관.
3. 조직 처리
- 50 ML 원뿔 관을 통해 70 μm의 셀 스트레이너를 놓고 스트레이너에 장기를 전송합니다. T 세포의 분리를 위해, 모든 기관과 결합하여 B 세포 격리 전송 만 비장.
- 멸균 3 ㎖ 주사기의 플런저를 사용하여 여과기를 통해 조직을 매시. 당화 중에, 필터 및 장기 항상 습한 지 확인하고 MS 버퍼를 첨가하여 필요에 따라 습식. 이 모두 높은 세포 생존율을 유지하고, 필터의 막힘을 방지한다.
- 당화 후 5-10 ml의 적용 MS 세포 회복을 높일 필터 버퍼. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 현탁액을 원심 분리기. (지정하지 않는 한, 이러한 조건에서 모든 추가 회 원심을 수행).
- 액체를 경사 분리하고 5 ㎖의 ACK 적혈구 세포 용해 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 인큐얼음에 5 분간 BATE (그들은 자기 분리를 방해하기 때문에 적혈구는 제거 될 필요), 적혈구를 용해시키기 위해. 10 ~ 20 추가 ml의 MS는 버퍼와 원심 분리기.
- 1 ml의 MS 버퍼 (적혈구 용해에서 이물질을 제거합니다이 여과)와 함께 15 ML 원뿔 튜브를 통해 30 μm의 셀 필터를 놓고 프라임. 원심 분리 된 튜브로부터 액체를 경사 분리, 버퍼 및 필터를 통해 통과 5 ㎖ MS에 펠렛을 재현 탁. 세포 회수를 증가시키고, 상기 필터를 세척 할 이것을 사용하여 4 mL의 MS 버퍼 초기 튜브 씻는다.
- 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포의 수를 결정한다. 이 셀 번호, 비장 세포는 후속 흐름 분석에 사용되는 경우 제 4 자기 분리에 필요한 시약의 양을 결정하는 데 사용되는 현재 셀의 해당 번호를 따로 설정한다.
- 현탁액을 원심 분리기 및 자기 분리를 진행합니다. 재현 탁의 비장 세포를 사용하지및 5 ㎖의 RF10에서 B 세포 분리를위한 세포 외 플럭스 분석까지 얼음에 보관.
B 세포 및 나이브 CD4 + T 세포의 4. 자기 분리
- 비오틴 - 항체 칵테일, 안티 - 비오틴 마이크로 비드 및 MS 버퍼의 필요한 양을 결정합니다. 가이드로 10 8 세포에 대해 다음 볼륨을 사용하여 확장 또는 필요에 따라 아래로.
참고 : 냉장고에 오히려 얼음보다 항체 결합 효율과 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다을 줄일 수 있습니다 얼음에 배양 이후 샘플을 품어.
| 나이브 CD4 + T 세포 분리 용 시약 | 10 8 셀 볼륨 |
| (알맞게 조절) | |
| 비오틴 - 항체 칵테일 | 100 μL |
| 첫 번째 배양을위한 MS 버퍼 | 400 μL |
| 안티 - 비오틴 마이크로 비드 | 200 μL |
| CD44 마이크로 비드 | 100 μL |
| 두 번째 배양을위한 MS 버퍼 | 200 μL |
| 5 분 동안 4 ° C에서 비오틴 - 항체 칵테일과 세포를 품어. 안티 - 비오틴 마이크로 비드, CD44 마이크로 비드를 추가, MS는 버퍼와 15 분 동안 4 ° C에서 품어. | |
표 1 : T 세포의 분리 및 사용 볼륨.
| B 세포 분리 용 시약 | 10 8 셀 볼륨 |
| (알맞게 조절) | |
| 비오틴 - 항체 칵테일 100 μL | |
| 첫 번째 배양을위한 MS 버퍼 | 400 μL |
| 안티 - 비오틴 마이크로 비드 | 200 μL |
| 두 번째 배양을위한 MS 버퍼 | 300 μL |
| 15 분 동안 4 ° C에서 비오틴 - 항체 칵테일과 세포를 품어. 비오틴 - 항체 칵테일과 MS 버퍼의 적절한 볼륨을 추가하고 15 분 동안 4 ° C에서 혼합물을 품어. 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 적절한 볼륨을 추가하고 MS는 버퍼와 15 분 동안 4 ° C에서 혼합물을 품어. 두 번째 배양 후, MS 버퍼와 원심 분리기와 튜브를 입력합니다. | |
표 2 : B 세포 분리 볼륨 및 사용.
- MS 버퍼에 펠렛을 재현 탁 : 수동 분리를위한 500 μL, 자동 분리 3-4 ml에.
- 수동 또는 자동 분리 중 계속다음과 같은 :
- 수동 분리 :
- 3 ㎖ MS 버퍼로 세척하여 통해 흐름 및 주요 열을 수집하기 위해 아래의 멸균 15 ML 원뿔 관을 배치, 분리 자석로의 LS 열을 삽입합니다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오.
- 프라이머 작업 LS 칼럼에 세포 현탁액을 전송하고 통과 할 수 있습니다; MS는 버퍼뿐만 아니라 열 통해 전달 3 ㎖로 배양시 사용되는 튜브를 세척한다. 용출액은 정제 된 세포를 포함합니다. B 세포의 분리를 위해, 새로운 15ml를 튜브에 열을 통해 두 번 정제 된 셀을 통과하고, 세정 공정을 반복한다. 이 순도와 수율을 증가시킬 것이다.
- 자동 분리 :
- 자동 분리기에 전환하고, 버퍼를 실행 용액 및 70 % 에탄올 세척의 수준을 확인합니다. 폐기물은 분리를 시작하기 전에 비어 있는지 확인합니다.
- t의 튜브의 크기에 따라 적절한 냉각 랙 선택그 정제 된 샘플 (예를 들면, 15 mL)을 첨가 하였다. 분리 공정에 걸쳐 생존 세포를 유지하기 위해, 이전에 3-4 시간 동안 2-8 ℃로 냉각 한 선반을 사용하거나까지 냉매 고체된다.
- 자동 분리기의 샘플 단계에 냉각 랙 마운트합니다.
- 슬롯 A1, 슬롯 B1의 부정적인 부분에 대한 관의 샘플 튜브 및 C1에서 긍정적 인 부분에 대한 튜브를 놓습니다. 하나 이상의 샘플을 수집하는 경우에는 다음 열 (A2, B2, C2 등)의 추가 튜브를 배치합니다.
- 터치 스크린의 분리 탭을 선택하고 랙 튜브의 배열을 나타냅니다. 분리 메뉴에서 "고갈"프로그램을 선택하고 세척의 적절한 유형의 프로그램주기를 완료 (아래 참고 참조).
참고 : "고갈"프로그램 순도의 우선 순위를 시스템의 가장 민감한 모드를 사용하여 고갈을 수행한다. 또한, 세 가지 세척 옵션이 있습니다 : QUIC, 린스 린스, 수면 케이. 샘플이 동일한 소스이고 조합 될 경우, 빠른 세정을 선택한다. 샘플은 별도로 유지되어야하는 경우, 린스를 선택한다. 더 이상의 절연 부 그날 수행하지 않을 경우 절전 옵션을 선택하고 기계 분리에 따라 종료 될 경우 - "실행"을 눌러 분리를 시작하고 메시지가 표시되면 버퍼 수준을 확인합니다. 프로그램이 종료 된 후에, 음의 분획 정제 된 세포를 포함 할 것이다.
- MS 버퍼와 원심 분리기 15 ml의에 원뿔 튜브를 위로 채우십시오.
- MS가 버퍼에 resuspend 세포를 5 ml의 RF10 미디어에서 가만히 따르다. 세포 외 플럭스 분석까지 얼음 세포를 유지합니다.
참고 : 이상적으로, 세포 외 플럭스 분석은 분리 후 즉시 수행되어야한다. 그러나, 예비 실험에서 분석 결과 유의 한 차이는 갓 격리 된 사람에 비해 분리의 3 시간 내에서 사용되는 세포에서 관찰되지 않았다.
- 수동 분리 :
참고 : 여기에 설명 된 프로토콜은 악기의 96 웰 형식입니다. 다른 포맷을 사용하는 경우, 볼륨이 조절 될 필요가있을 것이다.
- 센서 카트리지의 수화
- calibrant 용액에 침지 센서, 센서 카트리지를 올려 calibrant 용액 200 μL와 유틸리티 플레이트의 각 웰을 채워 플레이트 실용 상 센서 카트리지를 하향 조정한다.
참고 : calibrant 솔루션 레벨이 침수 센서를 유지할 수있을만큼 높은 것을 확인합니다. 카트리지는 각 웰에 대한 O 2, H의 +에 관련된 형광을 항구; 그들이 제대로 작동하려면이 순서대로 수화 될 필요가있다. - 하지 CO 2 또는 산소 / 질소 보충 37 ° C 배양기에서 카트리지를 놓습니다. 지정하지 않는 한, 이러한 조건에서 모든 추가 배양을 수행하십시오. 수화 밤새 카트리지를 품어.
- calibrant 용액에 침지 센서, 센서 카트리지를 올려 calibrant 용액 200 μL와 유틸리티 플레이트의 각 웰을 채워 플레이트 실용 상 센서 카트리지를 하향 조정한다.
- 위해 준비 할접착 코팅 된 플레이트의 ATION
- 0.1 M 중탄산 나트륨의 22.4 μg의 / ㎖ 접착제 용액 2.5 ml의 준비, pH가 8.0 (탄산 수소 접착제 흡착을위한 최적의 pH를 제공합니다).
- 분석 플레이트의 각 웰에 상기 용액 25 μL를 적용, 실온에서 20 분 동안 벤치에 배양한다.
- 기음 접착제 및 각 웰을 씻고 두 번 멸균 물 200 μl를 사용하여. 우물은 세포를 파종하기 전에 건조 될 때까지 기다립니다.
- 접착 코팅 된 플레이트에 셀 시드
- 5 분 동안 200 × g으로 실온에서 원심 셀. 적절한 분석 배지 5ml에 재현 탁 된 세포 (미토콘드리아 스트레스와 스트레스 글루코스 매체 제형 위 참조). 분석 배지에서 원하는 농도로 다시 원심 분리하고 재현 탁 셀 (부유 볼륨 농도에 따라 달라질 것이다 각 웰의 세포 현탁액 180 μl를 포함한다).
주 : 해당 분석 매체와 화합물만큼s는 세포 외 플럭스 분석기는 동시에 같은 접시에 미토콘드리아와 해당 작용 스트레스 테스트를 실행할 수, 사용된다. - 각 웰에 세포 현탁액 180 μl를 플레이트. 배경 온도 보정을위한 우물 A1, A12, H1 및 H12를 사용하여이 우물 (NO 세포)에서 분석 매체의 180 μl를 추가합니다.
- 37 ° C에서 25 분 동안 접시를 품어.
- 모든 세포가 완전히 부착했는지 확인하기 위해 더 브레이크 5 분 동안 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 시각 세포가 안정적 현미경으로 보면, 단층을 형성 배양 표면에 부착되어 있는지 확인한다. 추가로 30 분 동안 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
- 5 분 동안 200 × g으로 실온에서 원심 셀. 적절한 분석 배지 5ml에 재현 탁 된 세포 (미토콘드리아 스트레스와 스트레스 글루코스 매체 제형 위 참조). 분석 배지에서 원하는 농도로 다시 원심 분리하고 재현 탁 셀 (부유 볼륨 농도에 따라 달라질 것이다 각 웰의 세포 현탁액 180 μl를 포함한다).
- 화합물의 10 배 농도의 제조 및 인젝터 포트의로드
- 미토콘드리아 스트레스 테스트의 경우, 10 μM의 oligomycin, 1mM의 DNP 및 미토콘드리아 응력 분석 mediu 10 μM, 10 μM 로테의 antimycin의 A, 모두의 혼합물을 각각 2.5 mL의 제조엠.
주 : 2,4-DNP의 농도가 이전에 발표 된 연구에 기초 21이 있지만, 일반적인 지침 연구자에 의해 결정되어야 사용 된 각 세포 유형 uncoupler의 농도이다. - 당분 스트레스 테스트에 2.5 ml의 250 mM의 글루코오스, 10 μM의 oligomycin 및 당분 응력 분석 배지 500 mM의 2- 데 옥시 글루코오스 (2- DG)을 각각 준비한다.
- 따뜻한 10 배 37 ° C에 대한 해결책, 그리고 7.4의 pH를 조정합니다.
- 다음과 같이 멀티 채널 micropipettor 및로드 가이드를 이용하여 카트리지의 적절한 인젝터 포트에 적재 화합물 :
표 3 : 화합물 볼륨.포트 미토콘드리아 스트레스 분석 해당 작용 스트레스 분석 에이 20 μl를 oligomycin 20 μL 포도당 비 22 μl의 2,4-DNP 22 μl를 oligomycin 기음 25 μL antimycin의 A / 로테 25 μl의 2-DG
참고 : 포트의 각 시리즈 (예를 들어, 모든 포트 A)가 동일한 볼륨을 포함해야합니다. (미사용 웰 포트 분석 배지의 동일한 양으로 로딩 될 수있다), 그렇지 않은 화합물이 주입되지 않으며, 주어진 일련의 모든 웰은 심지어는 실험에 사용되지 않은로드되는 것이 중요하다. - 프로그램을 설정하는 동안 카트리지를 품어.
- 미토콘드리아 스트레스 테스트의 경우, 10 μM의 oligomycin, 1mM의 DNP 및 미토콘드리아 응력 분석 mediu 10 μM, 10 μM 로테의 antimycin의 A, 모두의 혼합물을 각각 2.5 mL의 제조엠.
- 세포 외 유출 분석 프로토콜 설정
- 다음 프로그램 (표 4)를 설정합니다.
표 4 : 프로그램의 레이아웃입니다.단계 고리 구경 측정 - 평형 - 기준 수치 3 번 : 측정을 3 분, 3 분을 혼합 0 분을 기다립니다 최종 루프 - 포트 A를 주사 - 측정 3 번 : 측정을 3 분, 3 분을 혼합 0 분을 기다립니다 최종 루프 - 포트 B를 주입 - 측정 3 번 : 측정을 3 분, 3 분을 혼합 0 분을 기다립니다 최종 루프 - 포트 C를 주입 - 측정 3 회 : 지표 성과를, 3 분을 혼합 0 분을 기다립니다전자 3 분 최종 루프 - 최종 프로그램 -
참고 : 활성화 된 세포를 사용하는 경우 특정 조건에서, 예를 들어, 산성화가 순진한 세포보다 더 오래 지속될 수 있습니다. 이 때문에, 각각의 측정 사이클 이상의 시간을 상기 프로그램에 "대기"시간을 연장하거나 반복 할 필요가있을 수있다. - 프로그램을 시작합니다. (메시지가 나타나면) 교정 단계 후, 분석 판의 calibrant 판을 교체합니다.
주 : 소프트웨어를 사용하여, 유사한 조건을 웰의기를 나타낼 수있다. 또한, 상기 제어 웰있는 웰 나타내는 것이 중요하다 (이 프로토콜들은 플레이트의 네 모서리 임) 및 비어있는 웰냅니다. 보다 상세한 내용은 단계별로 시스템 설정 및위한 프로토콜의 소프트웨어는 제조업체의 웹 사이트를 참조해야한다.
- 다음 프로그램 (표 4)를 설정합니다.
- 단백질 함량을 측정
- 세포를 방해하지 않고 각 웰에서 나머지 분석 매체를 제거합니다.
주 : 단백질 농도 분석을 진행하는 것이 편리하지 않으면, 분석 때까지 -20 ℃에서 전체 판을 고정 할 수있다. 냉동 경우, 계속하기 전에 해동. - (50 μL 충분한 / 웰) RIPA 용해 배지에서 프로테아제 억제제의 1X 용액 (스톡 100X)를 준비한다.
- 물론 각 단백질 분해 효소 억제제와 보충 50 μl를 RIPA 용해 매체를 추가합니다. 5 분 동안 진탕에 판을 선동하고 완벽를 Lyse 세포에 30 분 동안 얼음에 플레이트를 품어.
- 그들은 bicinchoninic 산 (BCA) 분석에 방해가되지 않도록 플레이트의 바닥 지질 및 다른 분자를 가지고 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 플레이트 스핀.
- 제조사에 따른 BCA 분석으로 단백질 농도를 측정 및# 39;의 권장 사항을 참조하십시오.
- 세포를 방해하지 않고 각 웰에서 나머지 분석 매체를 제거합니다.
Representative Results
진핵 세포가 당분의 통합 된 네트워크를 사용하여 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클, 및 산화 적 인산화는 에너지 수요의 대부분을 충족하고 세포의 성장과 증식에 필요한 중간체를 제공한다. 이러한 경로는 이후 피루브산으로 가공되는 글루코스 -6- 포스페이트의 형태로 자유 포도당 세포 포착 시작한다. 피루브산 중 하나를 감소 락 테이트하거나 아세틸 조효소 A를 형성하는 미토콘드리아 (COA)로 전송하는 것입니다. 아세틸 CoA를 다음 TCA 사이클에 입사한다. TCA 사이클의 고 에너지 중간체 차례로 미토콘드리아 내막 걸쳐 H + 그라디언트를 생성하는 미토콘드리아 매트릭스로부터 H의 +를 추방 전자 수송 체인 (ETC)에 전자의 이동을 추진. 산소는 최종 전자 수용체로 작용하고, H는 +를 F O / F <를 통해 미토콘드리아 매트릭스로 돌아갑니다서브 잠재적 에너지 ATP (도 1a)을 생성하는데 사용된다> 1 복합체.
외 플럭스 분석의 작동 원리는 특정 시점에서 해당 작용 및 산화 적 인산화와 간섭하고, 얻어진 효과 평가에 의존한다. 이를 위해, 우리는 차단하기 위하여 결핍 세포에서 해당 작용 및 헥소 키나아제에 의해 2- 데 옥시 글루코오스 -6- 포스페이트, 포스 포 (23)의 경쟁적 저해제로 변환되고,이 옥시 글루코오스 (2- DG)을 전파하는 글루코스 사용 해당 작용. 로테 논 (전문 의약품의 복잡한 I-특정 억제제), (ATP 합성 효소 (24)의 억제제) oligomycin, A (복잡한 전문 의약품의 III-특정 억제제) antimycin 및 언 커플 링 에이전트 2,4- dinotrophenol (DNP) 25이었다 교통, 양성자 기울기와 ATP 합성 (그림 1A)를 전자에 관련된 특정 이벤트를 개입하는 데 사용됩니다. 대신 2,4-DNP의 카보 CYAnide -4- (트리 플루오 로메 톡시) 페닐 (FCCP)도 사용할 수 있지만, 추가의 최적화가 필요하다. 어느 경우 uncouplers 항상 필요한 최적 농도를 결정하는 데 사용하기 전에 특정 세포 유형에 대해 적정한다.
당분 스트레스 테스트 (도 1B)는 이전 결핍 세포 외 산성화 속도 (ECAR)의 기준 측정을 시작한다. 이러한 세포들은 기저 최소한이며, 따라서 실질적으로 비 당분으로 간주 될 수 있기 때문에,이 시점에서 측정 ECAR은 비 당분 산성화로 지칭된다. 그리고 H의 + -이 산성화 가능성 TCA 사이클에 발생 호흡 CO 2 HCO 3으로 변환되는 것에 대응한다. 이 인해 락트산의 형성 세포 외 산성화 증가로 제공되는 당분 해를 활성화 글루코스 주입 따른다.이러한 증가는 해당 작용의 정상 속도를 나타낸다. 세포는 다음을 차단 산화 인산화 통해 ATP의 생성 oligomycin의 주입으로 도전된다. 세포는 최대 수준에 해당 작용을 활성화하여 ATP 생산이 크게 감소에 응답하고는 ECAR 레벨 (당분 준비 제도 이사회)의 보조 증가를 초래한다. 시험은 글루코오스 유사체는 비 당분 레벨로 ECAR를 반환 DG-2를 이용하여 해당 작용의 억제에 의해 전체를 종료한다. 흥미롭게도, 이는 제조사의 권장 달리 최대 당분 반드시 26 oligomycin의 주입에 의해 달성되지 않은 것으로 제안되었다. ATP 수요의 상당한 증가가없는 경우에 높은 당분 수용 셀, 해당 작용은 상향 조절 될 필요없이 미토콘드리아 ATP의 손실에 대처할 머물 수있다. oligomycin와 당분 속도는 호흡 억제를 추가하여 능가 할 수같은 oligomycin를 통해 몇 가지 이점을 제공 로테 논 및 myxothiazol, 같이가 ATP 합성 효소의 반전의 원인으로 1) 그들은 26 미토콘드리아 막 전위 회복하기위한 시도로 양성자를 펌프, ATP 가수 분해와의 ATP 수요 증가; 2) 그들은 ECAR 결과 (아래 참조)을 혼동 할 수있는 매체의 호흡 산성화를 방지합니다. ATP 수요가 증가 할 수있는 다른 방법은 세포막 -ATPase를 26 ATP의 가수 분해를 자극하는 화합물의 첨가를 포함한다. 해당 작용 스트레스 테스트를 계획 할 때이 모든 연구자들에 의해 신중하게 고려되어야한다.
미토콘드리아 스트레스 테스트 (도 1C)는 비 - 결핍 세포의 산소 소모 속도 (OCR)의 기준 측정을 시작한다. 이것은 F O / F 1 복합체를 통해 양자의 반환을 억제하는 oligomycin의 주입, 다음에 따라서 빠르게 hyperpolariz된다미토콘드리아 막을 말이지. 과분극 호흡 단지를 통해 펌핑 더 양성자 및 호흡 저하를 방지 할 수 있습니다. 나머지 호흡 지질 또는 다른 경로를 통한 양성자의 흐름을 나타내고, 양자 누출이라고한다. 이 분극 상태는 빠르게 양성자 이온 운반체로서 작용하는 언 커플 링 에이전트 2,4- DNP의 첨가에 의해 역전된다. 응답하여, 셀이 최대로 전자 전달 속도를 증가시켜 헛된 시도 막전위 복구를 시도하고, 이것은 차례로 OCR을 증가시킨다. 마지막으로, 두 ETC 억제제 (antimycin A와 로테)의 추가와 함께, 미토콘드리아의 호흡이 완전히 중지하고 OCR은 가장 낮은 수준으로 감소한다. 이 수준에서는, 산소 소비는 미토콘드리아 활성 (비 미토콘드리아) 때문이 아니다. 이러한 억제제에 의해 생성 된 OCR의 차이는 기준 호흡 예비 용량의 합 최대 미토콘드리아 호흡 불린다.
프로토콜의 섹션 4에서 설명한 바와 같이 B 세포 및 나이브 CD4 + T 세포를 단리하고, 비장 세포는 단순히 3.3 절에 설명 된 적혈구 세포를 용균을 수득 하였다.
세포 유형 특이 적 대사 분석의 감도는 생존하고, 출발 세포 집단의 순도에 의존한다. 따라서, 단리 된 마우스 T 세포, 비장 세포 및 B 세포와 T 세포와 B 세포의 순도의 가능성을 확인하기 위해, 세포의 작은 분취 량 유세포 분석 (도 2)에 대해 염색 하였다. 사이드 스 캐터 지역 대 앞으로 캐터 영역에서 (FSC-A SSC-A 대) 플롯, 림프구 게이트,되었고이 게이트, 전방 캐터 어이에서 대각선을 따라 인구 내에서FSC-A 플롯 대 t (FSC-H)은 단일체로서 결정 하였다. 중항 집단 내 생존 라이브 / 죽은 마커 (도 2a)에 대한 네가티브 염색 세포를 게이팅하여 측정 하였다; T 세포는 비장 세포 생존 가능성은 92 %이고, B의 세포 생존율은 94 %이고, 97.9 %였다. CD4 + 인구 (27), 98.3 % (도 2B)이었다 - 상기 CD44에 의해 측정되는 CD4 + T 세포의 순도 동안 B 세포 순도의 B220 + CD19 + 집단 (26)에 의해 측정 한, 99 %이었다.
세포 용 해물의 단백질 농도 도금 세포 수의 직접적인 지표로 사용될 수있다.
격리 된 림프구와 비장 세포는 / 잘 5 × 10 5 세포에 접착제 코팅 된 96 웰 분석 플레이트에 2.5 × 10 5 세포 / 웰, 1.25 × 10 5 세포 / 웰, 및 0.625 × 10를 도금했다
미토콘드리아와 당분 스트레칭의 분석은 도금 세포 수에 따라 달라집니다.
OCR는 세포 유동 분석에서 각 세포 유형 도금 밀도를 측정 하였다. 예상 한 바와 같이, 높은 세포 수는 더 높은 측정 OCR뿐만 아니라 더 극적 oligomycin 응답하는, 2,4- DNP 및 antimycin의 A / 로테 (도 4A)을 갖는다. 각 샘플의 단백질 농도를 측정 OCR 표준화는 일반적으로 세포의 큰 숫자가 정확한 OCR 측정 리드 것을 보여준다. (5) 2.5 × 105 세포로 도금 / 잘 T 세포 및 비장 세포와 5 1.25 × 105 세포에서 유사 정규화 OCR 측정 결과 / 웰의 B 세포 (도 4b)에서 유사 정규화 OCR 측정 결과. 정규화 된 B 세포에서의 약간의 차이는 OCR 측정은 B 세포 / 웰의 밀도가 다른 전지와 비교하여 2.5 × 105 세포에서 잘 수행하는 것이 간접 표시 될 수도. 모든 측정 값으로 0.625 × 10 5 세포 / 웰이 도금 밀도가 부족한 것으로 보여, 만족스럽지 못한 결과를 주었다. 기준선 호흡, 양자 누출, 최대 미토콘드리아 호흡 비 미토콘드리아 호흡 및 ATP 생산 선형 모든 세포 형태 (도 4C)에 대한 도금 밀도와 상관. 세 가지 유형의 세포에서 낮은 양자 누출에 의해 표시된 바와 같이 부가 적으로, 기준 호흡보다도, ATP 합성을 향해 사용된다. 미토콘드리아 응력 실험의 주요 초점은 OCR의 변화를 측정하는 동안, ECAR는 분석을 성공적으로 수행 하였다되도록 기록 여전히 유용하다. OCR 유사하게, 두 개의 높은 판 밀도가 높은 ECAR 및 oligomycin 더 크게 반응, 2,4- DNP 및 antimycin의 A / 로테 (도 4d)였다. 2,4-DNP의 추가시 ECAR 및 antimycin의 A / 로테의 극적인 변화로 인해 g의 변화뿐만 아니라 호흡의 변화 일 수있다그리고 H의 + - lycolysis, CO TCA 사이클에 발생이 때문에 HCO 3으로 변환된다. 이 문제는, 최근 어드레스 및 실제 당분 12,29 속도를 얻기 위해, 산소 소비 데이터를 이용하여 전체 세포 외 산성화 신호를 보정하기위한 간단한 방법이 존재하고있다.
해당 작용 응력 분석은 가장 높은 도금 밀도 (그림 5A, B)에 가장 성공적이었다. 모든 세포 유형에서, 5 × 105 세포 / 웰 샘플 oligomycin 글루코오스 첨가 후 ECAR에서 큰 변화가 있고, 2-DG (도 5b). 또한, 단백질 농도로 정규화하면 낮은 농도가 특히 0.625 × 105 세포 / 잘 않은 강력한 당분 예비 용량을 표시하지 않으면 서 모든 세포 유형을 위해, 5 × 105 세포 / 웰 샘플은 최적의 결과를 산출하는 것이 보였다. 비 glycolytiC 산성화, 해당 작용, 그리고 명백한 당분 용량이 선형 적으로 모든 세포 유형 (그림 5C)에 대한 도금 밀도와 상관 관계. 당분 응력 실험 들어, OCR 그래프 글루코스 약간 oligomycin 후 처리에 의해 억제된다 미토콘드리아 호흡 자극 것을 보여준다; 2-DG의 첨가는 OCR (도 5d)에 영향을주지 않았다. 문자 인식 그래프는 해당 작용 응력 실험을 성공적으로 수행 된 상기 지표로 사용될 수있다. 또한, OCR 그래프 미토콘드리아 12,29 스트레스 테스트의 경우 전술 한 바와 같이, 필요한 경우 ECAR 그래프를 정정하는데 사용될 수있다.
그림 1. (좌측)의 당분 해 플럭스 외 분석의 개요 (A) 예시 및 산화 적 인산화 (오른쪽)의 작용을 도시외 플럭스 분석에 사용되는 약물 대사. (B) 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 그래프의 회로도; 산소 소비 속도 (OCR) 그래프 (C)의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
.도 2 : T 세포, B 세포 및 생존 및 순도를 결정하기 위해 비장 단계적 게이팅 계측법 T 세포, 비장 세포 및 B 세포의 생존력 (A)를 보여주는 그래프 유량; 및 T 및 B 세포 (B)의 순도. 결과는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.
도 3. 셀 합류 다른 도금 밀도에서 각 세포 유형의 용 해물의 단백질 농도와 상관 관계 (A) × 105 세포를 5 × 105 세포 / 웰 0.625 범위 도금 밀도에서 분석 플레이트의 웰에있는 세포의 광 현미경 / 잘. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. BCA 분석에 의해 측정 된 다른 도금 밀도에서 (B) 파쇄 단백질 농도. 결과는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 각 세포 유형 도금 밀도 미토콘드리아 응력 분석. 원료 (A) 및 표준화 (B)는 OCR 나타낸다. (C)는 기준 최대 미토콘드리아 비 미토콘드리아 호흡의 레벨뿐만 아니라, 양자 누출 또는 ATP 생산에 연결된 산소 소비량의 셀 번호 의존적 변화는 각 세포 유형을 위해 도시된다. 미토콘드리아 스트레스 테스트에서 얻은 (D) 원료 ECAR 값이 표시됩니다. 각 데이터 포인트는 표준 편차 7-8 웰의 평균을 나타낸다. 표지 화살표 oligomycin 주사 (O), 2,4- DNP (D) 및 로테 논 / A (R / A)를 antimycin를 나타낸다. 결과는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 5 :. 각각의 세포 유형 도금 밀도 당분 응력 분석 원료 (A) 및 표준화 (B) ECAR 도시된다. (C) 비 당분 산성화, 포도당에 의한 당분 해 총 당분 용량 ECAR의 세포 수에 의존하는 변경 사항이 표시됩니다. 당분 스트레스 테스트에서 얻은 (D) 원료 OCR 값이 표시됩니다. 각 데이터 포인트는 표준 편차 7-8 웰의 평균을 나타낸다. 표지 된 글루코스 화살표 (G) oligomycin (O), 및 2- 데 옥시 글루코오스 (2- DG)의 주사를 나타낸다. 결과는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
프로토콜은 우리는 이후 해당 작용 및 미토콘드리아 호흡 성능의 차이를 평가하기 위해 상이한 농도에서 세포 외 유동 해석에 사용 된 순수한 가능한 림프구 서브 세트의 효율적인 분리를 위해 허용 개발 하였다. 이 프로토콜은 림프구를 위해 특별히 설계된 낮은 기초 대사 활동, 취약성, 저주파 이러한 세포 유형에 관련된 특별 고려 사항을 해결하고, 자신의 무능력 분석 플레이트에 부착된다. 따라서, 이전에 게시 된 프로토콜 11, 12에 비해, 우리의 방법은 면역학의 분야에 종사하는 연구자에 대한 더 편리하고 더 나은 최적화 가이드를 제안합니다. 순수와 생존 세포 개체군을 얻는 최적 합류 세포를 도금하고, 각 웰의 단백질 농도로 세포 유동 분석 측정의 표준화를 포함하여,이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가있다.
제 i모두는 광학 현미경에 의해 가시화 될 수있는 도금 셀 nitial 수는 단백질 농도를 측정하여 정량화 될 수있다. 세포 수 및 단백질 농도 간의 선형 상관 관계는 단백질 농도가 실제로 다른 웰 사이의 세포 수의 변화의 효과를 표준화하는 방법으로 사용될 수 있음을 확인 하였다.
단백질 농도로 ECAR 및 OCR 결과를 표준화함으로써 보여 것을 저급 셀 합류에도 불구하고, 거의 5 × 10 2.5 세포 / 웰의 데이터의 품질을 손상시키지 않으면 서 대부분의 분석에 사용될 수있다. 그러나, 세포 유형 분석 및 사이에서 변화 사용할 수있는 세포의 하한. 적은 수의 5 내지 10 X 125 세포와 같은 B 세포 OCR 측정도 2.5 × 105 세포 / 사용될 수 있지만 예를 들어,도 동일한 세포 유형의 당분 성능을 평가하기에 충분하지 않았다. 따라서, 한 세포 수는 제한 요인이 아니기 때문에 이상에 도금약 5 × 105 림프구에 해당하는 90 % 합류 / 웰 바람직하다. 또한 최적화가 요구 될 수있는 경우에 세포 크기가 다른 예 : 이전에 활성화 부분적으로 차별화 된 림프구가-되어 사용되는. 미리 배양 차 림프구를 사용하는 경우 또한, 죽은 사람 세포 수의 측정으로 단백질 농도의 신뢰성을 감소시킨다 다른 처리 조건과 세포 생존에 변형이있을 수 또는 죽어가는 세포는 또한 측정 된 단백질 수준에 기여 . 이러한 경우에, 세포 계측법 세포 외 플럭스 분석을 수행하기 전에 흐름으로 살아있는 세포를 정렬하는 데 도움이 될 수 있습니다.
갓 격리 높은 가능한 림프구 인구를 사용하여 우리의 분석에서, 우리는 모두 OCR 및 ECAR 측정을위한 신뢰할 수있는 기능 데이터를 얻을. 모든 세포 유형은 미토콘드리아 스트레스 테스트에 유사하게 동작하는 동안, 세포 유형 간의 현저한 차이가 있었다당분 스트레스 테스트에서 관측. 예를 들어, 나이브 T 세포의 당분 성능 또는 비장 B 세포에 비해 낮고, 그리고 oligomycin 첨가 변하지 않았다. 이러한 관찰 된 프로토콜의 유효성을 확인하기 이전에 발표 된 연구 7,30와 일치한다.
결론적으로, 우리의 방법은 세포 유동 분석기를 사용하여 림프구의 대사 활성을 테스트 효율적이고 편리한 방법을 제공하며, 이는 활성, 세포 분화 또는 인해시 면역 세포 대사의 변화를 탐색 면역 학적 연구의 넓은 범위에서 유용 감염,자가 면역 및 혈액 악성 종양과 같은 질병 표현형에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
| Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
| RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
| L-Glutamine 200 mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
| HEPES 1 M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
| Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
| Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
| CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
| B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
| Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
| MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
| autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
| autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis. |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
| Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak. |
References
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