Detta protokoll beskriver driften av ett vätskeflöde provhållare för avsökning transmissionselektronmikroskopi av AuNPs i vatten, som användes för observation av nanoskala dynamiska processer.
Prover helt inbäddade i vätska kan studeras på en nanoskala rumsliga upplösning med Scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) med hjälp av en mikroflödeskammare monteras i provhållare för transmissionselektronmikroskopi (TEM) och STEM. Den mikroflödessystem består av två kiselmikrochips som stöder tunna kiselnitrid (SiN) membranfönster. Den här artikeln beskriver de grundläggande stegen för provladdning och datainsamling. Viktigast av allt är att säkerställa att vätskeavdelningen är korrekt monterad, vilket ger ett tunt vätskeskikt och en vakuumtätning. Detta protokoll innehåller också ett antal tester som behövs för att utföra under provladdning för att säkerställa korrekt montering. När provet laddas i elektronmikroskop, behöver den vätskeformiga tjockleken som skall mätas. Felaktig montering kan leda till en alltför tjock vätska, medan en alltför tunn vätska kan tyda på avsaknad av vätska, till exempel när en bubbla bildas. Slutligen protokolletförklarar hur bilder tas och hur dynamiska processer kan studeras. Ett prov innehållande AuNPs avbildas både i rent vatten och i saltlösning.
Konventionell Scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) är begränsat av intervallet av prover lämpliga för analys, specifikt de torra och fasta prover som är lämpliga för placering i ett högt vakuum. Men många vetenskapliga och tekniska frågor rör nanomaterial och processer i flytande miljö. Prover fullständigt inbäddade i vätska kan nu studeras med STEM med användning av ett koncept som innebär en mikroflödeskammare monterad i provhållaren för transmissionselektronmikroskopi (TEM) och STEM 1. Denna nyutvecklade tekniken har blivit allt populärare, eftersom det ger nya insikter i viktiga processer i olika forskningsområden, inklusive tillväxt, upplösning och aggregering processer nanopartiklar 2, 3, 4, 5, 6. Inte bara metaller, men också biominerals 7 och biologiska system kan studeras 8, 9, 10, 11. Provet lastning och bild förvärv för flytande fas STEM är annorlunda än för STEM av torra prover och innebär ett protokoll som kräver dedikerade utbildning.
Den mikroflödessystem består av två kiselmikrochips som stöder Kiselnitrid (SiN) membran fönster öppna för elektronstrålen vid 200 keV energi 12 (se figur 1A). Närmare uppgifter om de dimensioner och av hanteringen av dessa mikrochips kan hittas någon annanstans 12, 13. Provet innehåller vanligtvis nanoobjekt. I denna uppsats observerade vi guldnanopartiklar (AuNPs). De AuNPs är immobiliserade på det övre fönstret (med avseende på en nedåt reser elektronstråle) eller flyta i flytande tvid. Nanoskala rumsliga upplösningen i STEM erhålls genom avsökning av elektronstrålen över AuNPs och samla sänds spridda elektroner med hjälp av ringformiga mörka fält (ADF) detektor 9. De två mikrochips är placerade i en liten slits i spetsen av vätskeflödet TEM hållaren 1 (hållaren fungerar för både STEM och TEM men benämnes TEM hållaren). En av mikrochips innehåller ett distansorgan, så att en vätskeavdelningen bildas mellan mikrochips. O-ringarna på båda sidor av de två mikrochips ger vakuumförslutning av vätskeavdelningen 13 (se figur 1B).
Syftet med denna artikel är att visa de grundläggande stegen för provladdning och datainsamling så att intresserade användare kan finna enkel tillgång till denna framväxande nya tekniken. Ett system tillgängligt från ett visst företag används, men protokollet är också giltiga för system av andra företag. Tekniken ärmer komplex än konventionella TEM och STEM, och ett antal praktiska aspekter måste beaktas när man arbetar med en flytande hållare systemet 13. Viktigast av allt är att säkerställa att vätskeavdelningen är korrekt monterad, vilket ger ett tunt vätskeskikt och en vakuumtätning. Därför är det mycket viktigt att arbeta rent och för att förhindra dammbildning under beredning och montering av vätskeflödet TEM hållare. I synnerhet O-ringarna och två kiselmikrochips måste vara fri från all kontaminering. Även små partiklar av damm på ett av de mikrochips kan allvarligt öka tjockleken på den monterade cellen, vilket kan hindra uppnåendet av en användbar spatial upplösning. En vakuumtätning är viktigt så att ingen kontaminering eller skada kommer att vara kvar i elektronmikroskop efter experimentet. Detta protokoll beskriver laddningsproceduren och flera nödvändiga tester. Driften av elektronmikroskopet är okomplicerad, but det kräver några extra steg jämfört med mikroskopi av fasta prover. Med ökande vätsketjocklekar, fler elektroner absorberas och sprids av vätskan; en mätning av den vätskeformiga tjockleken är väsentlig. Slutligen förklarar protokollet hur bilder tas och hur dynamiska processer kan studeras.
Figur 1: Vätska Flow Cell för skanning transmissionselektronmikroskopi (STEM). (A) Schematisk illustration av den sammansatta vätske cellen. Två kiselmikrochips med kiselnitrid (SiN) membranfönster är placerade mellan två O-ringarna. Vätskan är innesluten mellan den SiN membranet och är således separerade från vakuumet i elektronmikroskop. En fokuserad elektronstråleskanningar över provet. Kontrast erhålls från spridda elektroner. Guldnanopartiklar (AuNPs) immobiliseras inuti vätskan vid SiN membranet men kan även röra sig iflytande. (B) Schematisk sidovy tvärsnitt av stapeln av två mikrochips med O-ringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det beskrivna protokollet möjliggör STEM av AuNPs i en vätska, innefattande observationen av dynamiska processer. Monteringen av innehavaren är en enkel att lära sig tekniken. Dock måste flera aspekter beaktas när man arbetar med vätskeflödet TEM hållare. Exempelvis kan brutna kanter av Si mikrochip eller stora partiklar på O-ringarna resulterar i läckage av den flytande cellen. Å andra sidan, stora partiklar (> 200 nm, t ex damm eller Si skräp) kan på SiN membranet resultera i en ökad tjocklek av den flytande cellen, vilket leder till en låg avbildning kontrast eller till en låg spatial upplösning och kan även orsaka SiN fönster att bryta. Viktigt kan rester av salt eller andra kemikalier påverka resultatet av experimenten på ett oönskat sätt. Därför är det viktigt att de olika stegen av provpreparering och hållarenheten utförs noggrant och i en ren och dammfri miljö.
Tjockleken av vätske cell bestämmer den uppnåbara upplösningen, såväl som kontrasten av de erhållna bilderna 17. Denna tjocklek kan justeras via distansorgan belägna på en av de två Si-mikrochips. Beroende på dimensionerna för provet, kan olika tjocklekar av den flytande cellen realiseras. För studier av AuNPs, är det möjligt att använda små distansorgan (200-500 nm), medan hela eukaryota celler behöver större distanser på upp till 5 ^ m. Tjockleken hos den flytande cellen påverkas vidare av utbuktning av de SiN membranfönster som resulterar från tryckskillnaden mellan vätskecellen och den omgivande vakuum. Denna effekt blir mer uttalad med större SiN membranfönster. Således, för att minimera tjockleken hos den flytande cell, är det rekommenderat att använda små SiN membran fönster. I fall det är svårt att hitta en överlappning mellan två små fönster, kan de monteras i en korsad konfiguration med hjälp av en annan bas mikrochip. Alternativa konfigurationer largely förhindra utbuktning och består av en monolitisk mikrochip 18 eller membranfönster stöds av pelare 19, men de uppvisar nackdelar när det gäller provbelastning. En av de mest utmanande aspekterna av den nuvarande tekniken är bristen på exakt kontroll över vätske tjocklek. Ofta är vätskan mycket tjockare än vad som förväntas av distans dimensioner som används, såsom visas här. Flera grupper använde slutna vätskekamrarna 4, 20, 21, 22; dessa system har vissa fördelar vad gäller spatial upplösning, som vätske tjocklek kan reduceras genom att inducera en bubbla i vätskan. Alternativt kan SiN fönstren tvingas att kollapsa, vilket leder till en tunnare vätskeskiktet. För det tredje finns höljet andra tunnare fönster (t.ex. grafen) 23, också resulterar i mycket tunnare vätskorän vad som är möjligt med det system som beskrivs i detta protokoll. Det är emellertid omöjligt att flöda vätskan i dessa system.
Som för alla med hög upplösning mikroskopi teknik måste ett antal experimentella aspekter beaktas. Den viktigaste aspekten är interaktionen av elektronstrålen med vätskan eller provet. Förutom strålningsskada, vilket begränsar den uppnåe rumsliga upplösningen för många fasta prover 24, är de flytande proverna påverkas även av elektronstrålegenererade radiolysprodukter 15, 25. Eftersom dessa produkter kan påverka experimentet noggranna tolkning av data och experimentell design är viktiga 26. Inställningarna mikroskop bör väljas i enlighet med målen för en viss studie. ADF STEM är mer kraftfull för avbildning nanopartiklar av ett högt atomnummer (Z) i större tjocklekar i den flytande cellen, while TEM ger bättre kontrast på låg-Z material och är typiskt snabbare men kräver tunnare vätskeskikt 3. Istället för att använda den automatiska dokumentmataren detektorn är Bright Field (BF) detektor används ibland för att avbilda flytande cellen, eftersom BF STEM är fördelaktig för att avbilda låg-Z material i tjocka lager 27. Med ökande tjocklek av vätske cell behövs mer aktuell. Detta ökar emellertid också koncentrationerna av radiolysprodukter och ökar strålningsskada. Det bör också noteras att en omkastning av kontrast observeras i ADF detektor för mycket tjocka vätskor (> 10 ^ m för vatten).
De flytande betingelser ändrades mellan våra experiment genom att ta bort hållaren från mikroskopet och utbyta både provet och vätskan. Förutom att ändra saltkoncentrationen, är det lätt möjligt att ändra andra egenskaper hos vätskan genom strömning i olika vätskor (t.ex. har enanvända buffertlösningar i syfte att skapa en viss pH 16 eller kan införa organiska lösningar eller andra tillsatser). Det är också möjligt att ändra vätskan medan hållaren fortfarande sitter i mikroskopet genom att flöda vätskor genom mikroflödessystem. Men i detta fall, är det okänt, vid vilken tidpunkt peka vätskan vid prov förändringar. Det är också värt att notera att mikrochips som stöder elektroderna är tillgängliga, så nanoelektrokemi experiment kan utföras 28.
Studieobjekten är inte begränsade till AuNPs i vatten, men kan studeras en stor mångfald av prover med användning av det protokoll som beskrivs ovan, innefattande kiseldioxid, titanoxid, och polymerer. Om rörelser föremålen är för snabbt för att fånga i en bild inom förvärvet kan viskositeten sänkas med en storleksordning genom att använda en blandning av 50% glycerol och 50% vatten.
Från ovanstående punkter,ett antal fördelar, möjligheter, och också nackdelar blivit uppenbart. När man arbetar med flytande fas STEM, de viktigaste nackdelarna att tänka på är att: 1) varje experiment påverkas av det dynamiska samspelet av elektronstrålen med hela provet (föremålet under observation, vätskan och SIN membran); 2) provhantering är omständlig, och det är ofta svårt att uppnå ett tunt vätskeskikt, eftersom provet eller de mikrochips innehåller vissa mikrometerstora partiklar; 3) vätske tjocklek skiljer sig vanligtvis till stor del från den avsedda tjockleken bestäms av distans; och 4) rumslig upplösning och skiljer sig starkt beroende av den vätskeformiga tjockleken och skillnaden mellan förändringen täthet hos ett föremål under observation och vätskan.
För närvarande finns det gott om metoder för mikroskopi av objekt i vätska med nanometer rumslig upplösning. Elektronmikroskopi i amorf is är en kraftfull teknik 29,men de inblandade experimentella procedurer är känsliga, inte alla experiment tillåter beredning av provet i is, och tidsupplösta experiment är omöjliga. Röntgenmikroskopi 30, kunde 31 i princip användas, men det har en begränsad rumslig upplösning och inte är allmänt tillgängliga i laboratorier. Atomkraftsmikroskopi i vätska har fastställts men är en yta teknik endast 32, 33, 34, 35. Ijusmikroskopi uppvisar inte tillräcklig rumslig upplösning. För närvarande, elektronmikroskopi i flytande verkar mest kraftfulla tekniken för direkt mikroskopi av nanoobjekt och processer i flytande.
Flytande fas TEM och STEM är ännu inte rutin analytiska tekniker men är fortfarande under utveckling. Antalet parametrar att ta hänsyn till är avsevärd, och det är often svårt att reproducera experimentella resultat. Dessutom är kvantitativa data svårt att erhålla eftersom effekterna är föremål för undersökningen är sammanflätade med processer som sker som ett resultat av elektronstrålen. Protokollet som beskrivs här syftar till att standardisera den experimentella protokollet, vari redovisning av alla relevanta base aspekter av experimentet. Vi hoppas att detta protokoll kommer att leda till bättre reproducerbarhet av experimentellt arbete i detta framväxande område.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM. The research was in part supported by the Leibniz Competition 2014.
Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
Chemicals | |||
Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
Materials | |||
Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
(Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
Clean room tissue Sontara Micropure AP (224x224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |