Summary
פרוטוקול זה מתאר את הפעולה של בעל דגימת זרימת נוזל עבור מיקרוסקופיית אלקטרוני הילוכים של AuNPs במים, כפי שמוצג על התצפית של תהליכים דינמיים ננומטריים.
Abstract
דוגמאות מלא מוטבע בתוך נוזל ניתן ללמוד ברזולוציה מרחבית ננו עם סריקה הילוכים אלקטרונים מיקרוסקופית (STEM) באמצעות תא microfluidic התאספו בעל הדגימה עבור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) ו STEM. מערכת microfluidic מורכבת משני שבבי סיליקון תמיכת ניטריד הסיליקון דקה (חטא) חלונות הממברנה. מאמר זה מתאר את הפעולות הבסיסיות של טעינת מדגם ורכישת נתונים. והחשוב מכל הוא להבטיח כי התא הנוזלי הוא מותקן בצורה נכונה, ובכך לספק שכבת נוזל דקה חותמת ואקום. פרוטוקול זה כולל גם מספר הבדיקות הנדרשות לבצע במהלך טעינת מדגם כדי להבטיח הרכבה נכונה. לאחר המדגם טעון מיקרוסקופ האלקטרונים, עובי הנוזל צריך להימדד. הרכבה לא נכונה עשויה לגרום נוזל עבה מדי, בעוד נוזל מדי-דק עשוי להצביע על היעדר הנוזל, כגון כאשר נוצרת בועה. לבסוף, הפרוטוקולמסביר כיצד ניתן ללמוד תמונות תהליכים נלקחות ואיך דינמי. מדגם המכיל AuNPs הוא צלם הוא במים טהורים מלוח.
Introduction
קונבנציונלי סריקת הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופי (STEM) הוא מוגבל על ידי המגוון של דגימות המתאים לניתוח, במיוחד הדגימות היבשות מוצקות עבור מיקום המתאימים ואקום גבוה. עם זאת, שאלות מדעיות וטכנולוגיות רבות נוגעות חומרים ננומטריים ותהליכים בסביבה נוזלית. דוגמאות המשובצות במלואם את הנוזל ניתן ללמוד עכשיו עם גזע באמצעות מושג הכרוך בתא microfluidic התאסף בעל דגימת הילוכים מיקרוסקופי אלקטרונים (TEM) ו STEM 1. טכניקה חדשה שפותחה זה הפכה יותר ויותר פופולרי, כפי שהוא מספק תובנה חדשה תהליכים חשובים של נושאי מחקר שונים, כוללים הצמיחה, הפירוק, ותהליכי צבירה של חלקיקים 2, 3, 4, 5, 6. לא מתכות בלבד, אלא גם biominerals 7 ומערכות ביולוגיות ניתן ללמוד 8, 9, 10, 11. טעינת מדגם רכישת תמונה עבור STEM נוזל שלב שונה מאשר גזע של דגימות יבשות כרוך פרוטוקול הדורש הכשרה ייעודית.
מערכת microfluidic מורכבת משני שבבי סיליקון תמיכת סיליקון ניטריד (חטא) חלונות קרום שקופות עבור אלומת האלקטרונים ב 200 keV אנרגיה 12 (ראה איור 1 א). פרטים על המאפיינים של טיפול השבבים אלה ניתן למצוא במקום אחר 12, 13. המדגם כלל מכיל אובייקטים בקנה מידה ננומטרי. במאמר זה צפינו חלקיקי זהב (AuNPs). AuNPs הם משותקים ליד החלון העליון (ביחס קרן אלקטרונים מטה-נסיעה) או לצוף liquתְעוּדַת זֶהוּת. רזולוציה מרחבית ננו ב- STEM מתקבל על ידי סריקת אלומת אלקטרונים על AuNPs ואיסוף האלקטרונים מפוזרים מועבר באמצעות שדה האפל טבעתי (ADF) גלאי 9. שני השבבים ממוקמים בתוך חריץ קטן בקצה של בעל TEM זרימת נוזל 1 (בעל פועלת לשני STEM ו TEM אבל המכונה בעל TEM). אחד השבבים מכיל spacer כך תא נוזל נוצר בין השבבים. טבעות אטימה משני צידי שני שבבים לספק ואקום איטום של תא נוזלי 13 (ראה איור 1B).
מטרת מאמר זה היא להדגים את השלבים הבסיסיים של טעינת מדגם ורכישת נתונים כך שמשתמש מעוניין יכול למצוא גישה קלה הטכניקה החדשה הזאת. מערכת זמינה מחברה ספציפית נלקחת בחשבון, אבל הפרוטוקול תקף גם עבור מערכות של חברות אחרות. הטכניקה היאמורכב יותר TEM גזע קונבנציונליים, ומספר ההיבטים המעשיים יש לקחת בחשבון כאשר עובדים עם מערכת בעל נוזלי 13. והחשוב מכל הוא להבטיח כי התא הנוזלי הוא מותקן בצורה נכונה, ובכך לספק שכבת נוזל דקה חותמת ואקום. לכן, חשוב מאוד לעבוד בצורה נקיה וכדי למנוע היווצרות אבק במהלך תקופת ההכנה וההרכבה של בעל TEM זרימת הנוזל. בפרט, טבעות האטם ושתיים שבבי סיליקון צריכים להיות חופשיים מכל הזיהום. אפילו חלקיקים קטנים של אבק על אחד השבבים עשויים קשות להגדיל את העובי של התא התאסף, אשר עשוי למנוע את השגת רזולוציה מרחבית שימושית. חותם ואקום חשוב כך שאף זיהום או נזק יישאר מיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הניסוי. פרוטוקול זה מתאר את הליך טעינת בדיקות הנדרשות מספר. המבצע של מיקרוסקופ האלקטרונים הוא פשוט, but זה דורש כמה שלבים נוספים לעומת מיקרוסקופיה של דגימות מוצקות. עם הגדלת עובי הנוזל, יותר אלקטרונים נספגים מפוזרים על ידי הנוזל; מדידה של עובי הנוזל חיונית. לבסוף, הפרוטוקול מסביר כיצד תמונות נלקחות ואיך תהליכים דינמיים ניתן ללמוד.
איור 1: תא זרימת נוזל עבור סריקה הילוכים אלקטרונים מיקרוסקופית (STEM). (א) איור סכמטי של נוזל התא התאסף. שני שבבים סיליקון עם סיליקון ניטריד (חטא) חלונות קרום מוצבים בין שתי טבעות אטימות. הנוזל סגור בין הממברנה SiN ובכך מופרד הוואקום במיקרוסקופ האלקטרונים. סריקות אלומת אלקטרונים ממוקדות על המדגם. ניגודיות מתקבלת מאלקטרונים מפוזרים. חלקיקי זהב (AuNPs) הם משותקים בתוך הנוזל על הממברנה SiN אבל גם יכול לנוענוזל. (ב) חתך סכמטי הצד לנוכח ערימת שני שבבים עם טבעות אטימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
איור 2: ניקוי נוהל של מיקרוסכמות Si. (א) שתי כוסות מלאות 40-60 מיליליטר של אצטון אתנול כל. (ב) שבבי Si ממוקמים הכוס מלאה עם אצטון. הצד עם קרום SiN צריך לפנות כלפי מעלה. ההשתקפות של שני שבבי Si מראה בבירור את החריץ על הישבן של שני שבבים. (ג) לאחר 2 דקות, שבבי Si מועברים הכוס השנייה, מלאת אתנול. לאחר 2 דקות אחרות, שבבי Si מועברים רקמות cleanroom לייבוש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מיקרופון הילוכי אלקטרוני זרימת נוזלroscopy (TEM) ציוד מחזיק. (א) בעל TEM זרימת נוזל עם צינורות פלסטיק מזרק עבור זרימת נוזל. (ב) הקצה בעל TEM זרימת הנוזל הוסר מן הפיר בעל, את מכסה תא נוזל התא, הטבעות האטימות, ושני שבבי סיליקון. הצינורות שבולטים מהצד השמאלי של הקצה. (C) תא נוזל התא מראה אחד O-Ring, החריץ עבור מיקום השבב האלקטרוני. (ד) פינצטה שונה על גבי משטח ללא אבק (רדיד אלומיניום). (E) המכסה של תא נוזל תא עם שתי הטבעות האטימות שלה. (F) שני שבבים סיליקון עם חלונות קרום SiN. משמאל: שבב מדגם ללא spacer; מימין: שבב כיסוי עם spacer 200 מיקרומטר. (G) מערכת משאבת microfluidic. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של figu זהמִחָדָשׁ.
1. הכנה של מיקרוסכמות
ניקוי 1. של שבבים
- הכן סביבת עבודה עם רמה נמוכה אבק במנדף זרימת אוויר למינרית עם מסנן חלקיקי אבק.
- נקה שקופיות זכוכית מיקרוסקופ אור עם רקמת סיבים בחינם אתנול טהור עבור מיקום ותחבורה של השבבים. מניחים את השקף זכוכית על רקמה cleanroom בצלחת פטרי.
הערה: הימנע משימוש אתנול טכני בכל העת. - בחר 5 שבבי בסיס (ללא spacer) עבור מיקום מדגם ו -5 שבבים עם spacer 200 ננומטר עבה.
הערה: מידות החלון הם 20 x 400 מיקרומטר 2 ואת עובי SiN הוא 50 ננומטר. מאז יש כמה סובלנות על מידות, מומלץ לבדוק את ממדי באמצעות מיקרוסקופ אור. - להשתמש בפינצטה מצופה פחמן להסיר שבבים מתיבת האחסון ומניח אותם בשקופית הזכוכית. תפוס את השבבים בחוזקה אך בזהירות על lo שלהםהצדדים ng. טפלו שבב כזה שהצד קרום SiN תמיד פונה מעלה.
הערה: אל תיגע הממברנה SiN שברירי בצד העליון. כמו כן להיזהר עם טיפול השבבים כדי למנוע פיצוח הקצוות החדים שלהם, אשר יכול לגרום לבעיות עקב חלקיקי סיליקון המתגוררים על השבב או דליפות מאוחר יותר.
הערה: הכשרה עבור ההליך להסרת השבבים מפני השטח הדביק יכולה להתבצע על (זולים) שבבי דמה. - מניח את השבבים לתוך ממחטת נייר cleanroom בצלחת פטרי. סגור את המנה ולהעביר אותו אל במנדף.
ההערה: השלבים המעורבים אצטון מבוצעים במנדף לבטיחות כימית. - קח שני 120 כוסות זכוכית מ"ל. לשטוף כוס אחת עם אצטון ושני עם אתנול לנקות אותם. מלאו את הראשון עם 40-60 מ"ל של אצטון והשני עם 40-60 מ"ל של אתנול.
הערה: חשוב להשתמש בנוזלי HPLC כיתה גם עבור שלב זה בפרוטוקול. - לְהַעֲבִירהשבבים לתוך הכוס עם אצטון כדי להסיר את המגן להתנגד שכבה. בעדינות להזיז את הכוס ביד לשטוף שבבים ביעילות, אבל להיזהר לא להפוך את השבבים במהופכים - ראה איור 2.
- לאחר 2 דקות, להסיר את השבבים ובמהירות ולהעביר אותם לתוך הכוס עם אתנול. בעדינות להזיז את הכוס ביד עם אתנול למשך 2 דקות כדי להסיר שאריות כל השכבה להתנגד. מכסים את הכוס בנייר אלומיניום ולהעביר אותו אל שולחן העבודה זרימת אוויר למינרית.
הערה: אל תתנו שבבים להתייבש במהלך ההעברה, כדי למנוע את בתצהיר של פסולת. - סור שבבים מהקנקן ומניח אותם על גבי רקמות cleanroom חדשות. תן להם להתייבש במשך כמה דקות ולהעביר את השבבים לשקופית זכוכית מיקרוסקופ האור בצלחת פטרי.
הערה: השבבים הרטובים יכולים בקלות להעיף סביב, מתהפכים, או לדבוק פינצטה כאשר ששוחררו. זה יכול להימנע על ידי פרהלשיר שבבי ברכות על נייר הסינון ומושך פינצטה משם בכיוון האופקי. - סגור את צלחת הפטר ולהעביר את השבבים השואבים הפלזמה.
- מניחים את השקף זכוכית עם שבבים לתוך שואב פלזמה. הפעלת תוכנית ניקוי 5 דקות כדי להבהיר את פני השטח של הידרופילי קרום סיליקון ניטריד להסיר פחמימנים.
הערה: הגדרות מתאים מועמדותן שואב פלזמה שלנו הם: 70 mTorr, זרימת הגז של 11.5 SCCM עבור O 2 ו- 35.0 SCCM עבור Ar, 50 תדר רדיו W קדימה (RF) היעד, 5 W RF טווח, ומקס משתקף RF. כל פלזמה מסוגלת גרימת מטען משטח מתאימה. - שים את שקופית הזכוכית עם השבב האלקטרוני בחזרה לתוך צלחת פטרי, לסגור את המכסה, ולהעביר אותו אל מיקרוסקופ האור.
- בדוק את השבבים תחת מיקרוסקופ אור עבור נקרע קרום אפשרי או חלקיקי לכלוך שנותרו. זהירות עם אזורי החלון לבדוק כתמים קטנים המציין arupture של הממברנה. בטל שבבים עם ממברנות פגומים.
- סגור את צלחת פטרי ולאחסן אותו שולחן העבודה זרימת אוויר למינרית.
2. הכנת המדגם על השבבים
- כן פתרון AuNP מימי (ציטראט התייצב) על ידי ערבוב כמויות קטנות של פתרונות המניות המכילים 30 ננומטר בקוטר, AuNPs מיוצב ציטראט בריכוז של ~ 3 מ '
- מניח את השבבים על משטח נקי, דביק בקופסא תחבורה להפקדת יישום אגל / מדגם.
- מניח טיפה (1-2 μL) של הפתרון המדגם בצד הממברנה חטא שבב הפלזמה הנקי (להשתמש שבב אלקטרוני ללא spacer) ולתת יבש פתרון שולחן עבודת זרימת האוויר למינרית.
הערה: הליך זה ניתן לחזור על מנת להגביר את הריכוז של AuNPs על הממברנה SiN. - החל 1 μL של מים ללא יונים אל שבב להסרת מלח ו / או פעילי שטח. לאחר 30 שניות, בזהירותלהסיר את אגל מים עם נייר סינון. תנו שבבים לייבוש האוויר שולחן העבודה זרימת אוויר למינרית.
הערה: מספר גדול מספיק של AuNPs יהיה דבק השבב ולא יהיה נשטף במים יותר. - השתמש שבבי המדגם המוכנים תוך 4 שעות, כחטא מאבד מאפייני השטח שניתנו הידרופילי שלה לאורך זמן, אשר עשוי לגרום לנוזל מתנהג באופן שונה במהלך ניסוי. הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים.
- השתמש בתיבת תחבורה סגורה לאחסון וההעברה של השבבים.
2. הכנת מחזיק TEM זרימת הנוזל
- ניקוי בעל TEM זרימת נוזל
- יש לנקות את כל הכלים (פינצטה בורג נהג) כי יהיו במגע עם חלקים ואקום באמצעות אצטון ואתנול באמבטיה קולית ומניחים אותם על פני השטח ללא אבק הניתנים על ידי פיסת נייר אלומיניום החדש להציב על ספסל העבודה. עבודה עם כפפותכדי למנוע זיהום של בעל TEM זרימת הנוזל.
הערה: הכלים לא צריכים לנקות נרחב אם אחד הוא בטוח שהם נקיים לעבודה עם חלקי ואקום. כפפות ניתן להימנע אם אחד המסוגל להתמודד הציוד בלי לגעת בחלקי הוואקום. - מניח את בעל TEM זרימת הנוזל תחת מיקרוסקופ האור המשקפת בצורה כזאת כי הקצה בעל המכיל את תא הנוזל ניתן לצפות. ראה איור 3.
- מסירים את המכסה של קצה בעל ומניחים אותו על משטח ללא אבק.
הערה: מכסה טיטניום הוא רגיש לשריטות נובעות מחומרים קשים כמו פינצטה. מומלץ להשתמש בפינצטה מצופה פולימר עבור חומרים רגישים. - הכן לפחות 1-2 מ"ל של מים טהורים (כיתה HPLC).
הערה: אם לא משתמש נוזל HPLC כיתה, אז מומלץ לבדוק כי הנוזלים המשמשים אינו מכיל חלקיקי המייקר שיכול להוביל קבקבים של מערכת הזרימה; filtאה הנוזל לפי הצורך עם מסנן מיקרו-נקבוביות. - השתמש מזרק זכוכית (1 מ"ל) כדי לרוקן את המערכת של הגיאות עם 0.5 מ"ל של מים טהורים. מומלץ להשתמש במערכת משאבת מזרק microfluidic. השתמש פיפטה ו / או מסנן נייר כדי להסיר את הנוזל שייפלט בתא נוזל התא. בדוק את כל הצינורות עבור זרימת נוזל. לייבש את קצה בעל מכן באמצעות נייר סינון ו / או טפטפת.
- השתמש במיקרוסקופ האור כדי לבדוק את הקצה של הבעל נקי ויבש. במידת צורך, לשטוף את הקצה של הבעל עם מים או אתנול כדי להסיר כל שאריות מוצקות שאולי שהותירו הפתרון היבש. הסר פיסות אבק או שאריות של סיבי גם כן. מוציאים בזהירות היצירות האלה עם פינצטה, ובכך להימנע מגרד את פני השטח טיטניום. בדוק גם בתוך חריצי O-Ring ולהסיר את השאריות של נוזל עם חתיכה קטנה של רקמת cleanroom.
הערה: אם הבעל אינו הופך להיות נקי עם הליך זה, אז מומלץכדי להסיר את קצה מבעל ולנקות אותו אצטון למשך 2 דקות ו באתנול במשך 2 דקות אחרות באמצעות באמבטיה קולית. - בדוק את כל חלקים נוספים של קצה (O- טבעות, מכסה, וברגים) תחת מיקרוסקופ אור ולהסיר אבק, סיבים, וכו '...
הערה: לפעמים, חתיכות קטנות שמקורם ברגים או שבבי Si חייבות יוסרו גם כן. במידת הצורך, לזמן קצר לנקות את החלקים ואקום עם אתנול HPLC כיתה. המכסה והברגים ניתן לנקות באמצעות אולטרסאונד, כפי שהוסברו על הטיפ. יש להימנע מנחת O- טבעות לעתים קרובות באתנול, מכיוון שהוא עלול להפוך את הטבעות האטימות שבירות לאורך זמן, צמצום אטים הוואקום שלהם. המערכת מופעלת ללא שומן ואקום, אבל אם בעיות איטום להתרחש, גריז ואקום ניתן להשתמש. - הכנס מחדש את טבעות אטם לתוך החריצים המתאימים של הבעל ולבדוק כי הם מתאימים ואינם בולטים על כל צד של החריץ.
- שמור בעל נוזל זרימת TEM ללא אבק עד טעינת המדגם (למשל., על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום).
- יש לנקות את כל הכלים (פינצטה בורג נהג) כי יהיו במגע עם חלקים ואקום באמצעות אצטון ואתנול באמבטיה קולית ומניחים אותם על פני השטח ללא אבק הניתנים על ידי פיסת נייר אלומיניום החדש להציב על ספסל העבודה. עבודה עם כפפותכדי למנוע זיהום של בעל TEM זרימת הנוזל.
- רכבת בעל TEM זרימת נוזל
הערה: ההליך הבא מתאר את הליך הטעינה של שבבים בבעל דגימה עם אורינטציה אופטימלית STEM. בתצורה זו, שבב הבסיס עם המדגם יהיה השבב האלקטרוני העליון העביר פעם לתוך המיקרוסקופ. ראה איור 4. עבור TEM, ברזולוציה מרחבית הגבוהה מתקבלת בתחתית התא הנוזלי ביחס קרן אלקטרונים מטה-נודדת. לפיכך, השבבים יהיו רכובים להיפך.- להשתמש בפינצטה מעוקל לתפוס את שבב המדגם בצד הארוך ומניח אותו בתוך החריץ (כיס) בקצה של בעל TEM זרימת הנוזל. שמור את הצד SiN כלפי מעלה. בדוק את המיקום הנכון של השבב בחריץ באמצעות מיקרוסקופ אור משקפת.
הערה: אם האטם מתחת השבב האלקטרוני אינו ממוקם כראוי, השבב עשוי לבלוט fROM החריץ. - מניח טיפה של 0.3 μL של הנוזל המסונן לניסוי על שבב המדגם באמצעות micropipette. במידת צורך, לתקן את השבב במקום עם פינצטה, ככוחות הנימים של רביב עשויים למשוך את השבב מהכיס שלו.
- להשתמש בפינצטה במהופך מעוקל לקחת את השבב השני (אחד עם שכבת spacer). הפוך בזהירות את השבב במהופך. מניחים את שבב spacer על שבב בסיס בחריץ.
הערה: הליך זה צריך להיעשות במהירות מספקת כדי למנוע את הייבוש של רביב על שבב המדגם. - בדוק את המיקום הנכון באמצעות מיקרוסקופ אור המשקפת תוך כדי תנועת פיסת חומר מחזיר אור מתחת לקצה של בעל הדגימה. השבבים שני חייבים להיות מתואמים מקבילים בדיוק כדי להשיג את החפיפה הטובה ביותר של חלונות SiN.
הערה: במקרה החלונות אינם חופפות, השבבים ניתן למקמו מחדש על ידי דחיפה בצד אחד עם קצהפינצטה, אבל למנוע את תנועת השבבים יותר מדי, כמו קרום SiN עלול להיפגע בקלות. שבבים מסוימים מגיעים עם תצורה חצתה (החלון של שבב אחד הוא בניצב לחלון בחדר השבב האלקטרוני האחר); תצורה זו מאפשרת את היישור של שני השבבים עדיין גם מקטינה את שדה הראיה של המיקרוסקופ האלקטרוני. - קח את הצד הקדמי של מכסה תא דגימה עם פינצטה ולהפוך אותו במהופך. מבלי לגעת השבבים, למקם את הצד האחורי של המכסה על הקצה. לאט לפתוח את פינצטה בצורה כזאת כי המכסה מוטל אך ורק על הענף התחתון של פינצטה. הורד בזהירות את המכסה עד שהיא נחה על שני השבבים. הסר פינצטה.
- בדוק שוב את היישור של חלון של שני השבבים. במידת הצורך, להסיר את המכסה, להתאים את המיקום של שבבים, ומקם את המכסה שוב.
- מניחים את הברגים ולתקן אותם במקומות הרגילים שלהם. בדוק את היישור של שני חלונות. אניf צורך, הסר את הברגים שוב ולהתאים את השבבים.
הערה: אין לתקן את הברגים חזק מדי, מאחר והדבר עלול לגרום נזק. חותם ואקום מושגת כאשר את הברגים רק להדק. - בדוק את האיטום על ידי ייזום זרימת נוזל דרך המערכת באמצעות קצב זרימה של 4 μL / דקה. אם לא דולף הוא ציין משני צדי הקצה, זוהי אינדיקציה טובה של אטימות הוואקום.
- מעבירים את בעל לתחנת משאבת ואקום ולבדוק את אטימות ואקום. רמת הוואקום צריכה להגיע לפחות ל 10 -5 mbar תוך 5 דקות של שאיבה.
הערה: מומלץ לבדוק את תחנת השאיבה עם בעל דמה לפני השימוש. - מעבירים את הפומית אל מיקרוסקופ אלקטרונים ב המתחם שלה כדי למנוע ממנה איסוף אבק.
הערה: כל בעל המסחרי מגיע עם מארז.
- להשתמש בפינצטה מעוקל לתפוס את שבב המדגם בצד הארוך ומניח אותו בתוך החריץ (כיס) בקצה של בעל TEM זרימת הנוזל. שמור את הצד SiN כלפי מעלה. בדוק את המיקום הנכון של השבב בחריץ באמצעות מיקרוסקופ אור משקפת.
STEM 3. של דגימה נוזלית
- התאמת מיקרוסקופ אלקטרונים עבור STEM הערה: הפעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים המתוארת פרוטוקול זה מבוסס על נהלים קבועים שניתן למצוא במדריך למשתמש. הפרוטוקול מתאר את הפירוט הנדרש מעבר נהלים קבועים לרכישת נתונים על דגימות נוזלות.
- הפעל את המיקרוסקופ עם במצב גזע מיושר. בשנת בעל הדגימה, כנס מדגם בדיקה מורכב סרט פחמן דק עם AuNPs. שנו את ההגדרות של המיקרוסקופ STEM כדלקמן: להגדיר את הנוכחי בדיקה ל -0.18 Na ואת חצי זווית ההתכנסות של אלומת אלקטרונים עד 20 mrad ידי בחירת גודל נקודה של 4C ואת הצמצם המטרה של 30 מיקרומטר. בחר אורך מצלמה 8 ס"מ.
- רשום לעצמך את צפיפות הזרם הצביעה נמדדי מסך הקרינה בעוד גלאי ADF מוכנסים. הסר את בעל הדגימה.
הערה: ערך נוכחי זה נחוץ מאוחר יותר על מנת להעריך את העובי של הנוזל. - הפעל את זרימת הנוזל עם מים טהורים. אין לעבור זרימה של 2μL / דקה.
- הכנס את מחזיק TEM זרימת הנוזל במיקרוסקופ אלקטרונים ולהתחיל פינוי. בדוק הוא ואקום האינדיקציה של חדר prevacuum ואת משך הפינוי. אם רמת הוואקום היא סטנדרטית ואת משך הליך השאיבה אינו עולה על זמן פינוי הרגיל (של כ 1 דק ') בפקטור של השני, הכנס את המחזיק.
- פתח את השסתום הקורה כאשר הוואקום של החדר המדגם העיקרי הוא בטווח המאפשר פתיחתו. הכנס את גלאי ADF ידי לחיצה על כפתור ה- ADF.
הערה: פרוטוקול זה מתייחס גלאי ADF ממוקמים מעל המסך זרחן של מיקרוסקופ האלקטרונים. - הגדר את המיקרוסקופ במצב רכישת התמונה רציפה באמצעות בגודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים, להתעכב זמן פיקסל של 2 מיקרו-שניות, וכן הגדלה של 20,000. חפש את חלון SiN ידי תרגום הבמה x ו- y כיוונים.
הערה: השבבים לחסום כל אלקטרונים העוברים דרך המדגם כלפי לזהותאוֹ; האות גלויה רק במיקום של החטא. ראה איור 5. לפעמים, קל יותר למצוא את חלון SiN על ידי הצגת מסך פלואורסצנטי. - ברגע שהחלון כבר נמצא, להתאים את הגדרות הניגודיות והבהירות (באמצעות ידיות בהתאמה) כך שהקצה של החלון הופך לגלוי. הזז את הקצה לקראת אמצע שדה הראייה על ידי לחיצה על כפתורי x ו- y-תרגום של במת הדגימה. לחץ על לחצן האיפוס של העדשה האובייקטיבית.
הערה: הבהירות חייבת להיות מופחתת במידה רבה לעומת מדגם ואקום על חשבון פיזור חזק בנוזל. - המשך על ידי התמקדות גסה בפינה החדה בקצה חלון SiN ידי התאמת המיקום האנכי (z-התרגום) של שלב הדגימה. ודא כי עמדת המדגם הוא בשיא eucentric על ידי החלפה של שלב ב -5 ° וסיבוב אותו בחזרה. תכונות של המדגם בפינת חלון SiN לא צריכות להסיט בהגדלות נמוכות.
- כוונו את המיקום האנכי לפי הצורך למקם את קצה החלון באמצע אזור התצוגה שוב. אחסן את המיקום של הבמה באמצעות הלחצן החנות של התוכנה.
- מעבר למצב שבו חתיכות קטנות של פסולת או אובייקטים אחרים של ניגודיות גבוהה (למשל, AuNPs) נוכחים ידי תרגום הבמה x ו- y כיוונים. התאם את המיקוד של עדשה האובייקטיבית, כך שכל האובייקטים מופיעים חדים בפוקוס.
- רשום לעצמך את צפיפות זרם נמדדי מסך זרחן הגלוי באמצעות תוכנת ההפעלה, המציינת את הזרם המועבר דרך מחזיק נוזלים דרך הפתח של גלאי ADF. לחשב את העובי של נוזל התא באמצעות משוואת 1. המשך רק אם עובי הנוזל נקבע ואינו עולה על 3 מיקרומטר.
14
משוואה 1
עם לא חטא בעובי של מים הממברנה t ניטריד סיליקון אמורפי את עובי שכבת המים. הנתיב החופשי הממוצע אורכי סכום SiN l = 0.79 מיקרומטר חטא, = ומי l = 3.0 מיקרומטר של מים עבור גלאי פתיחת חץ זווית של 35 mrad 14. - אנא קראו בעיון את הנוזלים בהגדלות נמוכות על מנת להבטיח כי בועות גז אינן נוכחות. בועות גז ניתן למנוע באמצעות זרימת נוזל רציפה לחקור הנוכחי נמוך מ 0. 5 Na.
- תרגום הבמה x ו- y כיוונים עד שטח המכיל לפחות 20 AuNPs חההים נמצא. הגדר את גודל התמונה 1,024 x 1,024 פיקסלים, להתעכב זמן פיקסל ל -19 מיקרו-שניות, ואת ההגדלה ל -400,000. לרכוש תמונות של AuNPs דבקה הממברנה SiN ידי לחיצה על כפתור הרכישה.
הערה: לאחר תמונות התקבלו שבו AuNPs גלוי עם ניגודיות חזקה קצוות חדים (ראה איור 6), אחד יכול להיות בטוח כי הניסוי הוגדר כראוי. במקרה בעיות לא צפויות להתרחש, לא להמשיך בניסוי אך הקפד לפתור את הגורם.
- STEM של פירוק AuNPs
- הסר את מחזיק TEM זרימת הנוזל מן מיקרוסקופ ולהפסיק את זרימת הנוזל.
- הכן לפחות 1 מ"ל של תמיסה של 0.1 M של נתרן כלורי במים HPLC כיתה ב מזרק זכוכית.
- התאם את מערכת זרימת מהירות של 20 μL / דקה ולשטוף את מערכת הזרימה השלמה עם 0.3 מיליליטר של תמיסת המלח. השתמש בנייר מסנן לאסוף את הנוזל שייפלט עלהקצה השני של הצינור. לאחר מכן, להתאים מחדש את מערכת הזרימה 2 μL / דקה.
- בדוק את השלמות של חלון SiN באמצעות מיקרוסקופ אור משקפת. אם אין דליפה הוא ציין, הכנס שוב את בעל TEM זרימת הנוזל לתוך המיקרוסקופ.
- בדוק את אינדיקציה ואקום של החדר מראש ואקום משך הפינוי. אם רמת הוואקום היא סטנדרטית ואת משך הליך השאיבה אינו עולה על זמן פינוי הרגיל (של כ 1 דק ') בפקטור של השני, הכנס את מחזיק
- הזז את מאחורי הקלעים של המיקרוסקופ בחזרה למצב הקודם שלה באמצעות עמדת הבמה המאוחסנת. הגדר את המיקרוסקופ במצב רכישת התמונה רציפה באמצעות בגודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים, להתעכב זמן פיקסל של 2 מיקרו-שניות, וכן הגדלה של 20,000X. כוון את הניגודיות, בהירות, מיקוד, וגובה eucentric, כמתואר בשלבים 3.1.7-3.1.9.
- מצא מיקום עניין ידי תרגום הבמה x ו- y כיוונים. הגדר את גודל התמונה1,024 x 1,024 פיקסלים, להתעכב זמן פיקסל 2 מיקרו-שניות, ואת ההגדלה ל -500,000. קלט סדרה של תמונות גזע על ידי לחיצה על כפתור הרכישה באופן ידני פעם את התמונה הקודמת נרשמה.
הערה: AuNPs להתחיל לפזר בהקדם אלומת האלקטרונים נסרקה על המדגם. חלקיקים מחוץ לאזור המוקרן אינם מושפעים ניתן להבחין מייד אחרי. חותמת הזמן מאוחסנת בכותרת התמונה. כמו כן ניתן להשתמש בתוכנה לאיסוף אוטומטי של סדרת תמונות לסרט.
- פירוק וניקוי בעל TEM לאחר הניסוי
- כאשר ניסויי TEM הנוזלים פאזיים הושלמו ובעל הוא חזר בו מן מיקרוסקופ האלקטרונים, לנקות את הצינורות, התא הנוזל, ומרכיביו על מנת להסיר כל חלקיקים מוצקים או מלח שנותר שעשויה להשפיע בניסויים עתידיים.
- שחרר את הבורג האחורי מעט כך שהוא עדיין קבועבחריץ שלו אך ניתן להסירו בקלות את המכסה. שחרר את הבורג הקדמי, להסיר אותו, ולמקם אותו בסביבה ללא אבק.
- מסירים את המכסה ומניחים אותו בסביבה ללא אבק לאחסון.
- הסר את שני שבבים מהכיס. להפריד ביניהם על ידי טבילה אותם בקפידה במים או בתמיסה הנותרת של הניסוי. מניח את השבבים על נייר עם צד קרום SiN כלפי מעלה ולתת להם להתייבש באוויר לניתוח נוסף.
- הסר את הטבעות האטימות ולנקות את החריצים בהתאמה עם מי HPLC כיתה. אחסן את טבעות O בסביבה ללא אבק.
- השתמש מזרק זכוכית (5 מ"ל) כדי לשטוף את כל צינורות (קלט ופלט), כל אחד עם 5 מ"ל מים HPLC כיתה. אסוף את הנוזל עם כוס קטנה שהונחה מתחת לקצה בעל TEM. לאחר השטיפה, להשתמש פיפטה ו / או מסנן נייר כדי להסיר את הנוזל הנותר מן ותא הנוזלים.
- בדוק את קצה בעל TEM ולהסיר שאריות כמו הקצוות השבורים של מיקרו סיליקוןצ 'יפס, סיבים, או אבק. אם המלח עדיין גלוי, חזור על תהליך הניקוי. החזר את טבעות O כדי חריציהן.
- אחסן את בעל TEM ומרכיביו בסביבה ללא אבק.
- חלופה נוהל 3.2: STEM של העברת חלקיקי זהב
הערה: הליך בתצורות שונות נדרש ללמוד את התנועה של AuNPs בנוזל.- השמט בשלב 1.2. טען את AuNPs על שבב סיליקון מייד לפני ההכנסה אותם מחזיק TEM בשלב 2.2. שמור על המדגם מכוסה בשכבה נוזלית בכל העת על מנת למנוע התקשרות חזקה של AuNPs קרום SiN. יתר השלבים של הפרוטוקול זהים. סדרה של תמונות STEM מתקבלת בשלב 3.2.6.
משוואה 1 
איור 4: רכבת מחזיק TEM זרימת הנוזל. (א) תא נוזל התא עם הדואר אטם קטן להציב החריץ שלה. מראה הבלעה להציג את הדף. (ב) שבב הבסיס מושם בשקע בהתאמה. מראה הבלעת מבט מהצד בזווית כזו כי השבב גלוי מן השתקפות אור. (CD) טיפת הפתרון מתווספת השבב האלקטרוני. (EG) המיקום של שבב כיסוי. (HI) מיקום של מכסה תא נוזל התא. (J) קיבוע של המכסה עם שני ברגים. (K) מורכב בעל TEM זרימת נוזל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: מיקום ראשוני והתמקדות באמצעות micrographs STEM. (א) כדי לאתר את חלון SiN, הבמה נעה לעבר sig המבריקיםסופי. שבב סיליקון הוא רזה מספיק כמה אלקטרונים לעבור קרוב לחלון. (ב) קצה חלון SiN הממוקד מראה כמה AuNPs המופיע בהיר על חלון קרום SiN הכהה (פחות פיזור). הקצה של השבב בהיר בשל פיזור מוגזם. (C) התמקדות נעשה בפינת החלון SiN. התמונות מראות תחת ממוקדות, בפוקוס, ושוב ממוקד מצבים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Representative Results
בעל TEM זרימת הנוזל שמש ללמוד את ההתנהגות של AuNPs בנוזל. AuNPs היו משותקים ביציבות על הממברנה SiN במים טהורים הם צילמו עם רזולוציה ננו באמצעות נוזל פאזיים STEM (איור 6). ניגודיות מעולה הושגה על זהב הפיזור מאוד. הצפיפות הנוכחית במסך פוספור נמדד למדגם מבחן יבש הייתה 20 PA / cm², בזמן שהוא הסתכם 8 PA / cm² עם בעל TEM זרימת הנוזל המוכנס. באמצעות משוואה 1, מי t = 2.4 ± 0.5 מיקרומטר, הרבה יותר גדולה ממה שציפה מבוסס על עובי spacer של 200 ננומטר. אף על פי כן, עובי הוא לא גדול מדי עבור הדמיה של AuNPs עם רזולוציה מרחבית ננומטרי. עובי הנוזל היה עבה יותר ננומטר 200 שקבע spacer בשל בולטות של ממברנות SiN, הלא השטיחות של השבבים, ופסולה המתגוררת על השבבים.
ther.within-page = "1"> לקבלת מים טהורים, AuNPs לשמור על הצורה שלהם במהלך ההדמיה 16, אם כי מוצרים radiolysis תגובתי (ה - א.ק., H •, H +, OH •) שמקורן האינטראקציה של אלומת אלקטרונים עם מים עלולים לחמצן אטום זהב יחיד, שיביא לשינוי של צורת AuNPs 15. עם זאת, כאשר מערכת זרימת הנוזל שמשה להציג יוני כלוריד בניסוי שני, את היציבות של AuNPs השתנתה. יוני כלוריד מסוגל ייצוב אטום זהב חמצון בצורת tetrachloroaureat, AuCl 4 -. איור 7 מראה כי AuNPs מומס לאט במהלך סדרת זמן לשגות הדמיה STEM, בדומה לתוצאות שדווח קודם לכן 16. לבירור קצב במינון אלקטרונים משומש, זה לקח ~ 300 ים לפזר את 30 AuNPs ננומטר בגודל.
התנועות של AuNPs ב wate r נחקר בניסוי שלישי (איור 8). לפני הניסוי, בעל TEM זרימת הנוזל נוקה על מנת להסיר כל עקבות של מלח. בשונה מן הניסוי הראשון, גישת הכנת מדגם חלופי שמשה להשיג מצורפת החלשות AuNPs קרום SiN 14. בניסוי זה, הפתרון AuNP הונח על שבב סיליקון התאספו בעל TEM זרימת נוזל בלי לתת פתרון להתייבש. בדרך זו, את AuNPs בקלות מנותק מן הקרום SiN על הדמיה בשיעור המינון בשימוש. חלק AuNPs התרחק שדה הראייה אל הפתרונות בתפזורת, בעוד AuNPs הנותרים נשארו בתוך שדה הראייה בסמיכות לחלון SiN. תנועות של AuNPs אלה נצפו, ובסופו של דבר הם מגובבים. לאחר זמן מה, agglomerates אלה מנותקים גם מן הקרום SiN ועזב את שדה הראיה ואת לתוך התמיסה.
ntent "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 6: מיקרוסקופיה סריקת ההילוכים אלקטרונים (STEM) מיקרוסקופ של AuNPs 30 ננומטר קוטר על גבי שכבת מים טהורה. התמונה המוצגת היא של אזור נבחר את התמונה המקורית. גודל התמונה היה 1,024 x 1,024 פיקסלים, להתעכב זמן פיקסל היה 19 מיקרו-שניות, גודל פיקסל היה 0.73 ננומטר, ואת ההגדלה היתה 400,000X. המינון שהאלקטרון ובכך 7.1 x 10 4 דואר - / nm². הצפיפות הנוכחית נמדדה על מסך זרחן הייתה 8 PA / 2 סנטימטר, כך עובי הנוזל חושב להסתכם 2.4 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: סדרת זמן לשגותשל STEM micrographs של AuNPs מלוחים. (AD) תמונות שחולצו מן הסדרה זמן לשגות של תמונות STEM ב 30 מרווחי ים. AuNPs לפזר בהדרגה בנוזל כתוצאה של נוכחות של יוני כלוריד. השעה להתעכב פיקסל היה 2 מיקרו-שניות, את מסגרת הזמן של הסדרה זמן לשגות היה 1.75 s, גודל פיקסל היה 0.44 ננומטר, ואת ההגדלה היתה 500,000X. המינון אלקטרונים לכל תמונה היה 1.2 x 10 4 דואר - / nm². עובי הנוזל היה 2.4 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8: גבעול מיקרוסקופ של AuNPs העברת מים טהורים. (א) קרום SiN עם AuNPs, מתוכם כמה נבחרות עם החצים. (ב) מסלולים Motionשל AuNPs הנבחר (ראה א). AuNPs חלק להתרחק שדה הראייה בזמן הדמיה. AuNPs הנותר להעביר רוחבי לאורך הממברנה SiN ולהתחיל פרור לגושים. בהגיעם לגודל אשכול קריטי, הם לשגר מן הקרום להתרחק מתחום להתעכב זמן פיקסל view.The היה 1 מיקרו-שניות, הזמן מסגרת היה 0.52 s, גודל פיקסל היה 1.8 ננומטר, ואת ההגדלה היתה 120,000X. המינון אלקטרונים לכל תמונה היה 3.5 x 10 2 דואר - / nm² ואת עובי הנוזל היה 2.4 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
הפרוטוקול המתואר מאפשר STEM של AuNPs בנוזל, כולל תצפית של תהליכים דינמיים. ההרכבה של הבעל היא טכניקה קלה-כדי-ללמוד. עם זאת, כמה היבטים יש לקחת בחשבון כאשר עובדים עם בעל TEM זרימת הנוזל. לדוגמא, קצוות שבורים של שבב סי או חלקיקים גדולים על טבעות האטם עלולים לגרום דליפה של נוזל התא. מצד השני, חלקיקים גדולים (> 200 ננומטר; למשל, אבק או פסולת Si) על הממברנה SiN עלול לגרום עובי מוגבר של נוזל התא, מה שמוביל ניגוד הדמיה נמוך או לרזולוציה מרחבית נמוכה ואף עלול לגרום חלונות SiN לשבור. חשוב לציין, שאריות של מלח או חומרים כימיים אחרים עשויות להשפיע על תוצאות הניסויים בצורה בלתי רצויה. לכן, חשוב כי את השלבים השונים של הכנת מדגם והרכבה בעל מבוצעים בזהירות בסביבה נקיה ונטול אבק.
העובי של ce הנוזליll קובעת החלטת השגה, כמו גם את החדות של התמונות המתקבלות 17. עובי זה יכול להיות מותאם באמצעות מפרידים ממוקמים על אחד משני שבבי Si. בהתאם לממדי של המדגם, בעוביים שונים של נוזל התא יכול להתממש. לצורך המחקר של AuNPs, אפשר להשתמש מפרידים קטנים (200-500 ננומטר), בעוד תאי איקריוטיים כולו צריכים מפריד גדול של עד 5 מיקרומטר. העובי של נוזל התא מושפע יותר על ידי המתנפחות של חלונות קרום SiN נובעי פרש הלחצים בין נוזל התא ואת הוואקום שמסביב. אפקט זה הופך בולט יותר עם חלונות קרום SiN גדולות. לפיכך, על מנת למזער את העובי של נוזל התא, מומלץ להשתמש בחלונות קרום SiN קטנים. במקרה זה קשה למצוא חפיפה בין שני חלונות קטנים, הם ניתנים להרכבה בתצורה חצתה באמצעות שבב אלקטרוני בסיס שונה. larg תצורות חלופיותאיליי למנוע בולטות מורכבת של חלונות שבב 18 או קרום מונוליטי נתמך על ידי עמודים 19, אבל אלה חסרונות תערוכה לגבי טעינת מדגם. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הטכנולוגיה הנוכחית הוא חוסר שליטה מדויקת עובי הנוזל. לעתים קרובות, הנוזל הוא הרבה יותר עבה ממה צפוי מן ממדי spacer בשימוש, כפי שראה כאן. מספר קבוצות השתמשו בתאי נוזלי סגורים 4, 20, 21, 22; יש מערכות אלה כמה יתרונות לגבי רזולוציה מרחבית, כמו עובי הנוזל יכול להיות מופחת על ידי גרימת בועה בנוזל. לחלופין, חלונות SiN ניתן לכפות לקרוס, שמובילים שכבת נוזל דלילה. שלישית, המתחם של חלונות מדלל אחרים קיים (למשל, גרפן) 23, גם וכתוצאה מכך הרבה נוזלים מדלליםממה אפשרי עם המערכה המתוארת בפרוטוקול זה. עם זאת, אי אפשר לזרום נוזל במערכות אלה.
באשר כל טכניקה מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, מספר ההיבטים הניסיונות יש לקחת בחשבון. ההיבט החשוב ביותר הוא האינטראקציה של אלומת אלקטרונים עם הנוזל או המדגם. בנוסף לניזקי קרינה, אשר מגביל את הרזולוציה המרחבית השגה עבור דגימות רבות מוצקות 24, דגימות הנוזל מושפעות גם על ידי מוצרי radiolysis שנוצר אלומת אלקטרונים 15, 25. מאז מוצרים אלה עשויים להשפיע על הניסוי, נתונים לפרשנות זהירים ותכנון ניסויים חיוניים 26. הגדרות מיקרוסקופ צריכות להיבחר על פי היעדים של מחקר מסוים. STEM ADF חזק יותר עבור חלקיקי הדמיה של מספר אטומי גבוה (Z) בעוביים גדולים של נוזל התא, WHIle TEM נותן לעומת זאת טוב יותר על חומרים נמוך-Z הוא בדרך כלל מהר יותר אבל דורש שכבות נוזל דלילות 3. במקום להשתמש בגלאי ADF, מוארת שדה (BF) גלאי משמש לעתים כדי שזה יקלוט את נוזל התא, מאז STEM BF הוא יתרון עבור הדמיה חומרים נמוך Z בשכבות עבות 27. עם הגדלת עובי של נוזל התא, יותר הנוכחית היא זקוקה. עם זאת, זה גם מעלה את ריכוזי מוצרים radiolysis ומגביר נזקי הקרינה. ראוי גם לציין כי היפוך של ניגוד הוא ציין גלאי ADF לנוזלים עבים מאוד (> 10 מיקרומטר עבור מים).
התנאים הנוזלים שונו בין הניסויים שלנו על ידי הסרת בעל המיקרוסקופ וההחלפה הן מדגם הנוזל. בנוסף לשינוי ריכוז המלח, זה בקלות ניתן לשנות מאפיינים אחרים של הנוזל על ידי זורם נוזלים שונים (למשל, האם מותרמשתמשים בפתרונות חיץ כדי להגדיר pH ספציפי 16 או עשוי להציג פתרונות אורגניים או תוספים אחרים). כמו כן ניתן לשנות את הנוזל תוך המחזיק עדיין מוכנס המיקרוסקופ ידי זורם נוזלים דרך מערכת microfluidic. עם זאת, במקרה זה, לא ידוע באיזו שעה להצביע הנוזל על השינויים המדגמים. כמו כן ראוי לציין כי שבבים התומכים אלקטרודות זמינים, כך ניסויי אלקטרוכימיה ננו יכולים להתבצע 28.
האובייקטים של מחקר אינם מוגבלים AuNPs במים, אלא מגוון רחב של דגימות ניתן ללמוד באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, כולל סיליקה, טיטניום אוקסיד, ופולימרים. אם תנועות של האובייקטים הם מהר מדי כדי ללכוד בתמונה בתוך הרכישה, ניתן להפחית את הצמיגות ידי סדר גודל באמצעות תערובת של גליצרול 50% ו -50% מים.
מתוך נקודות הנ"ל,מספר יתרונות, אפשרויות, וגם החסרונות לעין. כשעובד עם STEM נוזל פאזיים, החסרונות החשובים ביותר שיש לשקול הם כי: 1) כל ניסוי מושפע האינטראקציה הדינמית של אלומת האלקטרונים עם הדגימה כולו (האובייקט תחת השגחה, הנוזל, ואת קרומי SiN); 2) טיפול מדגם הוא מייגע, וזה לעתים קרובות קשה להשיג שכבת נוזל דקה כי המדגם או השבבים להכיל כמה חלקיקים מיקרומטר בגודל; 3) עובי הנוזל בדרך כלל שונה במידה רבה מן העובי המיועד שקבע spacer; ו -4) רזולוציה וחדות מרחבית תלויה מאוד על עובי הנוזל ואת ההבדל בין צפיפות השינוי של האובייקט תחת השגחה ואת הנוזלים.
נכון להיום, שיטות בשפע קיימים עבור מיקרוסקופיה של אובייקטים בתוך נוזל עם רזולוציה מרחבית ננומטרי. במיקרוסקופ אלקטרונים בקרח אמורפי היא טכניקה רבת עוצמה 29,אבל הפרוצדורות המעורבות הן עדינות, לא כל הניסויים לאפשר הכנת המדגם בקרח, וניסויי זמן נפתר הם בלתי אפשריים. קרן ה- X מיקרוסקופיה 30, 31 יכולה עקרונית לשמש, אבל זה בעל רזולוציה מרחבית מוגבלת ואינו זמין נרחב במעבדות. מיקרוסקופ כוח אטומי בנוזל כבר נקבע אך הוא טכניקת משטח 32 בלבד, 33, 34, 35. במיקרוסקופ אור אינה מראה רזולוציה מרחבית מספיק. בשלב הנוכחי, מיקרוסקופית אלקטרונים בנוזל נראה את הטכניקה החזקה ביותר עבור מיקרוסקופיה ישירה של אובייקטים ננו ותהליכים בנוזל.
TEM גזע פאזיים נוזלים עדיין אינו שיטות אנליטיות שיגרתיות, אך עדיין מתפתח. מספר פרמטרים לקחת בחשבון הוא ניכר, וזה often קשה לשחזר את תוצאות הניסוי. יתר על כן, נתונים כמותיים קשה להשיג בגלל ההשפעות תחת חקירה שלובים התהליכים המתרחשים כתוצאה של אלומת אלקטרונים. הפרוטוקול המתואר כאן שואף ליצור אחידות פרוטוקול הניסוי, ובכך בדיווח על כל היבטי הבסיס הרלוונטיים של הניסוי. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יוביל שחזור טוב יותר של עבודה ניסויית בתחום מתפתח זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
| Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
| Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
| Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
| Chemicals | |||
| Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| Materials | |||
| Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
| Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
| (Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
| Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |
References
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
- Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
- Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
- de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
- Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
- Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
- Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
- Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
- Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
- Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
- Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346 (2004).
- Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
- Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
- Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
- Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
- Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
- Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
- Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
- Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).
