Protocol
1. Forberedelse af materialer og Kultur Medium
- For dissektion og dissociation af SCZ, pak hjernen matrix, tveægget barberblad, og pincet med aluminiumsfolie, og derefter sterilisere dem ved autoklavering.
- Forbered 50 ml kold PBS-buffer til at vaske hele musehjerne.
- Opsæt en dissektion mikroskop og forberede de kirurgiske værktøjer, der kræves for dissektion af hjernen (autoklaveres saks og pincet) og isolering af SCZ (1 ml sprøjte, 30 G nål, hjerne matrix, og fin pincet).
- Fremstilling af N2-medium:
- Forbered F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + natriumhydrogencarbonat) medium med 2% B27, 1% N2 kosttilskud, og 1% penicillin-streptomycin.
Bemærk: Vækstmediet består af N2-medium og vækstfaktorer (20 ng / mL oprenset epidermal vækstfaktor (EGF) og 20 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF2)).
- Forbered F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + natriumhydrogencarbonat) medium med 2% B27, 1% N2 kosttilskud, og 1% penicillin-streptomycin.
- Forbered en fordøjelse buffer (40 enheder / ml papain, 2,4 enheder / ml dispase II, og 2% penicillin-streptomycin i PBS) i vævsfordøjelse.
- Fremstilling af Coating Plate og Coverslip:
- Forbered poly-L-ornithin (PLO 0,01%) og laminin (10 pg / ml opløst i DH 2 O). At overtrække plader med 6 brønde til vedligeholdelse af SCZ-aNSCs som et monolag eller 18 mm dækglas til immunfarvning, inkubere dem med PLO natten over ved 4 ° C. Så vaske dem 3 gange med DH 2 O. Lad pladerne og dækglas til tørre efter sidste vask.
- Dernæst inkuberes pladerne med laminin natten over ved 4 ° C. Derefter vaske dem 3 gange med DH 2 O.
Forsigtig: Tør ikke laminin, hvilket vil påvirke celle vedhæftet fil.
Bemærk: Coatingopløsningerne kan genbruges 3 gange.
2. Isolering og Dissociation af Voksen SCZ
- Forud for forberedelse kultur, placere hjernen matrix og tveægget barbermaskine på is.
Bemærk: Du må ikke fryses hjernen matrix, fordi brain kunne tillægger det. - Sacrifice en mus (8 uger gamle) ved CO 2 kvælning eller cervikal dislokation.
- Skær hovedet med skarp saks efter sprøjtning 70% ethanol. At immobilisere hoved, hold begge sider af hovedet stramt. Skære huden med en saks på midterlinjen i en kaudal-rostral retning. Dette fremmer fuldstændig fjernelse af skindet fra kraniet.
- Fjern caudale del af kraniet (posterior til lambda) først, og derefter indsætte pincet mellem kraniet og hjernen på dorsale midterlinie position. Grib venstre (eller højre) parietal knogle og forsigtigt flå det af. Gentag denne procedure for fjernelse af den anden parietal knogle.
Bemærk: Frakobling af synsnerven og fjernelse af meninges fra hjernen gøre det lettere at frigøre hjernen fra kraniet. - Overfør hjernen til kold PBS-buffer (25 ml) og skylles to gange for at fjerne overskydende blod.
- Placer hjernen ind i hjernen matrix på is og make koronale snit for at opnå en mm tykke skiver. Overfør hjernen skiver (1 mm) indeholdende SCZ regioner, der er placeret i den bageste del af hjernen til en kold PBS i et 35 mm plastik petriskål.
Forsigtig: For at opnå en parallel plan kranssektioner, at hjernen fissur placeres i midterlinjen af hjernen matrix; er det vigtigt at undgå unødvendige variationer i sektionerne.
Bemærk: Opnå hjerneskiver på 2-3 mm posteriort for bregma; dette tillader separationen af SCZ fra SVZ'en. - Under dissektionsmikroskop med en lille forstørrelse, mikro-dissekere SCZ fra den hvide substans område af cortex og hippocampus med en bøjet 30G nål 6,9. Fjern derefter de cortex regioner over SCZ. Placer dissekeret SCZ regionen fra skiverne i en 35 mm plastik petriskål på is uden kold PBS.
Bemærk: Forurening af ekstra regioner, der indeholder modne neuroner kan påvirke levedygtighed aNSCs og neurosfæren dannelse because de undergår celledød i aNSC dyrkningsbetingelser. - Ved hjælp af en bøjet 30 G nål, straks hak dissekerede væv i små stykker.
Bemærk: Hvis der kræves en længere tid til at dissekere den SCZ væv, fordybe de dissekerede væv i kold PBS før hakning. - Resuspender hakkede væv med 1 ml spaltningsbuffer, overføre vævet til en 15 ml rør indeholdende 2 ml fordøjelse buffer og inkuberes i 30 minutter i et 37 ° C vandbad.
Bemærk: Ryst røret hver 10 min til bland godt.
3. Subcallosal Zone-afledte Adult Neural Stem Cell Culture
- Tryk røret mildt at adskille fordøjede væv, og derefter centrifugeres røret ved 145 xg i 5 min. Supernatanten fjernes, resuspenderes den fordøjede væv med 1 ml forvarmet N2 medium til at vaske ud fordøjelsen buffer, og forsigtigt pipetteres prøveopløsningen maksimalt 5 gange ved hjælp af en P1000 pipette.
Bemærk: Over-findeling med en smalpipettespids kan mindske cellernes levedygtighed og efterfølgende vækst. - Centrifugeres røret ved 145 xg i 5 min. Efter bortkastning af supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml N2-medium.
- Forbered 1 ml N2-medium i en ikke-overtrukket plade med 6 brønde, og der tilsættes 1 ml af de opslæmmede celler at foretage en endelig volumen på 2 ml.
- Tilføj EGF (20 ng / ml) og bFGF (20 ng / ml) i hver brønd. Ryst forsigtigt 6-brønds dyrkningsplade med hånden for at blande de tilsatte vækstfaktorer med de udpladede celler. Hold 6-brønds plade i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
- Tilføj EGF (20 ng / ml) og bFGF (20 ng / ml) til hver brønd hver dag i 8 dage. Hver tredje dag, tilsættes 200 pi N2 medier for at opretholde den omtrentlige 2 ml volumen af mediet.
4. Passage af NSC'er som Neurosfærer og monolagskulturer
- Saml neurosfærer og overføre dem til en ny 15 ml konisk rør.
Bemærk: Antallet af neurosfærer (> 50 um diameter) per godt fra SCZ af en enkelt musehjerne var 64,3 ± 7,31, hvilket var mindre end den for SVZ'en (190,5 ± 6,33) 9. - Inkubér neurosfærer med 0,5 ml dissociation buffer i 5 minutter i et 37 ° C vandbad for at dissociere neurosfærer i enkeltceller. Primære neurosfærer kan adskilles i enkelte celler og vedligeholdes over flere passager som neurosfære eller enkeltlagskulturer.
Bemærk: Udvidelse SCZ-aNSCs som et monolag er bedre end neurosfærer fordi SCZ-aNSCs kan passeres> 10 gange i et monolag kultur format, dog <5 gange i en neurosfære kultur format.
Forsigtig: SCZ-aNSCs udviser stærk aggregering, og det er vanskeligt at adskille dem i enkeltceller. Således er neurosfære kultur format anbefales ikke til rutinemæssig celle ekspansion. - Forsigtigt pipette prøveopløsningen op og ned med en P1000 pipette mindre end 5 gange og centrifugeres røret ved 145 xg i 5 min. Supernatanten fjernes, og re-sutilbringe neurosfærerne med 1 ml N2 medium.
Bemærk: Over triturering med en smal pipettespids kan mindske cellernes levedygtighed og efterfølgende vækst. - At tælle cellerne, lave en 1: 1 blanding af cellesuspensionen (10 pi) og 0,4% trypanblåt-opløsning, og derefter tælle antallet af levende celler på en hematocytometer. Efter coating af en 6-brønds plade med PLO / laminin, plade cellerne ved 2,5 x 10 5 celler / ml med 2 ml N2 medium til hver brønd.
Bemærk: Ændringer i celletæthed kan påvirke deres tilstand og differentiering potentiale. - Opretholde SCZ-aNSCs med en daglig behandling af vækstfaktorer (2 ml, 20 ng / ml) i 5 dage, og dem passage dem.
5. Differentiering af Subcallosal Zone-afledte Adult neurale stamceller
- Plade aNSCs onto en PLO / laminin-overtrukne 18 mm dækglas med 1 x 10 5 celler / ml i 1 ml N2 med vækstfaktorer (20 ng / ml) i differentiering af SCZ-aNSCs.
- Den næste dag,når cellerne solidt fastgjort til dækglasset ombytte vækstmediet med N2 for at fjerne vækstfaktorer.
- Efter 6 dage, vaske de differentierede celler med 1 ml PBS til fjernelse af cellerester og løse dem for immunfarvning.
Bemærk: BrdU kan inkorporeres i den nyligt syntetiserede DNA fra prolifererende celler. Derfor, hvis det ønskes, kan der tilsættes BrdU (10 ug / ml) til levende celler før fiksering af celler.
6. Immunfarvning Adult neurale stamceller og Differentierede progenitorer
- For immunfarvning, vaske cellerne med PBS og fikseres med 4% PFA i 20 minutter ved stuetemperatur.
Advarsel: PFA er meget giftig; undgå kontakt med hud og øjne. - Fjern 4% PFA, skyl de faste celler med PBS 3 gange, og derefter gemme dem ved 4 ° Cuntil de er nødvendige for immunfarvning.
- Inkubér cellerne på dækglasset med blokerende opløsning (3% bovint serumalbumin og 0,1% Triton X-100 i 1x PBS) i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered de primære antistoffer i frisk blokeringsopløsning og inkuber prøverne natten over ved 4 ° C.
- Immunfarvning de aNSCs
- Farv de aNSCs bruger anti-Nestin og anti-BrdU antistoffer. Før fiksering, tilsættes 20 ug BrdU til aNSCs og inkuberes dem i 2 timer. Udfør denatureringstrin ved anvendelse af 2 N HCI i 20 minutter ved 37 ° Cbefore udfører blokerende trin.
- Immunfarvning de differentierede ophav:
- Bruge anti-O4, anti-BIII-tubulin, og anti-glial fibrillært surt protein (GFAP) antistoffer til at mærke de differentierede stamceller.
- Immunfarvning de aNSCs
- Vask prøverne med PBS 3 gange og inkuberes dem med sekundære antistoffer konjugeret til fluorescerende farvestoffer (1: 500) i blokeringsopløsning i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes prøverne 3 gange med PBS.
Bemærk: Brug sekundære antistoffer, der matcher værter i det primæreantistoffer. Hoechest33343 (1: 2.000) anvendes til nuklear farvning. - Tilføj monteringsløsning til et dias glas og fortsætte med montering. Observer og billede prøven på en konfokal mikroskop på flere bølgelængder: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), og Hoechest33343 (405 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definition af kultur for aNSCs fra ukendte neurogene region er vigtig for forståelsen af disse celler, og for at udvikle deres potentielle anvendelse i hjernen reparation 12. Det er kendt, at NSC'er i forskellige udviklingsstadier eller i forskellige regioner opfører sig anderledes 3,4. For nylig blev det rapporteret, at SCZ-afledte celler udviser differentielle potentialer for neuronal differentiering in vivo og in vitro sammenlignet med SVZ-afledte celler 7-9. Derfor netop at isolere hver neurogen region, blev hjernen skiver, der omfatter SCZ dissekeret under anvendelse af en 1 mm hjerne matrix (figur 1A). Efter 8 dages dyrkning med vækstfaktorer, kan aNSCs afledt fra SCZ danner neurosfærer, i hvilket cellerne kan efterfølgende opretholdes (figur 1B).
Da en delmængde af NSC'er i neurosfærerne kan være spontaneously differentieret 13, en monolagskultur system er også nyttigt for opretholdelse af den relativt homogen population af SCZ-aNSCs. Vækstfaktorer og dissociation enzymer såsom trypsin ikke let gennemtrænge dybt inde i neurosfæren 14,15. Monolagskulturer give mere endda betingelser for udvidelse af NSC. Fra primære neurosfærer blev SCZ-aNSCs dissocieret til enkelte celler ved en fordøjelse buffer behandling. En dag efter cellepodning blev aNSCs fastgjort til den coatede plade og udviste celleproliferation (figur 2A). For at bekræfte deres potens af spredning, blev BrdU tilføjet i medierne. Efter inkubering med BrdU i 2 timer blev cellerne let farvet med anti-BrdU (en markør for proliferation) og anti-Nestin (en markør for neurale stamceller) antistoffer, hvilket indikerer, at SCZ-aNSCs aktivt prolifererende og vedligeholde de vigtigste egenskaber stamceller (figur 2B). Derfor de ikke EXHibit markører for differentierede celler, såsom EGFR (udtrykt i transient-forstærkende celler) og DCX (udtrykt i neuroblaster) (figur 2C).
For at bekræfte multipel differentiering potentiale SCZ-aNSCs blev vækstfaktorer fjernet fra dyrkningsmediet. Efter 6 dage blev cellerne immunfarvet med forskellige beslutningstagere for differentierede celler. At udstille de forskellige afkom af aNSCs, markører for neuroner (TUJ1), astrocytter (GFAP) og oligodendrocytter (O4) blev ansat; alle disse celletyper blev dannet fra SCZ-aNSCs (figur 3).
Figur 1: Isolering af SCZ-regionen og dannelse af neurosfæren. (A) Procedure for dissektion af SCZ regionen fra den voksne musehjerne. Til kultur SCZ-aNSCS er en 8 uger gamle mus hjerne placeres på en hjerne matrix (1 mm intervaller). Efter sektionering, 1 mm hjernen skiver, der omfattede SCZ region (2-3 mm fra bregma) blev dissekeret (angivet med den røde stiplede linje). (B) neurosfære-dannelse. Otte dage efter in vitro-kultur, primære neurosfærer (passage 0) blev dannet og passeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vedligeholdelse af SCZ-aNSCs som et monolag kultur. (A) En dag efter podning af dissekerede celler blev SCZ-aNSCs fastgjort og udvidet på en coatet skål i et monolag måde (venstre). Tre dage efter vedligeholdelse, blev antallet af SCZ-aNSCs steget (til højre). (B) Immunfarvning med BrdU (rød, en markør for prolifererende celler), Nestin (grøn, en markør for neurale stamceller), og Hoechest33343 (blå, en markør for kerner). (C) Immunfarvning med neurale stam- / progenitorceller cellemarkører Nestin (rød, en markør for type B-neurale stamceller), EGFR (grøn, en markør for type C transiente-amplifikation celler), og DCX (blå, en markør for type A neuroblasts). Kerner blev modfarvet med Hoechest33343 (hvid). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: immunfarvning af de differentierede celler fra SCZ-aNSCs. Immunfarvning med differentieringsmarkører TUJ1 (grøn, en markør for umodne neuroner), O4 (rød, en markør for oligodendrocytter), og GFAP (råberow, en markør for astrocytter). Forstørrede billeder vises som mellemværker. Hoechest33343 (blå) blev anvendt til counter-farvning kernerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en detaljeret protokol til at generere NSC'er fra voksne mus SCZ og at opretholde dem til forskellige applikationer. Der er tre kritiske trin til oprettelse af in vitro-dyrkning system, er nødvendig for at rense og udvide SCZ-NSC. For det første er det vigtigt at sikre, at SCZ region præcist dissekeres ud fra andre potentielle neurogene regioner (figur 1B). Tykke og præcise sektioner indeholdende SCZ regioner blev opnået med et interval på 1 mm hjerne matrix, og derefter en fin nål blev anvendt til mikro-dissektion af SCZ fra andre corticale områder (figur 1A). Når ikke-NSC'er fra tilstødende væv, såsom hjernebarken, dyrkes med SCZ-aNSCs, katastrofale døden indtræffer, som krænker levedygtighed og kugle-dannelse af SCZ-NSC'er 16-18,22. Den caudale SCZ (2-3 mm posteriort for bregma) blev bekræftet som den bedste region for at generere forskellige SCZ-aNSCs. For det andet appropriate enzymatisk behandling i trinnene høst og overførselsteknikker er afgørende for at opnå et højt udbytte af celler. Dispase II og papain var mere effektiv til at isolere aNSCs end trypsin. Dissociation af celler til passage med dissociation buffer i stedet for trypsin forbedret deres levedygtighed 19. Mekanisk dissociation og triturering med en pipette bør være minimal. For det tredje er en celle si generelt anvendes i primær kultur systemer til at fjerne cellerester efter væv fordøjelse. Men på grund af lokaliseringen af SCZ-aNSCs, er disse celler opnået efter brud på hvide substans ved enzymfordøjelse og mekanisk triturering. Under filtrering med en cellesigte, ville en væsentlig mængde celler tabt. Derfor dyrkning SCZ-aNSCs uden brug af en cellesigte er en bedre måde at få et højt udbytte af celler.
Mens begge neurosfære kulturer og monolagskulturer kan anvendes til opretholdelse af NSC'er, en begrænsning af neurosfære kultur er at enlige NSC'er dissocieret efter spaltning kan være tilfældigt sammen. Sammenlægning resultater i forskellige størrelser af neurosfærer. Når størrelsen af en neurosfære når en vis kritisk værdi, neurosfæren vokser som en heterogen struktur, på grund af mangel på næringsstoffer, vækstfaktorer og oxygen ved kernen 20. Endvidere er neurosfærer med store størrelser ikke let dissocieres med dissociation buffer og kræve længere enzymatiske behandlingstider med omfattende mekanisk triturering, hvilket fører til lavere cellelevedygtighed. Derfor anbefales det monolagskultur til opretholdelse SCZ-aNSCs gennem flere passager. I en monolagskultur system er aNSCs stabilt opretholdt som NSC'er (type B) uden spontan differentiering til bestemte celler, såsom progenitorer (type C og A) (figur 3A). SCZ-aNSCs blev passeret i længere perioder, <5 passager i en neurosfære format og> 10 passager som et monolag. Dette er ulemperistent med tidligere resultater, der antyder, at det monolagskultur system opretholder NSC in vitro i langsigtede kulturer 21. Men den prolifererende hastighed faldt, og den del af døende celler steg over 5 passager. Udvidet passage påvirker multipotency og neuronal differentiering med øget kromosomafvigelser 22. Derfor at undgå udvidede overførselsteknikker effekter, anbefales det, at anvende tidlig passage (<passage 5) celler for proliferation og differentiering analyse. Selvom potentialet for selv-fornyelse af SCZ-aNSCs ligner SVZ-aNSCs, blev mindre neuronal differentiering vist i SCZ-aNSCs 9.
Metoder til isolering aNSCs fra neurogene områder af den voksne hjerne, herunder SVZ'en og tandede gyrus (DG), er der etableret 22. Selv om sådanne protokoller har fremmet isolering og dyrkning af aNSCs in vitro, er der flere begrænsninger for at opnå et stort antalceller. Mange protokoller anvender en hjernevæv chopper, som kan forårsage tab af hjernevæv under sønderdeling procedure. En anden fremgangsmåde til isolering aNSCs fra neurogene områder anvender en koronal snit gennem hjernen under anvendelse af en skalpel. Dette er efterfulgt af mikro-dissektion af SVZ'en eller af GD langs den langsgående revne 23. Tilstedeværelsen af andre hjerneområder kan forårsage andre celletyper til at forurene aNSC kultur, som kan påvirke levedygtigheden af celler in vitro. Med den nuværende protokol, kan mange forskellige prøver håndteres i et enkelt eksperiment, herunder kontrol versus forskellige forsøgsgrupper. Også, udskæring ved hjælp af en hjerne matrix er overlegen i forhold til en hjerne snitning værktøj, da det giver mulighed for at nå NSC'er fra forskellige hjerneområder med en høj celle udbytte. Det muliggør også en sammenligning af aNSCs fra forskellige regioner af den samme hjerne.
Transplantation og teknik af endogene NSC'er har været begynder at betragted som mulige strategier for stamcellebehandling. For dette, in vitro-undersøgelser om karakteristika aNSCs bør også grundigt undersøgt. Derfor vil etableringen af en velkarakteriseret in vitro kultur-system være nyttige for at fremme anvendelsen af NSC. I denne kultur-system blev stængel-celle egenskaber SCZ-aNSCs velholdt, som det fremgår af selv-fornyelse og multiple-slægt differentiering under passende betingelser. Derfor kan denne kultur-system bruges til udvidelse af SCZ-aNSCs til biologiske undersøgelser og terapeutiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M.
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H.
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
