Summary
우리는 녹색 형광 단백질과 루시 페라 제 기자를 발현하는 렌티 바이러스 입자 환자 유래의 이종 이식 (PDXs)의 안정적인 표시하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주 사이트 PDXs의 성장을 추적뿐만 아니라, 생체 내 이미징 시스템에서 사용 자발 실험 전이 검출을 허용한다.
Introduction
외과 적 절제 종양 샘플은 직접 면역 감염된 마우스에 접목되어 환자 유래의 종양 이종 이식 (PDXs)의 개발, 표준 셀 라인 이종 이식 모델에 비해 여러 가지 장점을 제공하며, 암 연구 1,2-에서 큰 진보를 나타낸다. PDXs 유지하고 제 1 통로에서 성장한 종양의 유전 적 및 생물학적 특성에 최소한의 변경으로 연속적인 통로로 확장 될 수있다; 보다 정확하게 인간 암세포 유래의 이종 3-8보다 종양 이질성을 반영한다. 이 모델은 현재 광범위하게 신약 개발 6,11의 전임상 플랫폼으로 암 생물학 4,12 연구를위한 실험 도구로, 암 치료제 9,10 개인화을위한 플랫폼으로 사용된다.
대부분의 PDXs는 이식 및 실행 가능하게 캘리퍼스를 사용하여 시간이 지남에 따라 종양의 성장을 측정 할 수있는 피하 전파됩니다. 하나전이성 질환은 PDXs를 사용하여 모델링하는 것이 더 어렵다. 특히 유방암, 다른 장기로 전이 용량 이종는 3,5,13 설명되었지만, 전이성 사이트 자발 보급의 빈도는 매우 낮다. 보고 된 경우, 전이성 부담의 식별 및 정량은 사후 표적 기관의 힘든 조직 학적 검사에 의존하고있다. 생물 발광 (루시퍼 라제, 배낭) 또는 형광을 발현하는 암세포는 (녹색 형광 단백질 GFP) 유전자 리포터는 일반적으로 뇌, 폐, 뼈, 간 심내 후 꼬리 정맥 intrafemoral 비장 주입 유방암 전이 실험 모델에서 사용 14-16. 이 모델은 기본 종양에서 보급을 우회하는 동안, 그들은 장기 친 화성 및 전이성 식민지의 메커니즘을 연구 할 가치가있다. 그러나, 기본 환자 종양 및 PDXs에서 파생 된 세포는 낮은 형질 전환 또는 전달 속도 날기를 가질 수있다g 표준 절차. 하나의 대안은 종래의 조직 배양 프로토콜을 사용하여 표시 할 수 체외 (17)에 PDX 유래 세포주를 확립하는 것이다. 이 방법은 그러나, 세포주 유도가 어렵고, 세포의 표현형을 변경할 수있는 가장 PDXs를 라벨에 적합하지 않다. 여기에서 우리는 생체 내 이미징에 적합한 렌티 바이러스 벡터와 PDX-해리 종양 세포의 전달을위한 프로토콜을 제시한다. 또, 면역 쥐에서 해리 루크-GFP 표지 PDX 세포의 심장 내 주사를 사용하여 실험 전이를 설명한다.
리포터 유전자를 발현하는 렌티 바이러스 PDX-해리 organoids의 전달을위한 기본 프로토콜은 이전에 18을 설명 하였다. 현재의 프로토콜에서는 인간 종양 세포에 대한 농축 및 100 % 전달 효율 근처 얻을뿐만 아니라 실험 유방암 검출 용 표지 PDXs 사용하기위한 추가의 방법을 설명전이. 이 프로토콜은 여러 암 다양한 발광 및 형광 마커 PDXs의 종류뿐만 아니라 유전자 발현 (관심의 유전자 즉, shRNA를 최저)의 변조를 라벨에 대해 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 동물의 사용을 필요로하는 모든 단계는 콜로라도 동물 연구 윤리위원회의 대학 (IACUC)의 지침을 따릅니다.
악기, 문화 미디어 및 기타 시약 1. 준비
- (1 : 1), 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF를 20 NG / ㎖), 표피 성장 인자 (EGF, 10 NG / ㎖ 조제 100 ㎖의 둘 베코 변형 이글 매체 및 한의 F-12 배지 (DMEM / F12)를 포함하는 미디어 mammosphere ) 헤파린 (4 μg의 / ㎖), 1X B27, 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖). 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 무균 조건에서 미디어와 저장소를 확인합니다.
- PBS pH를 7.2, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 2 mM의 EDTA를 함유하는 상피 농축 완충액 (EEB)을 준비한다. 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
- 달 동안 -20 ° C에서 멸균 15 ML 원뿔 튜브 및 저장소에 소화 버퍼 5 ml의 분취 량을 확인합니다. 종양 소화, 해동 소화 버퍼 전날 밤에 (500 밀리그램 당 5 ml의4 ° C에서 얼음에 종양). 사용하기 전에 1 배 항생제 항진균제 믹스를 추가합니다.
- 오토 클레이브 (121 ° C 30 분) PDXs의 해부에 대한 적어도 두 개의 집게, 메스와 가위.
- F12 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 함유 DMEM 500 ml의 세척 완충액을 만든다. 달 동안 4 ° C에서 보관하십시오. 나누어지는 종양 당 10 ml의 종양 절제술의 날.
- 멸균 4 μg의 / μL에서 폴리 브렌 주식을 준비합니다. -20 ℃에서 100 μl를 각각의 저장을 포함하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 분취 필터.
추적 가능한 마커를 들고 높은 역가 렌티 바이러스 입자의 2 세대
- 18, 19 (종양 성장의 생체 내 추적 즉., GFP와 루크)를 구입 또는 리포터 유전자를 운반하는 높은 역가 렌티 바이러스 입자를 생성합니다.
참고 :의 렌티 바이러스 역가> 10 8 TU / ㎖ (밀리리터 당 전달 단위) PDXs 성공적으로 전달하는 것이 좋습니다. 렌티 바이러스 피기사는 포유 동물 세포의 다양한 형질 도입을 허용 소낭 구내염 바이러스 (VSV-G)에서 엔벨로프 당 단백질 G와 pseudotyped해야한다.
참고 : 높은 역가 렌티 바이러스 입자의 생성 및 적정 여기에 사용되는 프로토콜에서 확인할 수있다 www.kottonlab.com . 이 프로토콜에 사용되는 벡터는 pSIH1-H1-copGFP-T2A-순수하지 않아 및 듀얼 프로모터 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W입니다. 이 벡터는 파지 - EF1aL-을 DsRed-UBC-GFP-W 벡터 EF1aL 프로모터 하류의 루시퍼 라제 유전자, 대럴 Kotton, 보스턴 대학의 종류의 선물을 DsRed을 대체하여 생성되었습니다.
환자 유래의 이종 이식의 3 세대
- 면역 생쥐 3,4의 유방 지방 패드에 기본 또는 전이성 유방암 종양을 주입하여 유방암 환자 유래의 이종 이식 (PDX)를 생성합니다. 큰 종양이 난만큼 1cm 직경의 최대 권장 크기로 종양을 생성ikely 괴사 코어를 포함한다.
참고 :. 이종 이식을 수립하고 이식에 대한 자세한 방법은 드로즈 등 18에 설명되어 있습니다. > 1cm 직경의 종양에 설립-이식 가능한 PDXs의 성장 면역 NOD에 주입 후 4, 24 주 정도 소요 / SCID / ILIIrg - / - (NSG), 고유 종양의 성장 속도에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 유방암 PDXs의 전달을 설명하지만, 이는 시험 관내 통로 단기에 적합한 모든 종양 바이러스 형질 도입을 위해 사용될 수있다. 단기에 PDXs의 민감도 - 체외 생존 (24 96 시간)은 각 종양에 고유하고 실험적으로 결정되어야한다.
PDX-유도 된 종양 세포의 4. 종양의 해부와 해리
- CO에게 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 사용하여 PDX를 들고 안락사 마우스 (동물 연구 윤리위원회의 제도적 지침을 따르십시오). 0.2 % 장에 쥐 잠수함1 분 lorhexidine 솔루션입니다. 해부 보드의 상단에 부정사 위치에 마우스를 설정하고 보드에 확장 된 상부 및 하부 사지를 해결하기 위해 핀을 사용합니다.
- 무균 기술을 사용하여, 종양 주변의 피부를 잘라 메스를 사용한다. 집게의 세트로 피부를 당겨 종양이 완전히 노출 될 때까지 깨끗한 메스를 사용하여 종양에서 분리. 집게와 메스의 깨끗한 세트를 사용하여 종양을 제거하고 얼음에 미디어를 씻어 5ml에 배치합니다.
- 추가 처리를위한 BLS2 캐비닛에 해부 종양을 가져 가라. 두 번, 용지를 제거하고 10 mM의 헤 페스 (HBSS / 헤 페스)로 수정 된 행크의 균형 소금 나트륨 10 ㎖로 종양을 씻어.
- 멸균 미리 무게 60cm 조직 배양 접시에 종양을 삭제합니다. 종양 덩어리를 추정 종양을 포함하는 플레이트를 단다.
- 메스를 사용하여, 다음, 반으로 종양을 잘라 절반에서 3mm 디스크를 절단하고 24 시간 동안 10 % 포르말린 용기에 넣습니다. 의 이질성을 확인하기 위해이 조직을 사용하여종양 샘플 (부모 PDX). 그리고 집게 깨끗한 메스를 사용하여 가능한 가장 작은 조각에 남아있는 종양을 말하다 (건조하기 위해 조직을 방지하기에 충분) HBSS / 헤 페스의 200 μl를 추가합니다.
- 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 다진 종양을 전송합니다. 종양의 100 밀리그램 당 1 배 항진균제 항생제 함유 소화 버퍼의 최소 1 ML을 추가합니다.
주 : 항생제 / 항진균제의 첨가가 시험 관내 종양 세포의 오염을 방지한다. - 200 rpm으로 - 125에 떨고, 30 ° C에서 3 시간 동안 종양 다이제스트.
참고 : 37 ° C까지 증가 온도는 (시간이 지남에 따라 더 많은 단일 세포)를 소화의 효율을 증가 있지만 일반적으로 증가 된 세포의 죽음을 동반한다. 대부분의 종양의 경우, 가능한 해리 세포의 충분한 수의 3 시간 결과 30 ° C에서 소화 라벨 단계로 진행합니다. - 35 ml를 (5 % FBS와 DMEM / F12) 미디어를 씻어 추가 소화를 중지합니다. 깨끗한 50 ML의 C에 메쉬 70 μm의 나일론을 통해 필터onical 관은 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 5 분 동안 400 XG에서 소화 세포를 포함하는 여과 매체를 원심 분리기.
- 1 ml의 붉은 혈액 세포 용해 버퍼에 기음 뜨는 및에 resuspend 펠렛. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
- 용해를 중지 : 10 ml의 세척 버퍼 (F12, 5 % FBS DMEM)를 추가합니다. 40 μm의 나일론을 통해 세포 덩어리를 제거하는 메쉬 전달합니다. 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기와 얼음에, 자리를 뜨는을 제거합니다.
- 재현 탁은 버퍼와 트리 판 블루 배제를 사용하여 실행 가능한 비 가능한 두 세포를 계산 씻어 5 ml의 세포를 분해. 간단히, 세포의 50 μL와 트리 판 블루의 50 μl를 혼합하고 혈구를 사용하여-트리 판 블루를 제외한 세포를 계산합니다.
참고 :이 원유 소화 제품은 인간의 PDX에서 파생 된 종양 세포뿐만 아니라 마우스 기질 세포가 포함됩니다 (섬유 아 세포, 혈액 세포, 등.). 소화 된 셀은 표시한다 (단계 6)에 대해 처리 될 수 있고, 또는 인간의 암세포에 기재된 방법 중 하나를 사용하여 농축 될 수있다참고 5인치
인간 상피 암 세포의 5. 심화
- 혈통 LIN (+) 세포 고갈 키트 (20)를 사용하여 마우스 간질 세포를 고갈.
참고 :는 EpCAM 표현을 알 수없는되거나 손실되는 높은 기질 함량) 매우 혈관 종양 및 / 또는 종양 추천합니다.- 깨끗한 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 107 가능한 셀을 타고 5 분 동안 300 XG에 2 ML의 EEB와 원심 분리기를 추가합니다. 완전히 상층 액을 피펫.
- 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 EEB 40 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
- 10 7 세포 당 비오틴 - 항체 칵테일의 10 μl를 추가, 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하고 10 분 동안 4 ° C (칵테일 린 + 마우스 세포에 항체를 포함)에 품어.
- 10 7 세포 당 차가운 EEB 30 μl를 추가, 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다.
- 부드럽게 피펫 팅 10 7 세포 당 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 믹스 추가하고 4 & # 부화176 15 분 C.
- 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 3 ㎖ 감기 EEB, 원심 분리기와 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 얼음에 EEB과 장소 500 μL에 재현 탁 펠렛.
- 자기 분리기의 자기장에 열을 놓습니다. 0.5 ml의 상피 농축 버퍼 열을 씻어 그것을 통해 똑 할 수 있습니다. 열이 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
- 열에서 새로운 폴리 프로필렌 수집 튜브를 놓습니다. 천천히 열을 통해 라벨 세포를 포함하는 500 μl를 추가 (린 +는 세포가 자기 열에서 유지됩니다 표시). 농축 계보 음 (종양) 세포 분획을 나타내는 레이블이없는 세포와 분수 등 폐기물 수집합니다.
- EBB의 500 μL와 열 3 번 씻어 단계 5.1.8의 유출과 같은 튜브에 유출 물을 수집합니다. 얼음에 유출 물을 유지하고 라벨 단계 (6)를 진행합니다.
- 옵션 : 자기장의 외부의 열을 가라. 아래에 새로운 폴리 프로필렌 튜브를 배치및 EEB 500 μL, 세 번 첨가 제공된 플런저를 사용하여 LIN + 분획을 용리시킨다.
- 인간는 EpCAM + 상피 암 세포의 농축은 (CD326 +를 표현하고 높은 마우스 기질 내용을 포함하는 것으로 알려진 종양 권장).
- 깨끗한 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 107 가능한 셀을 타고 5 분 동안 300 XG에 2 ml의에게 차가운 EEB와 원심 분리기를 추가합니다. 완전히 상층 액을 피펫.
- 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 EBB의 60 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
- 10 7 세포 당는 EpCAM 마이크로 비즈의 20 μl를 추가, 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하고 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 3 ㎖ 감기 EEB, 원심 분리기와 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 재현 탁의 EEB 500 μL에 펠렛과 얼음에 넣어.
- 미니 분리기의 자기장에 열을 놓습니다. 0.5 ML의 EEB와 열을 씻어 그것을 통해 똑 할 수 있습니다. 열 건조하는 것을 허용하지 않습니다아웃.
- 열에서 새로운 폴리 프로필렌 수집 튜브를 놓습니다. 천천히, (는 EpCAM + 표지 세포가 자기 열에서 유지됩니다) 컬럼을 통해 라벨 세포를 포함하는 500 μl를 추가합니다. 마우스 간질 세포를 나타내는 표지 된 세포와 같은 유출 분획 수집.
- ME 버퍼 500 μL와 열 4 번 씻어 단계 5.1.8의 유출과 같은 튜브에 유출 물을 수집합니다.
- 자기장의 외부의 열을 가라. 아래 새로운 폴리 프로필렌 튜브를 놓고 ME 500 μL 버퍼 세 번 추가하여는 EpCAM + 분획을 용출. 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표지화 된 세포를 플러시한다. 유출 농축 된는 EpCAM + 종양 세포 분획을 포함를 수집하고 얼음에 보관하십시오. 6 단계로 진행합니다.
PDX 유래의 종양 세포의 형질 도입 (6)
- 원심 분리기 2 ml의 mammosphere 메디칼 300 GX 5 분,에 resuspend에서 종양 세포를 해리에이. 4.11에서와 같이 트리 판 블루 배제를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
- 준비 8 μg의 / ㎖ 폴리 브렌 (미디어 1 ㎖ 당 재고의 폴리 브렌 2 μl를) 포함 mammosphere 미디어 10 ㎖.
- 2 × 10 5 가능한 종양 세포에 필요한 볼륨을 결정합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포 및 폴리 브렌 포함하는 미디어 2 ㎖에 재현 탁 펠렛. 6 웰 초저 부착 조직 배양 플레이트에 웰 당 접시에 2 × 105 생존 가능한 종양 세포.
참고 :이 하나의 렌티 바이러스 벡터와 형질 도입에 필요한 세포의 최적의 숫자입니다.
주의! 렌티 바이러스 입자와 렌티 바이러스 입자로 사용되는 모든 소모품은 재조합 DNA의 생물학적 위험에 대한 제도적 절차에 따라 처리해야합니다.
참고 : 기본 유방암 세포의 렌티 바이러스 전달 강하게 (21) 라벨 동안 내강 세포와 종양 세포의 소집단의 선택의 가난한 표시 될 수 있습니다 근 상피 세포를 선호한다. <리>이 바이어스 전위 (21)에 대해 서로 다른 기본 세포 개체군에 바이러스 입자의 바인딩 정확한 전달을 증가시키기 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 200를 mU / ㎖ 뉴 라미 가진 바이러스를 부화. - PDX-해리 세포 린 + 마우스 세포 고갈 또는는 EpCAM + 세포에 농축되는 경우 10 MOI (2 × 10 5 가능한 세포 2 × 10 6 TU)에서 렌티 바이러스 입자를 추가합니다. 비 농축 PDX-해리 세포를 사용하는 경우 30 MOI (2 × 10 5 가능한 세포 6 × 10 6 TU)에서 렌티 바이러스 입자를 추가합니다.
주 : 증가 MOI도 파편 많은 양의 원유 추출물의 죽은 세포의 존재 효율적인 전달이 가능합니다. 생존 능력 및 전달 효율에 대한 제어 역할을하는 레이블이없는 세포 하나 잘 보관하십시오. - 세포와 바이러스를 혼합하는 소용돌이 친다. 37 ° C, 최대 96 시간 동안 5 % CO 2에서 품어. 24 시간 형질 전환 후 신선한 mammosphere 매체의 500 μl를 추가합니다. 세포는 ATTAC하지 않습니다판에 시간은 미디어를 대기음하지 않습니다.
평가 Immunocompromised에 마우스의 형질 도입 효율성과 레이블 세포의 재 주입 (7)
- 추적 마커 (GFP) 10 배 배율에서 형광 현미경을 이용하여 매 24 시간의 발현을 모니터링합니다.
참고 : GFP 표현은 감염 후 빠르면 24 시간을 관찰 할 수 있지만, 대부분의 PDXs에서 GFP 발현은 72 시간 (그림 1) 이후에 명확하게 볼 수 있습니다. - 총 잘 내에서 GFP + 세포의 비율을 평가하여 전달의 효율성을 예상하고있다.
주 : 배양 다양한 정도의 종양 세포에서, 잔류 기질 세포와 죽은 세포를 포함하므로, 낮은 10 %의 GFP + 세포 웰 숙주 마우스에 이식 할 수있다. - 15 ML 원뿔 관에 6 웰 플레이트에서 형질 세포를 전송합니다. 남아있는 모든 세포를 수집하는 우물에 mammosphere 매체의 1 ML을 추가합니다. 얼음에 놓습니다.
- 형질 세포와 C에 HBSS / HEPES 10 ML을 추가5 분, 4 ° C 300 XG에 entrifuge. 조심스럽게 얼음에 50 μl의 지하 매트릭스 추출물 (BME)에서 상층 액과에 resuspend을 대기음.
참고 : BME 씩 1, 얼음에 해동해야 - 사용하기 2 시간 전에. BME 실온에서 고화한다; 항상 얼음에 보관하십시오. - , 0.5 ml의 인슐린 주사기에 BME 내장 세포를로드 얼음에 유지하고, NSG 마우스로 재 치환술의 동물 시설에 가져다.
- 2 % 이소 플루 란 / 98 %의 산소 또는 프로토콜을 승인 승인 된 동물 연구 윤리에 따라 다음 5 분 5 %의 이소 플루 란 / 95 %의 산소를 사용하여 8 주 이전 NSG 마우스 - 여자 4 마취.
- 동물이 통증 자극 (발가락 핀치)에 응답하지 않는 경우, 에탄올 잎사귀 뒤에 betadine으로 주입 영역을 청소하고 4 번째 유방 지방 패드에서 세포의 50 μl를 주입. 승인 된 프로토콜에 나타낸 바와 같이 주입 불편을 완화하는 진통제와 마우스를 제공합니다.
- 세포들이 종양을 형성 할 수 있도록 (2-12주)를하고 GFP를 모니터링 및 / 또는가변 조명 시스템 및 / 또는 생체 루시퍼 촬상 시스템 (도 2)를 사용하여 루시퍼 라제 활성.
주 : 기관 동물 연구 윤리위원회의 승인 마취, 진통제, 종양 부담 측정 및 안락사 기준에 대한 가이드 라인을 따르십시오.
레이블이 PDXs 8. 품질 관리
- 라벨 종양에서 루시퍼 라제 및 GFP 발현을 평가함으로써 라벨의 효율성을 결정합니다.
참고 : 수행 기관 동물 연구 윤리위원회는 생체 내 생물 발광 영상 절차 (그림 2, 3) 승인했다.- 종양의 크기가 1.0에 도달 할 때 안락사 마우스에서 종양을 해부 - 1.5 cm 직경 (또는 4에 기재된 바와 같이, 승인 된 프로토콜에 따라 전). 절개는 가변 조명 시스템 (또는 GFP 형광 평가할 수 등가 시스템) 하에서 수행한다.
- 각 종양에서 질적 체육를 추정GFP + 종양 현미경을 사용 rcentage. 100 % 미만의 경우, GFP의 + 부분 만 해부. 3 밀리 디스크 해부 파라핀 매입 조직 학적 분석을 위해, 10 % 포르말린으로 고정, RNA 또는 다른 원하는 분석을위한 작은 조각을 저장하고, 90 % FBS / 10 %를 함유하는 개개의 1.5 ml의 cryotubes에 가능한 한 많은 종양 저장 동결 보존에 대한 DMSO.
- 새받는 사람 NSG 마우스 (18)에 표시 종양의 재 임플란트 조각 확장 실험 전이 연구에 사용할 수 있습니다.
- 이전 전달 및 각 세대에서 종양에서 얻은 파라핀 조직의 표준 면역 조직 화학 염색을 수행 한 후 확인이 표시 PDXs 원래 PDXs에 조직 학적으로 유사한 남아 있습니다.
참고 : 품질 관리에 사용되는 마커는 각 PDXs에 따라 달라집니다. 유방암 PDXs 에스트로겐 수용체 발현, 프로게스테론 수용체, 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 표피 성장 인자 수용체 1 (HER1 또는 EGFR), 유제품n 형 사이토 케라틴 (팬-CK)은 초기 스크리닝을 권장합니다.
레이블이 PDXs 9. 실험 전이 모델
- 레이블 PDX에서 종양 세포를 떼어 놓다, 4 장에서 설명하는 단계를 수행. 종양이 높은 혈관 또는 마우스 기질 풍부한 경우 4.5 또는 4.6에 기술 된 바와 같이, 암 세포의 농축을 수행한다.
- 마우스 당 (칼슘, 마그네슘 2+ 무료) 트리 판 블루 배제를 사용하여 가능한 세포를 계산, 100 μl의 PBS에서 25 세포를 희석. 얼음에 세포를 유지합니다. 다수의 마우스 주입 따라서 숫자를 조정 (페팅 오류를 고려하여 적어도 하나의 추가 주입 과량을 준비).
- 적절한 동물 절차 방에 얼음에 세포를 가져와 승인 IACUC 프로토콜에 따라 내 심장 주사를 진행합니다.
참고 : 암 세포 내 심장 주입을위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서 22, 23 설명 하였다. - 추적 및 전이를 정량화생물 발광 영상을 사용하여 시간에 걸쳐. 생물 발광 및 / 또는 부검 (24)에서 고립 된 장기의 GFP 영상 (그림 6)를 사용하여 다른 기관에서 거시적 인 전이를 시각화합니다.
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Representative Results
이 방법은 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 pSIH1-H1-copGFP-T2A-순수하지 않아 및 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W를 사용하여 PDX-해리 유방암 세포의 전달에 대해 설명합니다. 이 벡터는, 감염 (그림 1a) 후 빠르면 24 시간을 시험관 내에서 전달의 효율성을 추정 허용 형광 마커를 표현한다. 가장 PDXs 들어, GFP 발현 세포 응집체의 형성은 일반적으로 관찰되는이 시점에서, 감염 (도 1b) 후 72 시간까지 지연 될 것이다. 형질 도입은 또는 조에서 PDX-분해 셀 (린 + 세포 고갈,도 1a를 이용하여, IE) 인간 암세포 농축 후에 얻어 질 수있다 (도 1B). 종양의 상피 세포의 보충은 매우 혈관이 종양 마우스 혈액 세포는 생존 세포의 수의 상당한 비율을 나타낸다이었다 권장한다.
체외에서 확인되면 "1"> 표지 된 세포를 수거하고, 세포 외 매트릭스에 현탁하고, NSG 마우스로 재 주입된다. 표지 된 종양 세포를 생물 발광 또는 형광 (도 2)를 이용하여 추적 할 수있는 종양을 재생성. 형질 도입 효율은 다음과 같은 종양 형성을 평가해야하며, 이는 시험 관내 전달 상이한 PDXs의 민감성에 따라 달라진다. 성공적으로 표시된 PDX 100 % GFP 근처 + 1 세대 후 전달 (그림 2b, c) 및 이후의 통로 100 % GFP 근처 +로 유지됩니다 (그림 3)에있을 것입니다. 그러나 일부 PDXs는 체외 전달에 최적를 나타내는, GFP + 세포 (그림 4)의 "누덕 누덕 기운"분포를 보여줍니다. 이러한 경우에, 종양 표지 subpop 확장 재 주입 될 수 GFP + 영역을 선택하는 형광 시청 시스템 아래 해부 될 수있다위험률 또는 종양 분해 될 수 있고, GFP + 세포 NSG 생쥐 재 주입 하였다 FACS를 이용하여 분리 될 수있다.
PDX 해리와 전달이 종양 내에서 세포 개체군의 선택을 초래할 수 있기 때문에, 연구자들은 라벨 종양이 밀접하게 파생 된에서 부모의 종양을 닮은 확인해야합니다. PDXs가 중요한 마커와 같은 EGFR, 호르몬 수용체 (즉, 에스트로겐 수용체) 및 팬 cytokeratins을 보여주기 위해 각 세대에 IHC 스테인드한다 (PanCK는, 상피 세포의 마커가) 표시 PDXs에 보존되어있다. EGFR에 대한 염색 5는 그림과 트리플 부정적인 유방암 PDX에서 panCK (이 PDX는 에스트로겐과 프로게스테론 수용체 부족으로 호르몬 수용체 염색이 표시되지 않습니다).
표지 PDXs 자발적인 전이성 확산뿐만 아니라 실험적 전이성을 추적하는데 사용될 수있다순환에 직접 세포를 파종하여 확산. 유방암 PDXs에서 자발적 전이가 자주 발생하지만, 여러 그룹 3,13,25에 의해보고되었다. 전이의 실험 모델은 전이성 캐스케이드 장기 친 화성 및 장기 정착 단계를 연구하는 대안을 제공합니다. 표지 종양에서 해리 세포는 intracardially 주입 및 전이성 부담 생물 발광 영상을 사용하여 추적됩니다. 도 6에 도시 된 바와 같이, PDX가 파지 EF1aL - 루시 페라 UBC-GFP-W 형질 용이 기관 체외에서 생체 내에서 루시퍼 촬상하고 GFP 발현으로 확인 된 폐 및 간에서 250,000 세포 / 마우스 형성된 전이 주입 .
그림 1 :. 해리 PDX 세포에 형질 도입 효율을 추적 A) PDX는-해리) 72 시간을 인간 상피 세포 (린 + 고갈) pSIH1-H1-copGFP-T2A-순수하지 않아 렌티 바이러스 입자. B와 전달 후 24 시간 동안 농축 된 세포를 PDX-해리 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W와 전달 후. 두 패널은 살아있는 세포를 표시합니다. BF : 밝은 필드 이미지는 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 설립 호스트 마우스의 레이블이 PDXs 72 시간 동안 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W와 형질 세포는 여성 NSG 마우스의 유방 지방 패드에 이식했다. 종양은 주입. A) 루시 페라로부터 14 주 동안 성장시켰다 리포터 활성 형광 관찰 시스템을 사용하여 그대로 피부를 통해 관찰 할 수 루시페린. B) GFP 발현의 복강 내 주사 한 후 생체 내 이미징에 의해 평가된다. C) GFP 발현은 종양 표지의 범위를 결정하기 위해 해부에서 검증되어야한다. 이 예는 유비쿼터스 GFP 발현하는 종양을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 레이블 PDXs는 생체 내에서 여러 구절 후 추적 가능한 마커를 유지 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W로 표지 유방암 PDX는 전달 후 3 통로를받습니다.. GFP의 발현은 종양 계대에서 거의 100 %로 유지된다.54944 / 54944fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 최적 인 형질 도입 효율과 PDXs 4. 예. A) 유방암 PDX는 차선의 전달이 발생한 후 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W는 계대 하였다 표지. 그 결과 종양은 GFP +와 GFP- 종양 세포의 혼합 인구를 포함한다. 왼쪽 종양은 더 전파에 적합하지 않습니다. 오른쪽 종양은 형광보고 시스템 하에서 GFP + 영역을 해부에 의해 전파 될 수있다. B) 혼합 종양에서 GFP + 세포의 지역을 쉽게 형광등 아래에서 확인할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. PDX의 품질 관리는 통로 (2)에서 트리플 부정적인 유방암 PDX F2-7에서 파라핀 조직에서 EGFR 및 팬 - 사이토 케라틴 (PanCK)의 형질 도입 및과 Passaging. 식 (P2, 전달하기 전에), 종양 후 특징 전달 (P2-I0) 직후에 생성 한 다음 통로 (P2-I1). 20X 이미지는 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
레이블이 PDXs를 사용하여 그림 6. 실험 전이. PDX는 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W 4에 설명 된대로 3 시간, 및 25 셀 우리를 위해 분해 된 발현하는NSG 마우스의 좌측 심실의 재 주입. A) 전이성 성장은 발광 이미징을 이용하여 살아있는 동물에서 추적 될 수있다. 이 유방암 PDX 전이성 부담 형광 시청 시스템 아래 해부 장기의 생체 외 이미징을 이용하여 B) 간 및 C)의 폐에서 관찰 될 수있다. 바는 약 1cm. 나타낸다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계 :
시험 관내 형질 도입 동안 매체 조성물의 신중한 제어를 허용 높은 역가 렌티 바이러스 입자의 사용은 (> 10 8 TU / ㎖),이 프로토콜의 성공에있어 중요한 단계이다. 고 역가 바이러스 입자의 제조를위한 다양한 방법이도 18, 19를 설명 하였지만; 이 프로토콜에서 상세히 설명한 바와 같이 제조 된 렌티 바이러스 입자를 사용 www.kottonlab.com를 . 암 세포의 종양의 소화와 분해를위한 부드러운 방법은 성공적인 라벨과 라벨이 종양의 성장을 위해 중요하다. 삼시간 넘어 소화 시간을 연장 또는 37 ° C의 분해 온도를 증가시키는 것은 해리 세포의 수를 증가하지만, 대부분의 종양 세포 생존 및 라벨의 성공을 감소시킨다.
수정 및 문제 해결 :
이 프로토콜은 동적으로 간주하고 각 단계에서주의 깊은 모니터링 독특한 PDX에 대한 적응을 필요로한다. 이 표준 프로토콜은 대부분의 이종 이식 종양 잘 작동하지만, 작은 변화가 다른 PDXs의 라벨을 최적화 할 필요가있다. 예를 들어, 다량 및 기질 및 세포 외 매트릭스의 조성은 일반적으로 분리 한 후, 수득 된 종양 세포의 수율에 필요한 시간에 영향을 미칠 수있는 PDXs간에 다르다. 높은 혈관 괴사 및 종양가 큰 종양으로 인한 파편 과도한 마우스 혈액 세포로 레이블링하기 어려울 수있다. 린 + 고갈이 프로토콜에 설명 된 상피 세포는 EpCAM + 농축의 사용은 PDXs의 전달 효율을 향상시킨다. 그러나,는 EpCAM + 세포의 발현 따라서 그 표현은 각 PDX에 확인해야합니다, 심지어 상피 기원의 종양에서 변화 세포 농축을위한 방법으로 사용하기 전에.
Limita기술의 TIONS :
해리 세포를 체외에서의 임시 문화의 전달은 부모 PDXs에서 근본적으로 다른 레이블 종양에 상승을 제공합니다 세포 개체군의 선택이 발생할 수 있습니다. 뉴 라미니다 제와 렌티 바이러스 입자의 사전 인큐베이션 따라서이 단계에서 도입 될 수있는 전달 바이어스를 감소 형질 도입하기 어려운 세포 개체군 21 바이러스 입자의 결합을 증가 할 것을 권장한다. 우리의 경험에 의하면, 형질 세포에 의해 재구성 된 종양은 밀접하게뿐만 아니라 조직 학적으로 부모 PDXs의 기능과 유사 할뿐만 아니라 (데이터가 표시되지 RNA의 서열) mRNA 발현의 계층 적 클러스터링 분석을 사용하여. 표지 효율 종양 충실도의 관점에서 품질 관리는 모든 통로로 각각 PDX 수행한다. PDX 라벨링 생체 내 종양 드리프트 종양의 확장을 필요로하기 때문에 반복 (P) 후에 발생할 수assaging, 전달 가능한 가장 빠른 통로에서 수행해야합니다.
기술의 중요성 :
이 프로토콜은 유방암 PDXs는 형광 bioluminescently 체외에서 표시 및 동 소성 및 전이성 종양 성장의 추적을 위해 생체 내에서 재 주입 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이전 연구는 PDX-파생 organoids (18) 레이블을 비슷한 전략을 사용하고 있지만, 현재의 프로토콜은 여러 PDXs의 높은 전달 효율이 발생할 종양 소화와 라벨의 변화를 포함한다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램이나 방향 :
안정적으로 추적 마커 (GFP, 루시퍼 라제)를 표현하고, 과발현 또는 특정 유전자를 넉다운 할 수있는 능력은 (즉, pSIH1는-H1은-copGFP-T2A-순수하지 않아 shRNA를 전달하는 데 사용할 수 있습니다)은 약 근본적인 질문에 대한 답변을 PDXs의 사용을 허용확립 된 세포주와 비슷한 방식에서 종양의 성장과 전이. 특히,이 프로토콜은 전이성 캐스케이드에 장기 정착 단계를 연구하는 실험 전이 모델에서 표시 PDXs을 사용하는 방법을 보여줍니다. 다른 장기로 전이가 쉽게 가시화 살아있는 동물의 생물 발광 영상을 이용하여 정량화하고, GFP 발현 유도 절개하는데 사용 적출 기관에서 전이를 시각화 할 수있다. 이 전이 연구를위한 PDXs의 사용을 촉진하는 강력한 도구를 나타냅니다.
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Acknowledgments
저자는이 연구에서 사용 된 높은 역가의 렌티 바이러스 생산을위한 파지 - EF1aL-을 DsRed-UBC-GFP-W 벡터 및 프로토콜을 제공하기 위해 보스턴 대학에서 박사 대럴 Kotton 감사합니다. 이 작품은 .NCI P30CA046934 센터 보조금은 생체 내 이미징에서 지원 DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG 번호 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC)와 R01 CA140985 (CAS)에 의해 투자되었다 조직 문화는 콜로라도 AMC의 대학에서 코어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
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