Summary
Se describe un método para el marcaje estable de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) con partículas lentivirales que expresan la proteína y luciferasa indicadores verdes fluorescentes. Este método permite el seguimiento del crecimiento de PDXs en el sitio principal, así como la detección de metástasis espontáneas y experimentales utilizando en sistemas de imágenes in vivo.
Introduction
El desarrollo de xenoinjertos derivados de pacientes tumorales (PDXs), donde las muestras de tumor resecado quirúrgicamente injertados directamente en ratones inmunocomprometidos, ofrece varias ventajas sobre los modelos estándar de xenoinjertos de la línea celular y representa un avance importante en la investigación del cáncer 1,2. PDXs pueden ser mantenidos y expandido en pasajes sucesivos con una mínima alteración de las características genéticas y biológicas del tumor crecido en el primer paso; y reflejar con mayor precisión la heterogeneidad del tumor de xenoinjertos derivados de las líneas celulares de cáncer humano 3-8. Estos modelos se utilizan ahora ampliamente como una plataforma para la personalización de la terapéutica del cáncer 9,10, como una plataforma preclínica en el desarrollo de fármacos y 6,11 como una herramienta experimental para el estudio de la biología del cáncer 4,12.
La mayoría de PDXs se implantan y se propagan por vía subcutánea, que permite que sea viable la medición del crecimiento del tumor con el tiempo usando calibradores. sin embargo, La enfermedad metastásica ha sido más difícil de modelar utilizando PDXs. Específicamente para el cáncer de mama, xenoinjertos con capacidad metastásica a los diferentes órganos se han descrito 3,5,13, pero la frecuencia de difusión espontánea a los sitios de metástasis es extremadamente baja. Cuando se informó, la identificación y cuantificación de la carga metastásico se basa en el examen histológico de los órganos diana laboriosa post-mortem. líneas celulares de cáncer que expresan bioluminiscente (luciferasa, Luc) o fluorescente (proteína verde fluorescente, GFP) reporteros de genes se utilizan comúnmente en modelos experimentales de metástasis de cáncer de mama a cerebro, pulmón, hueso e hígado después de intracardíaca, cola-vena, intrafemoral y la inyección esplénica 14-16. Aunque estos modelos evitan la difusión de los tumores primarios, que son valiosos para estudiar los mecanismos de tropismo de órganos y la colonización metastásica. Sin embargo, las células derivadas de tumores de pacientes primarios y PDXs pueden tener baja las tasas de transfección o transducción using procedimientos estándar. Una alternativa es establecer líneas celulares derivadas de PDX in vitro 17, que puede ser etiquetado a continuación, utilizando protocolos de cultivo de tejidos convencionales. Esta estrategia, sin embargo, no es adecuado para la mayoría de etiquetado PDXs, para lo cual la línea de células derivación es difícil y puede cambiar el fenotipo de las células. Aquí se presenta un protocolo para la transducción de las células tumorales disociadas-PDX con lentiviral vectores adecuados para la formación de imágenes in vivo. Además, se describe la metástasis experimental usando inyección intracardíaca de células PDX luc-GFP etiquetados disociadas en ratones inmunocomprometidos.
Un protocolo básico para la transducción de organoides disociadas-PDX con el gen reportero que expresa lentivirus se ha descrito previamente 18. En el protocolo actual se describen métodos adicionales para enriquecer en células tumorales humanas y obtener cerca de la eficiencia de transducción de 100%, así como el uso de PDXs marcados para la detección de cáncer de mama experimentalmetástasis. Este protocolo se puede adaptar para el etiquetado de múltiples tipos de cáncer de PDXs con diversos marcadores luminiscentes y fluorescentes, así como la modulación de la expresión génica (es decir, desmontables shRNA de genes de interés).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los pasos que requieren el uso de animales en este protocolo sigue las directrices de la Universidad de Colorado Comité Ético de Investigación Animal (IACUC).
1. Preparación de los instrumentos, medios de cultivo y otros reactivos
- Preparar 100 ml mammosphere medios que contienen medio Eagle modificado y de Han medio de Dulbecco F-12 (DMEM / F12) (1: 1), básica factor de crecimiento fibroblástico (bFGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento epidérmico (EGF, 10 ng / ml ), heparina (4 g / ml), 1x B27, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml). Hacer los medios de comunicación en condiciones estériles y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 3 meses.
- Preparar tampón de enriquecimiento epitelial (EEB) que contiene PBS pH 7,2, 0,5% albúmina de suero bovino (BSA), 2 mM EDTA. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 6 meses.
- Hacer alícuotas de 5 ml de tampón de digestión en estériles de 15 ml tubos cónicos y se almacena a -20 ° C durante meses. La noche antes de la digestión del tumor, tampón de digestión de deshielo (5 ml por 500 mgtumor) en el hielo, a 4 ° C. Añadir la mezcla de 1x antibiótico-antimicótico antes de su uso.
- Autoclave (121 ° C durante 30 min) al menos dos pinzas, escalpelo y tijeras para la disección de PDXs.
- Hacer 500 ml de tampón de lavado que contiene DMEM: F12 y 5% de suero bovino fetal (FBS). Almacenar a 4 ° C durante meses. Alícuota de 10 ml por tumor el día de la disección del tumor.
- Preparar una polibreno acciones a 4 g / l con agua estéril. Se filtra y se alícuota de 1,5 ml que contienen tubos de microcentrífuga de 100 l cada uno, almacenar a -20 ° C.
2. Generación de alto título de Lentiviral partículas que llevan marcadores Trazables
- Adquirir o generar partículas de lentivirus de alto título que llevan un gen indicador (es decir., GFP y Luc para el seguimiento in vivo de crecimiento del tumor) 18,19.
NOTA: Un título lentiviral de> 10 8 TU / ml (se recomienda unidades de transducción por mililitro) para la transducción exitosa de PDXs. El lentiviral partículos deben ser pseudotyped con un sobre glicoproteína G de virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite la transducción de una amplia variedad de células de mamífero.
NOTA: El protocolo utilizado aquí para la generación y la titulación de las partículas lentivirales de alto título está disponible en www.kottonlab.com . Vectores utilizados en este protocolo son pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro y la doble promotor del fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W. Este vector se generó mediante la sustitución de dsRed con el gen de la luciferasa aguas abajo del promotor EF1aL en el vector de fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W, una especie de regalo de Darrell Kotton, la Universidad de Boston.
3. Generación de xenoinjertos derivados de los pacientes
- Generar xenoinjertos de pacientes derivada (PDX) por cáncer de mama mediante la implantación de los tumores de mama primarios o metastásicos en la almohadilla de grasa mamaria de ratones inmunodeprimidos 3,4. Generar tumores con un tamaño máximo recomendado de 1 cm de diámetro como tumores más grandes son likely para contener núcleos necróticos.
NOTA: Detallado métodos para fijar y trasplante de xenoinjertos se describen en DeRose et al 18.. Crecimiento de PDXs establecida trasplantables en tumores cm de diámetro> 1 tarda entre 4 y 24 semanas después de la implantación en NOD inmunodeficiente / SCID / ILIIrg - / - (NSG), dependiendo de las tasas de crecimiento del tumor intrínsecas. Si bien este protocolo describe la transducción de PDXs de cáncer de mama, que puede ser utilizado para la transducción viral de cualquier tumor adecuado para corto plazo en el pasaje vitro. La sensibilidad de PDXs a corto plazo (24 a 96 hr) en la supervivencia vitro es intrínseca a cada tumor y se debe determinar experimentalmente.
Disección 4. Tumor y la disociación de las células tumorales derivadas de PDX
- La eutanasia a los ratones que llevan PDX mediante inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical (siguen las directrices institucionales de la investigación del comité de ética animal). Sumergir los ratones en un 0,2% Chlorhexidine solución durante 1 minuto. Ajuste del ratón en una posición supina en la parte superior de una placa de disección, y el uso de alfileres para fijar las extremidades superiores e inferiores extendidas a la junta.
- Utilizando una técnica aséptica, utilizar un bisturí para cortar la piel alrededor del tumor. Tire de la piel con un conjunto de pinzas y separarlo del tumor usando un escalpelo limpio hasta que el tumor está completamente expuesto. El uso de un juego limpio de pinzas y bisturí, extirpar el tumor y colocarlo en 5 ml lavar los medios de comunicación en el hielo.
- Tome tumor diseccionado en un gabinete BLS2 para su posterior procesamiento. Retire el medio y enjuague tumor con 10 ml de salina equilibrada de Hank sodio modificado con Hepes 10 mM (HBSS / Hepes), dos veces.
- Caída del tumor en un 60 cm placa de cultivo de tejidos pesados previamente estéril. Pese la placa que contiene el tumor para estimar la masa tumoral.
- El uso de un bisturí, cortar el tumor por la mitad, luego se corta un disco de 3 mm desde la mitad y colocarlo en un recipiente con formalina al 10% durante 24 horas. Usar este tejido para verificar la heterogeneidad de lamuestra de tumor (parental PDX). Añadir 200 l de HBSS / Hepes (suficiente para evitar que el tejido se seque) y picar el tumor que queda en las más pequeñas piezas posibles utilizando fórceps y un bisturí limpio.
- Transferir el tumor picada en un tubo cónico de 50 ml estéril. Añadir al menos 1 ml de tampón de digestión que contienen 1x antimicótico-antibiótico por cada 100 mg de tumor.
NOTA: La adición de antibióticos / antimicótico evita la contaminación de las células tumorales in vitro. - Digerir tumor durante 3 horas a 30 ° C, agitando a 125 - 200 rpm.
NOTA: El aumento de la temperatura hasta 37 ° C aumenta la eficiencia de la digestión (células más simples con el tiempo) pero por lo general es acompañado por un aumento de la muerte celular. Para la mayoría de los tumores, la digestión a 30 ° C durante 3 hr resultados en un número suficiente de células disociadas viables para pasar a la etapa de marcaje. - Detener la digestión de la adición de 35 ml se lavan los medios (DMEM / F12 con FBS al 5%). Filtrar a través de un nailon 70 micras de malla en un lugar limpio de 50 ml conical tubo para retirar el tejido no digerido. Centrifugar los medios filtrados contienen células digeridas a 400 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 10 ml de tampón de lavado (DMEM: F12, FBS al 5%) para detener la lisis. Las células pasan a través de un nailon 40 mM de malla para eliminar los grumos. Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos y retirar el sobrenadante, el lugar en el hielo.
- Resuspender las células digiere en 5 ml tampón de lavado y contar las células viables y no viables mediante exclusión con azul de tripano. En pocas palabras, mezclar 50 l de células y 50 l de azul de tripano y contar las células con exclusión de azul de tripano-usando un hemocitómetro.
NOTA: Este producto crudo digestión contendrá células tumorales humanas derivadas de la PDX, así como las células del estroma de ratón (fibroblastos, células de la sangre, etc.). células digeridas ahora se pueden procesar para el etiquetado (paso 6), o células de cáncer humano pueden enriquecerse usando uno de los procedimientos descritosEn la referencia 5.
5. El enriquecimiento de las células del cáncer epitelial humano
- Agotar las células estromales de ratón utilizando un linaje kit de reducción de células (Lin +) 20.
NOTA: Se recomienda para tumores altamente vascularizados y / o tumores del estroma con alto contenido en el que la expresión de EpCAM se desconoce o se pierde).- Tomar hasta 10 7 células viables en un tubo de polipropileno de 5 ml limpio, añadir EEB 2 ml y centrifugar a 300 g durante 5 min. Pipetear el sobrenadante por completo.
- Sedimento celular se vuelve a suspender en 40 l de EEB enfriado en hielo por 10 7 células.
- Añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 7 células, mezclar pipeteando suavemente y se incuba a 4 ° C durante 10 min (cóctel contiene anticuerpos frente a células de ratón Lin +).
- Añadir 30 l de EEB en frío por 10 7 células, mezclar pipeteando suavemente.
- Añadir 20 l de microperlas anti-biotina por 10 7 células mezcle con la pipeta suavemente y se incuba a 4 y #176; C durante 15 min.
- Lavar las células con 3 ml EEB frío, centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Con cuidado, aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 500 l de EEB y el lugar en el hielo.
- Colocar la columna en el campo magnético de un separador magnético. Enjuagar la columna con 0,5 ml de tampón de enriquecimiento epitelial y dejarlo escurrir a través. No permita que la columna se seque.
- Colocar un nuevo tubo de recogida de polipropileno en la columna. Lentamente, añadir los 500 l que contienen células marcadas sobre la columna (Lin + etiquetados células serán retenidos en la columna magnética). Recoger el efluente como una fracción de células no marcadas, lo que representa la fracción celular enriquecida negativo linaje (tumor).
- Lavar la columna 3 veces con 500 l de EBB y recoger el efluente en el mismo tubo como efluente de la etapa 5.1.8. Mantenga efluentes en hielo y proceder a la etapa de marcaje (6).
- Opcional: Tomar la columna fuera del campo magnético. Coloque un nuevo tubo de polipropileno debajoy eluir la fracción LIN + mediante la adición de 500 l de EEB, tres veces y con el émbolo proporcionado.
- El enriquecimiento de las células de cáncer epitelial EpCAM + humanos (recomendado para los tumores se sabe que expresan CD326 + y contienen un alto contenido del estroma del ratón).
- Tomar hasta 10 7 células viables en un tubo de polipropileno de 5 ml limpio, añadir 2 ml de EEB en frío y centrifugar a 300 g durante 5 min. Pipetear el sobrenadante por completo.
- Sedimento celular se vuelve a suspender en 60 l de EBB enfriado en hielo por 10 7 células.
- Añadir 20 l de microperlas EpCAM por 10 7 células, mezclar pipeteando suavemente y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
- Lavar las células con 3 ml EEB frío, centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Con cuidado, aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 500 l de EEB y se puso en hielo.
- Colocar la columna en el campo magnético de un mini separador. Enjuague columna con EEB 0,5 ml y dejar que se escurra a través. No permita que la columna se sequefuera.
- Colocar un nuevo tubo de recogida de polipropileno en la columna. Poco a poco, añadir los 500 l que contenía células marcadas sobre la columna (células marcadas EpCAM + serán retenidos en la columna magnética). Recoger el efluente como una fracción de células no marcadas, que representan las células estromales de ratón.
- Lavar la columna 4 veces con 500 l de ME Buffer y recoger el efluente en el mismo tubo como efluente de la etapa 5.1.8.
- Tomar la columna fuera del campo magnético. Coloque un nuevo tubo de polipropileno debajo y eluir la fracción EpCAM + mediante la adición de 500 l de tampón ME, tres veces. Eliminar las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna. Recoger efluente que contiene la fracción EpCAM + células tumorales enriquecido y mantener en hielo. Continúe con el paso 6.
6. La transducción de las células tumorales derivadas de PDX
- Centrifugadora disoció las células tumorales en 300 gx 5 min y se vuelve a suspender en 2 ml mammosphere media. Contar las células viables mediante exclusión con azul tripán como en 4.11.
- Preparar 10 ml de medio mammosphere que contienen 8 g / ml de polibreno (2 l de Stock polibreno por ml de medios de comunicación).
- Determinar el volumen necesario para 2 x 10 5 células tumorales viables. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min, y pellet se resuspende en 2 ml de polibreno medios que contienen. Placa 2 x 10 5 células tumorales viables por pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos ultra-bajo de tejido de adherencia.
NOTA: Este es un número óptimo de células necesarias para la transducción con un vector lentiviral.
PRECAUCIÓN! Partículas lentivirales y todos los consumibles utilizados con partículas de lentivirus deben ser manejados siguiendo los procedimientos institucionales para riesgos biológicos de ADN recombinante.
NOTA: la transducción de Lentiviral de células de mama primarios favorece fuertemente las células mioepiteliales que puede resultar en pobres etiquetado de células luminales y selección de subpoblaciones de células tumorales durante el etiquetado 21. <li> incubar los virus con 200 mU / ml de neuraminidasa a 37 ° C durante 1 h antes de la transducción para aumentar la unión de partículas virales a diferentes subpoblaciones de células primarias y correcta para que este potencial de polarización 21. - Añadir partículas lentivirales a 10 MOI (2 x 10 6 TU para 2 x 10 5 células viables) si las células disociadas-PDX se agotan de células de ratón Lin + o enriquecidos en células EpCAM +. Añadir partículas lentivirales a 30 MOI (6 x 10 6 TU para 2 x 10 5 células viables) si se utilizan células disociadas-PDX no enriquecidos.
NOTA: El aumento de la MOI permite la transducción eficaz incluso en presencia de grandes cantidades de desechos y células muertas en los extractos crudos. Mantenga un pocillo con células no marcadas para servir como control para la eficiencia de la viabilidad y la transducción. - Agitar para mezclar con el virus de las células. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante un máximo de 96 hr. Añadir 500 l de los medios de comunicación mammosphere frescas 24 horas después de la transfección. Las células no ATTACh a las placas, no aspirar medios de comunicación.
7. Evaluación de la eficacia de transducción y la reimplantación de células marcadas en ratones inmunodeficientes
- Monitorear la expresión del marcador rastreable (GFP) cada 24 horas usando un microscopio fluorescente a un aumento de 10X.
NOTA: La expresión de GFP se puede observar tan pronto como 24 horas después de la infección, pero en la mayoría de PDXs expresión de la GFP es claramente visible después de 72 horas (Figura 1). - Estimar la eficiencia de la transducción mediante la evaluación del porcentaje de células GFP + en el bien total.
NOTA: Como cultivos contienen células tumorales, células estromales residuales, y las células muertas en diversos grados, pozos con tan bajo como 10% GFP + células pueden ser implantadas en un ratón huésped. - Transferencia de células transducidas de placas de 6 pocillos en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1 ml de medio mammosphere al pozo para recoger todas las células que quedan atrás. Colocar sobre hielo.
- Añadir 10 ml de HBSS / Hepes a las células transducidas y centrifuge a 300 xg durante 5 min, 4 ° C. Con cuidado aspirar el sobrenadante y resuspender en 50 l extracto de la matriz basal (BME) en hielo.
NOTA: alícuotas de BME deben ser descongelados en hielo, 1 - 2 hr antes de su uso. BME se solidificará a temperatura ambiente; mantener en hielo en todo momento. - Cargar células embebidas-BME en una jeringa de 0,5 ml de insulina, mantener en hielo, y llevar a las instalaciones de animales para la reimplantación en ratones GSN.
- Anestesie hembra 4 - ratones GSN 8 semanas de edad, usando 5% / 95% de oxígeno isoflurano durante 5 min, seguido de 2% de isoflurano / 98% de oxígeno o de acuerdo con la ética de investigación animal aprobados protocolo aprobado.
- Cuando los animales no responde a estímulos dolorosos (toe-pellizco), limpiar la zona de la inyección con betadine seguido de toallitas de etanol, e inyectar los 50 l de células en la almohadilla de grasa mamaria 4º. Proporcionar ratones con analgesia para aliviar las molestias de la inyección tal como se indica en el protocolo aprobado.
- Permiten a las células para formar tumores (2 - 12 semanas) y monitorear las buenas prácticas agrarias y / ola actividad luciferasa utilizando un sistema sintonizables luz y / o sistema de imagen luciferasa in vivo (Figura 2).
NOTA: Siga las pautas para la anestesia, analgesia, puede medirse la carga tumoral y criterios de eutanasia aprobadas por animales institucionales comité de ética de la investigación.
8. Control de Calidad de PDXs Etiquetada
- Determinar la eficiencia de etiquetado mediante la evaluación de la luciferasa y la expresión de GFP en los tumores marcados.
NOTA: Siga animales institucionales comité de ética de investigación aprobado procedimientos para imágenes de bioluminiscencia in vivo (Figuras 2, 3).- Diseccionar los tumores de los ratones sacrificados cuando el tamaño del tumor ha alcanzado 1,0 a 1,5 cm de diámetro (o antes de acuerdo con los protocolos aprobados, como se describe en 4). La disección debe realizarse bajo un sistema de luz ajustable (o un sistema equivalente que permita la evaluación de la fluorescencia de GFP).
- A partir de cada tumor, cualitativamente estimar el percentaje de GFP + tumor usando microscopía. Si es menos de 100%, diseccionar única porción + GFP. Diseccionar un disco de 3 mm y fijar en formol al 10% para la inclusión en parafina y análisis histológico, salvo un pequeño trozo de ARN u otros análisis deseados y ahorrar tanto del tumor como sea posible en cada 1,5 ml criotubos que contienen 90% de SFB / 10% DMSO para la crioconservación.
- Piezas re-implante del tumor marcado en ratones nuevo destinatario NSG 18 se expandan y se utilizan en los estudios experimentales de metástasis.
- Realizar la tinción inmunohistoquímica estándar de tejido embebidos en parafina obtenidos de tumores antes de la transducción y en cada generación a partir de entonces para verificar que PDXs marcados permanecen histológicamente similares a los PDXs originales.
NOTA: Los marcadores utilizados para el control de la calidad varían con cada PDXs. Para PDXs de cáncer de mama, la expresión de receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2), factor de crecimiento epidérmico receptor 1 (HER1 o EGFR), pan-citoqueratina se recomiendan (pan-CK) para el cribado inicial.
9. Modelos de metástasis experimentales con PDXs Etiquetada
- Siguiendo los pasos descritos en la sección 4, se disocian las células tumorales de un PDX marcado. Si el tumor es altamente vascularizado o ricos en estroma del ratón, lleve a cabo el enriquecimiento de las células cancerosas como se describe en 4.5 o 4.6.
- Contar las células viables mediante exclusión con azul de tripano, y diluir 250.000 células en 100 l de PBS (Ca2 +, Mg2 + libre) por los ratones. Mantener las células en hielo. Para la inyección de varios ratones, ajustar los números en consecuencia (y preparar un exceso de al menos una inyección adicional para tener en cuenta errores de pipeteo).
- Llevar células en hielo a la sala de procedimiento animal apropiado y proceder a la inyección intracardiaca acuerdo con el protocolo aprobado IACUC.
NOTA: Detallado protocolos para la inyección intracardiaca de las células cancerosas se han descrito en otra parte 22,23. - Realizar un seguimiento y cuantificar metastásicoescalonada en el tiempo utilizando imágenes bioluminiscentes. Visualizar metástasis macroscópicas en los diferentes órganos utilizando bioluminiscencia y / o imágenes de GFP de órganos aislados en la necropsia 24 (Figura 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este método describe la transducción de las células del cáncer de mama disociadas-PDX utilizando vectores lentivirales de alto título pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro y el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W. Estos vectores expresan un marcador fluorescente que permite la estimación de la eficacia de la transducción in vitro, tan pronto como 24 horas después de la infección (Figura 1a). Para la mayoría de PDXs, la expresión de GFP se retrasará hasta 72 hr después de la infección (Figura 1b), en este momento se observa con frecuencia la formación de agregados de células. La transducción se puede conseguir después de enriquecimiento para células cancerosas humanas (es decir, usando el agotamiento Lin + células, la Figura 1a) o en crudo células disociadas-PDX (Figura 1b). Se recomienda enriquecimiento de células epiteliales tumorales para los tumores altamente vascularizados eran células de la sangre de ratones representan un porcentaje significativo del número total de células viables.
in vitro, las células marcadas se recogieron y se suspendieron en la matriz extracelular y re-implantados en ratones GSN. Las células tumorales marcadas regeneran los tumores que pueden ser rastreados utilizando bioluminiscencia o fluorescencia (Figura 2). La eficacia de transducción debe ser evaluada la formación de tumores siguiente, y que variará en función de la susceptibilidad de diferentes PDXs a la transducción in vitro. Un PDX marcado éxito será de casi el 100% de GFP + en la primera generación posterior a la transducción (Figura 2b, c) y permanecerá cerca del 100% GFP + en pasajes posteriores (Figura 3). Sin embargo, algunos PDXs mostrarán distribución "desigual" de las células GFP + (Figura 4), lo que indica una subóptima en la transducción in vitro. En estos casos, los tumores se pueden diseccionaron bajo un sistema de fluorescencia de visualización para seleccionar + áreas GFP que se pueden volver a implantan para la expansión de la SUBPOP marcadomento, o tumores pueden ser disociados y células GFP + se pueden aislar usando FACS seguido de la reimplantación en ratones GSN.
Desde PDX disociación y transducción pueden dar lugar a la selección de las subpoblaciones de células dentro del tumor, los investigadores necesitan para verificar que los tumores marcados se parecen mucho a los tumores parentales de los que se derivaron. PDXs deben teñirse por IHC en cada generación para demostrar que los marcadores críticos como EGFR, receptores hormonales (es decir, los receptores de estrógenos) y pan-citoqueratinas (PanCK, los marcadores de células epiteliales) se conservan en PDXs etiquetados. La figura 5 muestra la tinción de EGFR y panCK en un triple cáncer de mama negativo PDX (tinción de receptores hormonales no se muestra ya que esto PDX carece de receptores de estrógeno y progesterona).
PDXs marcadas se pueden utilizar para realizar un seguimiento de la diseminación metastásica espontánea, así como metástasis experimentaldifundida por la siembra de células directamente en la circulación. Metástasis espontáneas de PDXs de cáncer de mama se producen con menos frecuencia, pero han sido reportados por varios grupos 3,13,25. Los modelos experimentales de metástasis proporcionan una alternativa para estudiar los pasos de tropismo de órganos y de órganos de colonización en la cascada metastásica. Las células disociadas a partir de tumores marcados se inyectaron intracardially y la carga metastásica es rastreados utilizando bioluminiscente de imágenes. Como se muestra en la Figura 6, una PDX transducidas con fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W inyectado a 250.000 células / ratón formado metástasis en los pulmones y el hígado que fueron fácilmente identificados con las imágenes de luciferasa in vivo, y la expresión de GFP en los órganos ex vivo .
Figura 1:. El seguimiento de la eficacia de transducción en células disociadas PDX A) B PDX-disociado) células PDX-disociado de un experimento separado, sin enriquecimiento de las células epiteliales, 72 horas después de la transducción con el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W. Los dos paneles muestran las células vivas. BF: imágenes de campo claro, barra representa 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Establecimiento de PDXs Etiquetada en ratones huésped Las células transducidas con el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W durante 72 horas se implantaron en la almohadilla de grasa mamaria de un ratón hembra GSN. Se dejó que la tumor de crecer durante 14 semanas después de la inyección. A) de la luciferasa actividad de reportero se evalúa mediante formación de imágenes in vivo después de la inyección intraperitoneal de B la expresión de GFP luciferina.) se puede observar a través de la piel intacta utilizando un sistema de visualización de la fluorescencia. expresión C) GFP también debe ser verificada en la disección para determinar el grado de etiquetado tumor. Este ejemplo muestra un tumor que expresan GFP en todas partes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Etiquetado PDXs Conservar Trazables marcadores después de múltiples pases in vivo Un PDX cáncer de mama marcada con el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W 3 se muestra pasajes después de la transducción.. expresión de GFP se mantiene en casi 100% en el tumor mediante pasajes.54944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Ejemplo de un PDXs con la eficiencia de transducción subóptima. A) El cáncer de mama PDX etiquetada con el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W se hizo pasar después de una transducción subóptima se llevó a cabo. Los tumores resultantes contienen poblaciones mixtas de GFP + y células tumorales GFP. El tumor izquierda no es adecuado para la propagación adicional. El tumor de la derecha se puede propagar mediante la disección de la GFP + regiones bajo un sistema de visualización de fluorescencia. B) Regiones de células GFP + en tumores mixtos pueden ser fácilmente identificados bajo luz fluorescente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Control de Calidad de PDX Características después de la transducción y pases. La expresión de EGFR y pan-citoqueratina (PanCK) en tejido incluido en parafina de un cáncer de mama triple negativo PDX F2-7 en el paso 2 (P2, antes de la transducción), el tumor generada inmediatamente después de la transducción (P2-i0), y el siguiente paso (P2-i1). 20X imágenes, barras representa 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. La metástasis experimentales Usando PDXs Etiquetada. Un PDX-fago que expresan EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W se disoció durante 3 horas como se describe en 4, y 250.000 células nosotrosre inyectada en el ventrículo cardíaco izquierdo de los ratones del GSN. A) el crecimiento metastásico se puede remontar de animales vivos utilizando imágenes de luminiscencia. Carga metastásico de este PDX cáncer de mama se puede observar en B) hígado y los pulmones C) el uso de imágenes ex vivo de los órganos diseccionados en virtud de un sistema de visualización de la fluorescencia. Bares representa aproximadamente 1 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo:
El uso de partículas de lentivirus de título alto (> 10 8 TU / ml) es un paso crítico en el éxito de este protocolo, ya que permite un control cuidadoso de la composición de los medios de comunicación durante la transducción in vitro. Si bien varios métodos para la producción de partículas virales de alto título han sido bien descritos 18,19; Este protocolo utiliza partículas lentivirales producidos como se describe en detalle en www.kottonlab.com . Un método suave para la digestión de los tumores y la disociación de las células cancerosas es crítica para el etiquetado y el crecimiento de tumores marcados éxito. La extensión de la tiempo de digestión más allá de tres horas o el aumento de la temperatura de digestión a 37 ° C aumenta el número de células disociadas, pero disminuye la viabilidad celular y el éxito de etiquetado en la mayoría de los tumores.
Modificaciones y resolución de problemas:
Este protocolo debe ser considerado dinámico y requiere una adaptación de PDX único con un seguimiento cuidadoso en cada paso. Si bien este protocolo estándar funciona bien para la mayoría de los tumores xenoinjertados, pequeñas variaciones pueden ser necesarios para optimizar el etiquetado de los diferentes PDXs. Por ejemplo, la abundancia y la composición de estroma y la matriz extracelular generalmente difieren entre PDXs, que puede afectar el tiempo necesario para la disociación y el rendimiento de las células tumorales obtenido a partir de entonces. Los tumores grandes que se convierten en tumores necróticos y altamente vascularizados pueden ser difíciles de etiquetar debido a los desechos y células de la sangre del ratón excesivas. El uso de Lin + agotamiento y enriquecimiento EpCAM + de células epiteliales se describe en este protocolo mejora la eficiencia de la transducción en tales PDXs. Sin embargo, la expresión de células EpCAM + varía incluso en tumores de origen epitelial, de este modo su expresión debe ser verificada en cada PDX antes de su uso como método para el enriquecimiento celular.
Limitaciones de la técnica:
Transducción de células disociadas y su cultura temporal in vitro podría dar lugar a la selección de las subpoblaciones de células, que luego dar lugar a tumores marcados fundamentalmente diferente de la PDXs parentales. Se recomienda el pre-incubación de partículas lentiviral con neuraminidasa para aumentar la unión de partículas virales de las subpoblaciones de células difíciles de transducir 21, disminuyendo así el sesgo de transducción que podría introducirse en este paso. En nuestra experiencia, los tumores reconstituidas por las células transducidas se parecen mucho a las características de los padres no sólo PDXs histológicamente, sino también mediante el análisis de agrupación jerárquica de la expresión del ARNm (ARN siguientes, los datos no presentados). Control de calidad en términos de rendimiento de marcaje y la fidelidad del tumor debe realizarse para cada PDX en cada paso. Desde etiquetado PDX requiere la expansión del tumor in vivo y la deriva tumor podría ocurrir después de repetidas passaging, la transducción se debe realizar en la primera paso posible.
Importancia de la técnica:
Este protocolo describe cómo PDXs cáncer de mama puede ser una forma fluorescente bioluminescently marcado in vitro y la re-implantado in vivo para el seguimiento del crecimiento del tumor ortotópico y metastásico. Mientras que los estudios anteriores han utilizado una estrategia similar para etiquetar organoides derivados de PDX 18, el protocolo actual incluye variaciones en la digestión tumor y el etiquetado que resultan en una alta eficiencia de transducción de múltiples PDXs.
Las aplicaciones futuras o direcciones después de dominar esta técnica:
La capacidad de expresar de forma estable marcadores trazables (GFP, luciferasa), y para sobreexpresar o una caída genes específicos (es decir, pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro se puede utilizar para entregar shRNAs) permite el uso de PDXs para responder a preguntas fundamentales acercael crecimiento del tumor y la metástasis de una manera similar a las líneas celulares establecidas. Específicamente, este protocolo demuestra el uso de PDXs etiquetados en modelos de metástasis experimentales para estudiar los pasos de órganos de colonización en la cascada metastásica. Metástasis a diferentes órganos pueden ser fácilmente visualizados y cuantificaron utilizando bioluminiscente de imágenes de animales vivos, y la expresión de GFP utilizan para disecciones guiadas y visualizar metástasis en órganos extirpados. Esto representa una poderosa herramienta para facilitar el uso de PDXs para la investigación de la metástasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Darrel Kotton la Universidad de Boston para proporcionar el fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W de vectores y protocolos para la producción de lentivirus de alto título usado en estos estudios. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), el NCI K22CA181250 (DMC) y R01 CA140985 (CAS) subvención .NCI P30CA046934 Centro apoyado en imágenes in vivo y el cultivo de tejidos núcleos a Universidad de Colorado AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260 (2012).
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
