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Cancer Research

ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए Traceable पत्रकारों के साथ स्तन कैंसर के रोगी व्युत्पन्न Xenografts की लेबलिंग

Published: November 30, 2016 doi: 10.3791/54944
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

हम रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) lentiviral कणों हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन और luciferase संवाददाताओं को व्यक्त करने के साथ स्थिर लेबलिंग के लिए एक विधि का वर्णन। इस विधि को प्राथमिक साइट पर PDXs के विकास पर नज़र रखने के लिए, साथ ही इन विवो इमेजिंग सिस्टम में उपयोग करते हुए सहज और प्रायोगिक मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

Introduction

रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर xenografts (PDXs), जहां शल्य चिकित्सा resected ट्यूमर के नमूनों सीधे प्रतिरक्षा-समझौता चूहों में engrafted कर रहे हैं के विकास, मानक सेल लाइन जेनोग्राफ्ट मॉडल पर कई लाभ प्रदान करता है और कैंसर अनुसंधान 1,2 में एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है। PDXs बनाए रखा और ट्यूमर पहले पारित होने से बढ़ी की आनुवंशिक और जैविक विशेषताओं में से कम से कम परिवर्तन के साथ लगातार मार्ग से विस्तार किया जा सकता है; और अधिक सही मानव कैंसर कोशिका लाइनों 3-8 से निकाली गई xenografts से ट्यूमर विविधता को दर्शाते हैं। इन मॉडलों को अब बड़े पैमाने पर दवा के विकास 6,11 में एक मंच के रूप में preclinical और कैंसर जीव विज्ञान 4,12 अध्ययन के लिए एक प्रायोगिक उपकरण के रूप में, कैंसर चिकित्सा 9,10 व्यक्तिगत के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं।

अधिकांश PDXs प्रत्यारोपित और subcutaneously प्रचारित है, जो feasibly नली का व्यास का उपयोग कर समय के साथ ट्यूमर के विकास की माप की अनुमति देता रहे हैं। तथापि, Metastatic रोग अधिक मुश्किल हो गया है PDXs का उपयोग कर मॉडल करने के लिए। विशेष रूप से स्तन कैंसर के लिए, अलग-अलग अंगों को मेटास्टेटिक क्षमता के साथ xenografts 3,5,13 वर्णित किया गया है, लेकिन मेटास्टेटिक साइट्स के लिए सहज प्रचार-प्रसार की आवृत्ति बहुत कम है। कहाँ सूचना दी, पहचान और मेटास्टेटिक बोझ की मात्रा का ठहराव लक्ष्य अंगों पोस्टमार्टम के श्रमसाध्य ऊतकीय परीक्षा में निर्भर करता है। कैंसर कोशिका लाइनों व्यक्त bioluminescent (luciferase, ल्यूक) या फ्लोरोसेंट (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP) जीन संवाददाताओं सामान्यतः मस्तिष्क, फेफड़े, intracardiac के बाद हड्डी और लीवर, पूंछ-नस, intrafemoral और प्लीहा इंजेक्शन के लिए स्तन कैंसर मेटास्टेसिस की प्रयोगात्मक मॉडल में इस्तेमाल कर रहे हैं 14-16। इन मॉडलों प्राथमिक ट्यूमर से प्रचार-प्रसार बाईपास, वे अंग tropism और मेटास्टेटिक उपनिवेशवाद के तंत्र का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं। हालांकि, प्राथमिक रोगी ट्यूमर और PDXs से ली गई कोशिकाओं कम अभिकर्मक या पारगमन दरों usin हो सकता हैजी मानक प्रक्रियाओं। एक वैकल्पिक विट्रो 17 है, जो तब पारंपरिक टिशू कल्चर प्रोटोकॉल का उपयोग लेबल किया जा सकता में PDX व्युत्पन्न सेल लाइनों की स्थापना है। यह दृष्टिकोण हालांकि, ज्यादातर PDXs, जिसके लिए सेल लाइन व्युत्पत्ति मुश्किल है और कोशिकाओं के phenotype बदल सकते हैं लेबलिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। यहाँ हम vivo इमेजिंग के लिए उपयुक्त lentiviral वैक्टर के साथ PDX-अलग ट्यूमर कोशिकाओं के पारगमन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इसके अलावा, हम immunocompromised चूहों में अलग-ल्यूक GFP लेबल PDX कोशिकाओं के intracardiac इंजेक्शन का उपयोग प्रायोगिक मेटास्टेसिस का वर्णन है।

जीन-रिपोर्टर व्यक्त lentivirus के साथ PDX-अलग organoids के पारगमन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल पहले 18 में वर्णित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में हम मानव ट्यूमर कोशिकाओं के लिए समृद्ध और 100% पारगमन दक्षता के पास प्राप्त करने के लिए, साथ ही प्रयोगात्मक स्तन कैंसर का पता लगाने के लिए लेबल PDXs के उपयोग के अतिरिक्त विधियों का वर्णनमेटास्टेसिस। इस प्रोटोकॉल विभिन्न luminescent और फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ PDXs के कई प्रकार के कैंसर के साथ ही जीन अभिव्यक्ति (यानी, shRNA ब्याज की जीन की पछाड़ना) के मॉडुलन लेबलिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में पशुओं के उपयोग की आवश्यकता होती है सभी कदम कोलोराडो पशु अनुसंधान आचार समिति के विश्वविद्यालय (IACUC) के दिशा-निर्देशों का पालन करती है।

1. उपकरण, संस्कृति, मीडिया और अन्य अभिकर्मकों की तैयारी

  1. (: 1 1), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF, 20 एनजी / एमएल), epidermal वृद्धि कारक (EGF, 10 एनजी / एमएल तैयार 100 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम और हान के एफ 12 मध्यम (DMEM / F12) युक्त मीडिया mammosphere ), हेपरिन (4 माइक्रोग्राम / एमएल), 1x B27, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल)। अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ परिस्थितियों में मीडिया और दुकान बनाओ।
  2. उपकला संवर्धन बफर (EEB) पीबीएस पीएच 7.2, 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), 2 मिमी EDTA युक्त तैयार करें। अप करने के लिए 6 महीने के लिए बाँझ फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और दुकान में पाचन बफर के 5 मिलीलीटर aliquots बनाओ। रात ट्यूमर पाचन, पिघलना पाचन बफर से पहले (500 मिलीग्राम प्रति 5 मिलीलीटरट्यूमर) बर्फ पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर। उपयोग करने से पहले 1x एंटीबायोटिक कवकनाशी मिश्रण जोड़ें।
  4. आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए) कम से कम दो संदंश, छुरी और PDXs के विच्छेदन के लिए कैंची।
  5. F12 और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS): 500 मिलीलीटर धोने DMEM युक्त बफर बनाओ। महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। अशेष ट्यूमर प्रति 10 मिलीलीटर ट्यूमर विच्छेदन के दिन।
  6. 4 माइक्रोग्राम बाँझ पानी के साथ / μl में एक polybrene शेयर तैयार करें। फ़िल्टर और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl प्रत्येक, दुकान युक्त ट्यूबों में विभाज्य।

2. उच्च अनुमापांक lentiviral कणों की पीढ़ी Traceable मार्कर का भार उठाते

  1. 18,19 (ट्यूमर के विकास के vivo नज़र रखने के लिए अर्थात्।, GFP और ल्यूक) की खरीद या उच्च अनुमापांक lentiviral एक पत्रकार जीन ले जाने के कणों को उत्पन्न।
    नोट: की एक lentiviral अनुमापांक> 10 8 टीयू / एमएल (मिली लीटर प्रति पारगमन इकाइयों) PDXs के सफल पारगमन के लिए सिफारिश की है। lentiviral पीलेख vesicular stomatitis वायरस (VSV जी), स्तनधारी कोशिकाओं की एक विस्तृत विविधता के पारगमन की अनुमति से एक लिफाफा जी ग्लाइकोप्रोटीन साथ छद्म होना चाहिए।
    नोट: यहाँ पीढ़ी और उच्च अनुमापांक lentiviral कणों का अनुमापन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पर उपलब्ध है www.kottonlab.com । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल वैक्टर pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro और दोहरी प्रमोटर फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W हैं। इस वेक्टर luciferase जीन EF1aL प्रमोटर के बहाव के फेज-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W वेक्टर में, डेरेल Kotton, बोस्टन विश्वविद्यालय के एक प्रकार के उपहार के साथ dsRed जगह से उत्पन्न किया गया था।

3. रोगी व्युत्पन्न Xenografts की पीढ़ी

  1. Immunocompromised चूहों 3,4 के स्तन वसा पैड में प्राथमिक या metastatic स्तन ट्यूमर दाखिल द्वारा स्तन कैंसर से रोगी निकाली गई xenografts (PDX) उत्पन्न करता है। 1 सेमी व्यास की एक अधिकतम सिफारिश आकार में ट्यूमर उत्पन्न के रूप में बड़ा ट्यूमर कर रहे हैं likely परिगलित कोर को रोकने के लिए।
    नोट:। स्थापना और xenografts रोपाई के लिए विस्तृत तरीके DeRose एट अल 18 में वर्णित हैं। > 1 सेमी व्यास ट्यूमर में स्थापित-transplantable PDXs की ग्रोथ immunocompromised इशारा में आरोपण के बाद 4 और 24 सप्ताह के बीच लेता / एस.सी.आई.डी / ILIIrg - / - (एनएसजी), आंतरिक ट्यूमर के विकास दर पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल स्तन कैंसर PDXs के पारगमन का वर्णन करता है, यह किसी भी विट्रो मार्ग में छोटी अवधि के लिए उपयुक्त ट्यूमर का वायरल पारगमन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। छोटी अवधि के लिए PDXs की संवेदनशीलता - इन विट्रो अस्तित्व में (24 से 96 घंटा) प्रत्येक ट्यूमर के लिए स्वाभाविक है और प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए।

4. ट्यूमर विच्छेदन और PDX व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं की हदबंदी

  1. Euthanize सीओ का उपयोग कर 2 साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था के बाद PDX ले जाने चूहों (पशु अनुसंधान आचार समिति के संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें)। एक 0.2% Ch में चूहों डूब1 मिनट के लिए lorhexidine समाधान। एक विच्छेदन बोर्ड के शीर्ष पर एक लापरवाह स्थिति पर माउस सेट, और पिन का उपयोग करने के लिए बोर्ड विस्तारित ऊपरी और निचले अंगों को ठीक करने के लिए।
  2. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करना, एक छुरी का उपयोग ट्यूमर के आसपास त्वचा में कटौती करने के लिए। संदंश की एक सेट के साथ त्वचा खींच और एक साफ छुरी का उपयोग कर ट्यूमर से अलग जब तक ट्यूमर पूरी तरह से अवगत कराया है। संदंश और छुरी का एक स्वच्छ सेट का उपयोग करना, ट्यूमर को हटाने और 5 मिलीलीटर में जगह बर्फ पर मीडिया धो लें।
  3. आगे की प्रक्रिया के लिए एक BLS2 कैबिनेट में विच्छेदित ट्यूमर ले लो। मीडिया निकालें और हांक बैलेंस्ड नमक सोडियम की 10 मिलीलीटर 10 मिमी HEPES (HbSS / Hepes) के साथ संशोधित साथ ट्यूमर कुल्ला, दो बार।
  4. एक बाँझ पूर्व तौला 60 सेमी टिशू कल्चर प्लेट में ट्यूमर गिरा। ट्यूमर ट्यूमर जन अनुमान लगाने के लिए युक्त थाली वजन।
  5. एक छुरी का प्रयोग, आधे में कटौती ट्यूमर तो एक आधे से एक 3 मिमी डिस्क में कटौती और 24 घंटे के लिए 10% formalin के साथ एक कंटेनर में जगह है। की विविधता को सत्यापित करने के लिए इस ऊतक का प्रयोग करेंट्यूमर नमूना (पैतृक PDX)। HBSS / Hepes के 200 μl और छोटी संभव संदंश और एक साफ छुरी का उपयोग कर टुकड़े में शेष ट्यूमर भरती (बाहर सुखाने के लिए ऊतक से बचने के लिए पर्याप्त) जोड़ें।
  6. एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कीमा ट्यूमर स्थानांतरण। ट्यूमर के 100 मिलीग्राम प्रति 1x कवकनाशी-एंटीबायोटिक युक्त पाचन बफर के कम से कम 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: एंटीबायोटिक दवाओं / कवकनाशी के अलावा इन विट्रो में ट्यूमर कोशिकाओं के संक्रमण से बचाता है।
  7. 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए ट्यूमर डाइजेस्ट, 125 पर झटकों - 200 आरपीएम।
    नोट: बढ़ाने से 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान पाचन की क्षमता बढ़ जाती है (अधिक एकल कक्षों समय के साथ), लेकिन यह आम तौर पर बढ़ सेल मौत के साथ है। सबसे ट्यूमर के लिए, के लिए व्यवहार्य अलग कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या में 3 घंटा परिणाम 30 डिग्री सेल्सियस पर पाचन लेबलिंग कदम के लिए आगे बढ़ने के लिए।
  8. पाचन जोड़ने 35 मिलीलीटर (5% FBS के साथ DMEM / F12) धोने मीडिया बंद करो। एक 70 माइक्रोन नायलॉन के माध्यम से फिल्टर एक साफ 50 मिलीलीटर सी में जालonical ट्यूब पचाया नहीं ऊतक निकालने के लिए। 5 मिनट के लिए 400 XG पर छान मीडिया पचा कोशिकाओं से युक्त अपकेंद्रित्र।
  9. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 1 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका lysis बफर में resuspend गोली। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  10. सेल को रोकने के लिए 10 मिलीलीटर धो बफर (F12, 5% FBS DMEM) जोड़ें। दर्रा एक 40 माइक्रोन के नायलॉन के माध्यम से कोशिकाओं गुच्छों को दूर करने के लिए जाल। 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र और बर्फ पर, सतह पर तैरनेवाला हटाने जगह है।
  11. Resuspend 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पचा धो बफर और trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कर दोनों व्यवहार्य और अलाभकारी कोशिकाओं की गिनती। संक्षेप में, कोशिकाओं के 50 μl और trypan नीले रंग के 50 μl मिश्रण और एक hemocytometer का उपयोग trypan नीले रंग को छोड़कर कोशिकाओं की गिनती।
    ध्यान दें: यह कच्चे तेल पाचन उत्पाद PDX से निकाली गई मानव ट्यूमर कोशिकाओं, साथ ही माउस stromal कोशिकाओं में शामिल होंगे (fibroblasts, रक्त कोशिकाओं, आदि।)। पचा कोशिकाओं को अब लेबलिंग (चरण 6) के लिए कार्रवाई की जा सकती है, या मानव कैंसर की कोशिकाओं को वर्णित प्रक्रियाओं में से एक का उपयोग कर समृद्ध बनाया जा सकतारेफरी 5 में।

5. मानव उपकला कैंसर कोशिकाओं का संवर्धन

  1. एक वंश (लिन +) सेल कमी किट 20 का उपयोग माउस stromal कोशिकाओं चूस लेना।
    नोट: अत्यधिक vascularized ट्यूमर और / या उच्च stromal सामग्री जिसमें EpCAM अभिव्यक्ति अज्ञात है या खो दिया है) के साथ ट्यूमर के लिए अनुशंसित।
    1. एक स्वच्छ 5 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में 10 7 व्यवहार्य कोशिकाओं तक का समय लग 5 मिनट के लिए 300 XG पर 2 मिलीलीटर EEB और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट।
    2. 10 7 कोशिकाओं प्रति ठंडा EEB के 40 μl में Resuspend सेल गोली।
    3. 10 7 कोशिकाओं प्रति बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 μl जोड़ें, धीरे pipetting द्वारा मिश्रण और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (कॉकटेल लिन + माउस कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी शामिल हैं) पर सेते हैं।
    4. 10 7 कोशिकाओं प्रति ठंड EEB के 30 μl जोड़ें, धीरे pipetting द्वारा मिश्रण।
    5. धीरे pipetting द्वारा मिश्रण 10 7 कोशिकाओं प्रति विरोधी बायोटिन microbeads के 20 μl जोड़ें और 4 & # पर सेते176; 15 मिनट के लिए सी।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर 3 मिलीग्राम ठंड EEB, सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate। EEB और बर्फ पर जगह के 500 μl में resuspend गोली।
    7. एक चुंबकीय विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में स्तंभ रखें। 0.5 मिलीलीटर उपकला संवर्धन बफर के साथ स्तंभ कुल्ला और इसके माध्यम से ड्रिप के लिए अनुमति देते हैं। स्तंभ बाहर सुखाने के लिए अनुमति न दें।
    8. स्तंभ के तहत एक नई polypropylene संग्रह ट्यूब रखें। धीरे-धीरे स्तंभ पर लेबल कोशिकाओं से युक्त 500 μl जोड़ने (लिन + लेबल की कोशिकाओं चुंबकीय स्तंभ में बनाए रखा जाएगा)। लेबल हटाया गया कोशिकाओं के साथ एक अंश, समृद्ध वंश नकारात्मक (ट्यूमर) सेल अंश का प्रतिनिधित्व के रूप प्रवाह लीजिए।
    9. ईबीबी के 500 μl के साथ स्तंभ कुल्ला 3 बार और कदम 5.1.8 के प्रवाह के रूप में ही ट्यूब में प्रवाह इकट्ठा। बर्फ पर प्रवाह रखें और लेबलिंग कदम (6) के लिए आगे बढ़ें।
    10. वैकल्पिक: चुंबकीय क्षेत्र के बाहर स्तंभ ले लो। एक नए polypropylene ट्यूब के नीचे रखेंऔर EEB के 500 μl, तीन बार जोड़ने और उपलब्ध कराई गई सवार का उपयोग करके लिन + अंश elute।
  2. मानव EpCAM + उपकला कैंसर कोशिकाओं का संवर्धन (एक्सप्रेस के CD326 + और उच्च माउस stromal सामग्री शामिल जाना जाता ट्यूमर के लिए अनुशंसित)।
    1. एक स्वच्छ 5 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में 10 7 व्यवहार्य कोशिकाओं तक का समय लग 5 मिनट के लिए 300 XG पर ठंड EEB और सेंट्रीफ्यूज 2 मिलीलीटर जोड़ें। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट।
    2. 10 7 कोशिकाओं प्रति ठंडा ईबीबी के 60 μl में Resuspend सेल गोली।
    3. 10 7 कोशिकाओं प्रति EpCAM microbeads के 20 μl जोड़ें, धीरे pipetting द्वारा मिश्रण और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर 3 मिलीग्राम ठंड EEB, सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate। EEB के 500 μl में resuspend गोली और बर्फ पर डाल दिया।
    5. एक मिनी विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में स्तंभ रखें। 0.5 मिलीलीटर EEB के साथ स्तंभ कुल्ला और इसके माध्यम से ड्रिप के लिए अनुमति देते हैं। स्तंभ सुखाने के लिए अनुमति न देंबाहर।
    6. स्तंभ के तहत एक नई polypropylene संग्रह ट्यूब रखें। धीरे-धीरे स्तंभ पर लेबल कोशिकाओं से युक्त (EpCAM + लेबल की कोशिकाओं चुंबकीय स्तंभ में बनाए रखा जाएगा) 500 μl जोड़ें। लेबल हटाया गया कोशिकाओं, माउस stromal कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने के साथ एक अंश के रूप में प्रवाह लीजिए।
    7. मुझे बफर के 500 μl के साथ स्तंभ कुल्ला 4 बार और कदम 5.1.8 के प्रवाह के रूप में ही ट्यूब में प्रवाह इकट्ठा।
    8. चुंबकीय क्षेत्र के बाहर स्तंभ ले लो। एक नए polypropylene ट्यूब के नीचे रखें और ME के ​​500 μl बफर, तीन बार जोड़कर EpCAM + अंश elute। मजबूती स्तंभ में सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल कोशिकाओं को बाहर फ्लश। प्रवाह समृद्ध EpCAM + ट्यूमर सेल अंश युक्त लीजिए और बर्फ पर रख। चरण 6 से आगे बढ़ें।

6. PDX व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं के पारगमन

  1. अपकेंद्रित्र 2 मिलीलीटर mammosphere मेडी में 300 GX 5 मिनट और resuspend में ट्यूमर कोशिकाओं को अलगए। 4.11 के रूप में trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना।
  2. तैयार 8 माइक्रोग्राम / एमएल Polybrene (2 शेयर polybrene की मीडिया के प्रति मिलीलीटर μl) युक्त mammosphere मीडिया के 10 मिलीलीटर।
  3. मात्रा 2 एक्स 10 5 व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं के लिए आवश्यक निर्धारित करते हैं। 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, और polybrene युक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर में resuspend गोली। प्लेट 2 एक्स 10 5 व्यवहार्य ट्यूमर प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम पालन टिशू कल्चर प्लेट में कोशिकाओं।
    नोट: यह एक lentiviral वेक्टर के साथ पारगमन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की एक इष्टतम संख्या है।
    चेतावनी! Lentiviral कणों और lentiviral कणों के साथ प्रयोग किया सभी उपभोग्य पुनः संयोजक डीएनए biohazards के लिए संस्थागत प्रक्रियाओं का पालन किया जाना चाहिए।
    नोट: प्राथमिक स्तन कोशिकाओं की Lentiviral पारगमन जोरदार myoepithelial कोशिकाओं जो 21 लेबलिंग के दौरान ल्यूमिनल कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के उप-जनसंख्या के चयन के गरीब लेबलिंग में परिणाम कर सकते हैं पक्ष में है।
    4. <ली> 1 घंटा इस संभावित पूर्वाग्रह 21 के लिए अलग सेल प्राथमिक उप-जनसंख्या को वायरल कणों के बंधन और सही बढ़ाने के लिए पारगमन के लिए पहले के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 म्यू / एमएल neuraminidase के साथ वायरस सेते हैं।
  4. 10 MOI (2 एक्स 10 6 2 एक्स 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए टीयू) पर lentiviral कणों जोड़े यदि PDX-अलग कोशिकाओं लिन + माउस कोशिकाओं से समाप्त या EpCAM + कोशिकाओं में समृद्ध कर रहे हैं। 30 MOI (6 x 10 6 2 एक्स 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए टीयू) पर lentiviral कणों जोड़े यदि गैर समृद्ध PDX-अलग कोशिकाओं का उपयोग कर।
    नोट: वृद्धि की MOI भी और कच्चे तेल के अर्क में मृत कोशिकाओं मलबे की बड़ी मात्रा की उपस्थिति में कुशल पारगमन के लिए अनुमति देता है। लेबल हटाया गया कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से रखें व्यवहार्यता और पारगमन दक्षता के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।
  5. कोशिकाओं के साथ वायरस मिश्रण करने के भंवर। 37 डिग्री सेल्सियस, अप करने के लिए 96 घंटे के लिए 5% सीओ 2 पर सेते हैं। अभिकर्मक के बाद 24 घंटे ताजा mammosphere मीडिया के 500 μl जोड़ें। प्रकोष्ठों attac नहीं होगाप्लेटों के लिए ज, मीडिया aspirate नहीं है।

7. immunocompromised चूहों में पारगमन दक्षता और लेबल की कोशिकाओं के पुन: आरोपण का मूल्यांकन

  1. मिल मार्कर (GFP) हर 24 घंटा 10X बढ़ाई पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग की अभिव्यक्ति की निगरानी।
    नोट: GFP अभिव्यक्ति के संक्रमण के बाद के रूप में जल्दी के रूप में 24 मानव संसाधन मनाया जा सकता है लेकिन सबसे PDXs में GFP अभिव्यक्ति 72 घंटा (चित्रा 1) के बाद स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है।
  2. कुल अच्छी तरह से भीतर GFP + कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकन द्वारा पारगमन की दक्षता का अनुमान है।
    नोट: चूंकि संस्कृतियों विभिन्न डिग्री पर ट्यूमर कोशिकाओं, अवशिष्ट stromal कोशिकाओं, और मृत कोशिकाओं होते हैं, के रूप में कम के रूप में 10% + GFP कोशिकाओं के साथ कुओं एक मेजबान माउस में प्रत्यारोपित किया जा सकता है।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 6 अच्छी तरह से प्लेटों से transduced कोशिकाओं स्थानांतरण। mammosphere मीडिया के 1 मिलीलीटर अच्छी तरह से करने के लिए जोड़े सभी कोशिकाओं को पीछे छोड़ दिया है इकट्ठा करने के लिए। बर्फ पर रखें।
  4. transduced कोशिकाओं और सी के लिए HBSS / HEPES के 10 मिलीलीटर जोड़ें5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 XG पर entrifuge। ध्यान से बर्फ पर 50 μl तहखाने मैट्रिक्स निकालने (बीएमई) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend aspirate।
    नोट: बीएमई aliquots, बर्फ पर thawed किया जाना चाहिए 1 - 2 के मानव संसाधन का उपयोग करने से पहले। बीएमई कमरे के तापमान पर स्थिर करना होगा; हर समय बर्फ पर रहते हैं।
  5. एक 0.5 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में बीएमई एम्बेडेड कोशिकाओं लोड, बर्फ पर रखने के लिए, और एनएसजी चूहों में reimplantation के लिए जानवरों की सुविधा के लिए ले आओ।
  6. 8 सप्ताह पुरानी एनएसजी चूहों, 5% isoflurane / 95% 5min के लिए ऑक्सीजन, 2% isoflurane / 98% ऑक्सीजन या अनुमोदित पशु अनुसंधान अनुमोदित प्रोटोकॉल नैतिकता के अनुसार द्वारा बाद का उपयोग - महिला 4 anesthetize।
  7. जब जानवर दर्द उत्तेजनाओं (पैर के अंगूठे चुटकी) के लिए अनुत्तरदायी है, इथेनॉल पोंछे द्वारा पीछा किया betadine के साथ इंजेक्शन के क्षेत्र को साफ, और 4 वें स्तन वसा पैड में कोशिकाओं के 50 μl इंजेक्षन। के रूप में अनुमोदित प्रोटोकॉल में संकेत इंजेक्शन परेशानी को दूर करने के लिए पीड़ानाश के साथ चूहों प्रदान करें।
  8. कोशिकाओं को ट्यूमर के रूप में करने की अनुमति दें (2 - 12 सप्ताह) और GFP पर नजर रखने और / याluciferase गतिविधि एक tunable प्रकाश प्रणाली और / या विवो luciferase इमेजिंग प्रणाली में (चित्रा 2) का उपयोग कर।
    ध्यान दें: के रूप में संस्थागत पशु अनुसंधान आचार समिति ने मंजूरी दे दी संज्ञाहरण, पीड़ाशून्यता, ट्यूमर बोझ मापन और इच्छामृत्यु मानदंडों के लिए दिशा-निर्देशों का पालन करें।

8. लेबल PDXs की गुणवत्ता नियंत्रण

  1. लेबल ट्यूमर में luciferase और GFP अभिव्यक्ति का आकलन करने से लेबलिंग की क्षमता का निर्धारण।
    नोट: पालन करें संस्थागत पशु अनुसंधान आचार समिति में विवो bioluminescence इमेजिंग के लिए प्रक्रियाओं (आंकड़े 2, 3) को मंजूरी दे दी।
    1. euthanized चूहों से ट्यूमर काटना जब ट्यूमर का आकार 1.0 पर पहुंच गया है - 1.5 सेमी व्यास (या अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार, 4 में वर्णित के रूप में पहले)। विच्छेदन एक tunable प्रकाश प्रणाली (या समकक्ष प्रणाली है कि GFP प्रतिदीप्ति मूल्यांकन अनुमति देता है) के तहत किया जाना चाहिए।
    2. प्रत्येक ट्यूमर से, गुणात्मक पीई का अनुमान+ GFP ट्यूमर माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का rcentage। तो कम से कम 100%, काटना + GFP भाग ही। एक 3 मिमी डिस्क काटना और आयल एम्बेडिंग और histological विश्लेषण के लिए 10% formalin में ठीक, शाही सेना या अन्य वांछित विश्लेषण के लिए एक छोटा सा टुकड़ा बचाने के लिए, और 90% FBS / 10% से युक्त व्यक्ति 1.5 मिलीलीटर cryotubes में संभव के रूप में ट्यूमर के रूप में ज्यादा बचाने के cryopreservation के लिए DMSO।
  2. नई प्राप्तकर्ता एनएसजी चूहों 18 में लेबल ट्यूमर के पुन: प्रत्यारोपण टुकड़े का विस्तार और प्रायोगिक मेटास्टेसिस पढ़ाई में उपयोग करें।
  3. आयल एम्बेडेड ऊतक ट्यूमर से पारगमन से पहले और हर पीढ़ी पर प्राप्त की मानक immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन करना उसके बाद सत्यापित करें कि लेबल PDXs histologically मूल PDXs के समान रहने के लिए।
    नोट: गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल मार्कर प्रत्येक PDXs साथ बदलती हैं। स्तन कैंसर PDXs, एस्ट्रोजन रिसेप्टर की अभिव्यक्ति, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर, epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2), epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 1 (HER1 या EGFR), पा के लिएएन cytokeratin (अखिल सी.के.) प्रारंभिक जांच के लिए सिफारिश कर रहे हैं।

9. लेबल PDXs साथ प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल

  1. कदम धारा 4 में वर्णित के बाद, एक लेबल PDX से ट्यूमर कोशिकाओं को अलग कर देना। अगर ट्यूमर अत्यधिक vascularized या माउस स्ट्रोमा में समृद्ध है, कैंसर की कोशिकाओं के संवर्धन 4.5 या 4.6 में वर्णित के रूप में प्रदर्शन करते हैं।
  2. Trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना, और 100 μl पीबीएस में 250,000 कोशिकाओं को कमजोर (सीए 2, 2 मिलीग्राम + मुक्त) चूहों प्रति। बर्फ पर कोशिकाओं रखें। कई चूहों के इंजेक्शन के लिए, संख्या के हिसाब से समायोजित (और pipetting त्रुटियों के लिए खाते में कम से कम एक अतिरिक्त इंजेक्शन की एक अतिरिक्त तैयार)।
  3. उपयुक्त पशु प्रक्रिया के कमरे में बर्फ पर कोशिकाओं को लाने और अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार इंट्रा-हृदय इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: कैंसर की कोशिकाओं की इंट्रा-हृदय इंजेक्शन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल कहीं और 22,23 वर्णित किया गया है।
  4. ट्रैक और मेटास्टेटिक योंbioluminescent इमेजिंग का उपयोग समय के साथ फैल गया। Bioluminescence और / या शव-परीक्षा 24 पर पृथक अंगों के GFP इमेजिंग (चित्रा 6) का उपयोग कर विभिन्न अंगों पर स्थूल मेटास्टेसिस कल्पना।

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Representative Results

इस विधि उच्च अनुमापांक lentiviral वैक्टर pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro और फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-डब्ल्यू का उपयोग PDX-अलग स्तन कैंसर की कोशिकाओं के पारगमन का वर्णन है। ये वैक्टर एक फ्लोरोसेंट मार्कर इन विट्रो में पारगमन की दक्षता का आकलन करने की अनुमति देता है कि संक्रमण (चित्रा 1 ए) के बाद के रूप में जल्दी के रूप में 24 मानव संसाधन एक्सप्रेस,। सबसे PDXs के लिए, GFP की अभिव्यक्ति, संक्रमण (चित्रा 1 बी) के बाद 72 घंटा तक की देरी हो जाएगा इस समय सेल समुच्चय के गठन आमतौर पर मनाया जाता है पर। पारगमन या कच्चे तेल में PDX-अलग कोशिकाओं (लिन + सेल कमी, चित्रा 1 ए का उपयोग कर, यानी) मानव कैंसर कोशिकाओं के लिए समृद्ध बनाने के बाद हासिल किया जा सकता है (चित्रा 1 बी)। ट्यूमर उपकला कोशिकाओं का संवर्धन अत्यधिक vascularized ट्यूमर के लिए सिफारिश की है थे माउस रक्त कोशिकाओं व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं।

विट्रो में सत्यापित है, लेबल की कोशिकाओं एकत्र की है और बाह्य मैट्रिक्स में निलंबित कर दिया और एनएसजी चूहों में फिर से प्रत्यारोपित कर रहे हैं। लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को ट्यूमर है कि bioluminescence या प्रतिदीप्ति (चित्रा 2) का उपयोग कर लगाया जा सकता है पुनर्जन्म। पारगमन दक्षता निम्नलिखित ट्यूमर गठन मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और यह इन विट्रो पारगमन के लिए अलग PDXs की संवेदनशीलता के आधार पर अलग अलग होंगे। एक सफलतापूर्वक लेबल PDX 100% GFP के पास + पहली पीढ़ी के बाद पारगमन (चित्रा 2 बी, सी) और 100% GFP बाद मार्ग के निकट + में रहेगा (चित्रा 3) पर किया जाएगा। हालांकि, कुछ PDXs, GFP + कोशिकाओं (चित्रा 4) के "बद" वितरण दिखाएगा विट्रो पारगमन में एक सबऑप्टिमल का संकेत है। इन मामलों में, ट्यूमर + GFP क्षेत्रों है कि लेबल subpop के विस्तार के लिए फिर से प्रत्यारोपित किया जा सकता चयन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति देखने प्रणाली के तहत विच्छेदित किया जा सकताआबादी, या ट्यूमर अलग किया जा सकता है और GFP + कोशिकाओं एनएसजी चूहों में फिर से आरोपण के द्वारा पीछा FACS का उपयोग कर अलग किया जा सकता है।

चूंकि PDX हदबंदी और पारगमन ट्यूमर के भीतर सेल उप-जनसंख्या के चयन में परिणाम कर सकते हैं, जांचकर्ताओं को सत्यापित करें कि लेबल ट्यूमर बारीकी से माता पिता का ट्यूमर, जहां से वे प्राप्त किए गए समान की जरूरत है। PDXs कि महत्वपूर्ण मार्करों ऐसे EGFR, हार्मोन रिसेप्टर्स (यानी, एस्ट्रोजन रिसेप्टर) और अखिल cytokeratins प्रदर्शित करने के लिए हर पीढ़ी में आईएचसी द्वारा दाग होना चाहिए (PanCK, उपकला कोशिकाओं के मार्कर) लेबल PDXs में संरक्षित कर रहे हैं। 5 EGFR के लिए धुंधला से पता चलता चित्रा और एक ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर PDX में panCK (हार्मोन रिसेप्टर धुंधला नहीं दिखाया गया के रूप में इस PDX एस्ट्रोजन और प्रोजेस्ट्रोन रिसेप्टर का अभाव है)।

लेबल PDXs सहज metastatic प्रसार के साथ ही प्रयोगात्मक मेटास्टेटिक ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताकोशिकाओं के संचलन में सीधे बोने से फैल गया। स्तन कैंसर PDXs से सहज मेटास्टेसिस कम अक्सर होती है, लेकिन कई समूहों 3,13,25 द्वारा सूचित किया गया है। मेटास्टेसिस की प्रयोगात्मक मॉडल मेटास्टेटिक झरना में अंग tropism और अंग-उपनिवेशवाद कदम का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प प्रदान करते हैं। लेबल ट्यूमर से अलग कोशिकाओं intracardially इंजेक्ट कर रहे हैं और मेटास्टेटिक बोझ bioluminescent इमेजिंग का उपयोग कर लगाया जाता है। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, एक PDX फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W के साथ transduced फेफड़े और यकृत में 250,000 कोशिकाओं / माउस का गठन मेटास्टेसिस है कि आसानी से अंगों पूर्व vivo में vivo में luciferase इमेजिंग, और GFP अभिव्यक्ति के साथ की पहचान की गई पर इंजेक्शन ।

आकृति 1
चित्रा 1:। Dissociated PDX प्रकोष्ठों में ट्रैकिंग पारगमन दक्षता ए) बी के साथ पारगमन के बाद 24 घंटे के लिए समृद्ध कोशिकाओं) एक अलग प्रयोग से PDX-अलग कोशिकाओं, उपकला कोशिका संवर्धन के बिना, 72 घंटा फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W के साथ पारगमन के बाद। दोनों पैनलों जीवित कोशिकाओं दिखा। बीएफ: उज्ज्वल क्षेत्र छवियों, बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। स्थापना मेजबान चूहों में लेबल PDXs के 72 घंटे के लिए फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W के साथ transduced कोशिकाओं एक महिला एनएसजी माउस के स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया गया। ट्यूमर के बाद इंजेक्शन। ए) luciferase 14 सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी गई थी रिपोर्टर गतिविधि luciferin। बी) GFP अभिव्यक्ति की intraperitoneal इंजेक्शन एक प्रतिदीप्ति को देखने प्रणाली का उपयोग बरकरार त्वचा के माध्यम से देखा जा सकता है बाद में vivo इमेजिंग द्वारा मूल्यांकन किया है। सी) GFP अभिव्यक्ति भी विच्छेदन पर सत्यापित किया जाना चाहिए ट्यूमर लेबलिंग की सीमा निर्धारित करने के लिए। यह उदाहरण सर्वव्यापी व्यक्त GFP ट्यूमर से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: लेबल PDXs एकाधिक मार्ग विवो में बाद Traceable मार्करों रखें एक स्तन कैंसर PDX फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W के साथ लेबल पारगमन के बाद 3 मार्ग दिखाया गया है।। GFP अभिव्यक्ति passaged ट्यूमर में लगभग 100% से कम रहता है।54944 / 54944fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. सबऑप्टिमल पारगमन दक्षता के साथ एक PDXs का उदाहरण है। ए) स्तन कैंसर PDX साथ फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W सबऑप्टिमल पारगमन के बाद जगह ले ली passaged गया था लेबल। जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर GFP + और GFP- ट्यूमर कोशिकाओं के मिश्रित आबादी होते हैं। बाएं ट्यूमर आगे प्रसार के लिए उपयुक्त नहीं है। सही ट्यूमर एक प्रतिदीप्ति देखने प्रणाली के तहत + GFP क्षेत्रों विदारक द्वारा प्रचारित किया जा सकता है। बी) मिश्रित ट्यूमर में GFP + कोशिकाओं के क्षेत्र में आसानी से फ्लोरोसेंट प्रकाश के तहत पहचाना जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5. PDX की गुणवत्ता नियंत्रण सुविधाओं के बाद पारगमन और Passaging। एक ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर PDX F2-7 से आयल एम्बेडेड ऊतकों में EGFR और पान cytokeratin (PanCK) की अभिव्यक्ति पारित होने के 2 पर (p2, पारगमन से पूर्व), ट्यूमर पारगमन (p2-I0) के तुरंत बाद उत्पन्न है, और निम्न बीतने (P2-i1)। 20X छवियों, बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 प्रायोगिक मेटास्टेसिस लेबल PDXs का उपयोग करना। एक PDX व्यक्त फेज-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W 3 घंटा 4 में वर्णित है, और 250,000 कोशिकाओं हम के लिए अलग थाफिर एनएसजी चूहों के बाईं हृदय वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया। ए) Metastatic विकास luminescence इमेजिंग का उपयोग जीवित पशुओं में पता लगाया जा सकता है। यह स्तन कैंसर PDX के metastatic बोझ एक प्रतिदीप्ति देखने प्रणाली के तहत विच्छेदित अंगों के पूर्व vivo इमेजिंग का उपयोग बी) जिगर और सी) फेफड़ों में मनाया जा सकता है। सलाखों के लगभग 1 सेमी। प्रतिनिधित्व यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम:

उच्च अनुमापांक lentiviral कणों के उपयोग (> 10 8 टीयू / एमएल), इस प्रोटोकॉल की सफलता में एक महत्वपूर्ण कदम है इन विट्रो पारगमन के दौरान मीडिया रचना का सावधान नियंत्रण की अनुमति देता है। जबकि उच्च अनुमापांक वायरल कणों के उत्पादन के लिए कई तरीकों अच्छी तरह से वर्णित किया गया है 18,19; इस प्रोटोकॉल lentiviral पर विस्तार से वर्णित के रूप में उत्पादित कणों का उपयोग करता www.kottonlab.com । ट्यूमर के पाचन और कैंसर की कोशिकाओं की हदबंदी के लिए एक सौम्य विधि सफल लेबलिंग और लेबल ट्यूमर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। तीन घंटे से परे पाचन समय तक या 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान में वृद्धि पाचन अलग कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन सबसे ट्यूमर में सेल व्यवहार्यता और लेबलिंग की सफलता कम हो जाती है।

संशोधन और समस्या निवारण:

इस प्रोटोकॉल गतिशील विचार किया जाना चाहिए और हर कदम पर सावधान निगरानी के साथ अद्वितीय PDX के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है। इस मानक प्रोटोकॉल सबसे xenografted ट्यूमर के लिए अच्छी तरह से काम करता है, छोटे बदलाव विभिन्न PDXs की लेबलिंग अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, बहुतायत और स्ट्रोमा और बाह्य मैट्रिक्स की संरचना आमतौर पर PDXs के बीच मतभेद है, जो समय हदबंदी और उसके बाद प्राप्त ट्यूमर कोशिकाओं की उपज के लिए आवश्यक प्रभावित कर सकते हैं। बड़े ट्यूमर है कि परिगलित और अत्यधिक vascularized ट्यूमर बनने के मलबे और अत्यधिक माउस रक्त कोशिकाओं के कारण लेबल करने के लिए मुश्किल हो सकता है। लिन + कमी और उपकला EpCAM + सेल संवर्धन इस प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग इस तरह PDXs में पारगमन की दक्षता में सुधार। सेल संवर्धन के लिए विधि के रूप में उपयोग करने से पहले हालांकि, EpCAM + कोशिकाओं की अभिव्यक्ति इस तरह अपनी अभिव्यक्ति प्रत्येक PDX में सत्यापित किया जाना चाहिए, उपकला मूल से ट्यूमर में भी बदलता रहता है।

Limitaतकनीक का माहौल:

अलग कोशिकाओं और इन विट्रो में उनके अस्थायी संस्कृति का पारगमन सेल उप-जनसंख्या है, जो तब लेबल ट्यूमर मौलिक माता पिता से अलग PDXs को जन्म देगा के चयन में परिणाम सकता है। Neuraminidase साथ lentiviral कणों के पूर्व ऊष्मायन, सेल उप-जनसंख्या 21 transduce के लिए मुश्किल करने के लिए वायरल कणों के बंधन में वृद्धि करने के लिए इस प्रकार पारगमन पूर्वाग्रह है कि इस कदम पर पेश किया जा सकता को कम करने की सिफारिश की है। हमारे अनुभव में, transduced कोशिकाओं द्वारा पुनर्गठित ट्यूमर बारीकी से न केवल histologically पैतृक PDXs की सुविधाओं जैसे लगते हैं, लेकिन यह भी mRNA अभिव्यक्ति की श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग विश्लेषण (आरएनए seq, नहीं दिखाया डेटा) का उपयोग कर। लेबलिंग दक्षता और ट्यूमर निष्ठा के मामले में गुणवत्ता नियंत्रण हर पारित होने पर प्रत्येक PDX के लिए किया जाना चाहिए। चूंकि PDX लेबलिंग विवो और ट्यूमर बहाव में ट्यूमर के विस्तार की आवश्यकता को दोहराया पी के बाद हो सकता हैassaging, पारगमन जल्द से जल्द पारित होने से संभव पर किया जाना चाहिए।

तकनीक का महत्व:

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे स्तन कैंसर PDXs fluorescently एक bioluminescently इन विट्रो में लेबल और ओर्थोटोपिक और metastatic ट्यूमर के विकास की ट्रैकिंग के लिए विवो में फिर से प्रत्यारोपित किया जा सकता है। पूर्व के अध्ययन के लिए एक समान रणनीति PDX व्युत्पन्न organoids 18 लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया है, वहीं मौजूदा प्रोटोकॉल ट्यूमर पाचन और लेबलिंग में बदलाव है कि कई PDXs के एक उच्च पारगमन दक्षता में परिणाम भी शामिल है।

भविष्य अनुप्रयोगों या इस तकनीक के माहिर के बाद दिशाओं:

स्थिरतापूर्वक मिल मार्कर (GFP, luciferase) को व्यक्त करने के लिए, और overexpress या विशिष्ट जीन पछाड़ना करने की क्षमता (यानी, pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro shRNAs वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) PDXs के उपयोग के बारे में मौलिक सवालों के जवाब देने की अनुमति देता हैट्यूमर के विकास और एक समान फैशन में मेटास्टेसिस स्थापित सेल लाइनों के लिए। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल में लेबल PDXs के उपयोग मेटास्टेटिक झरना में अंग-उपनिवेशवाद कदम का अध्ययन करने को दर्शाता है। विभिन्न अंगों को मेटास्टेसिस आसानी से कल्पना की जा सकती है और जीवित पशुओं में bioluminescent इमेजिंग का उपयोग मात्रा, और GFP अभिव्यक्ति निर्देशित विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया और excised अंगों में मेटास्टेसिस कल्पना। यह मेटास्टेसिस अनुसंधान के लिए PDXs के उपयोग की सुविधा के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रतिनिधित्व करता है।

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Acknowledgments

लेखकों फेज-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W वेक्टर और उच्च अनुमापांक lentiviral इन अध्ययनों में प्रयुक्त उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए बोस्टन विश्वविद्यालय में डॉ डेरेल Kotton धन्यवाद। इस काम डीओडी BCRP W81XWH-11-1-0101 (डीएमसी), एसीएस IRG # 57-001-53 (डीएमसी), NCI K22CA181250 (डीएमसी) और R01 CA140985 (कैस) द्वारा वित्त पोषित किया गया .NCI P30CA046934 केंद्र अनुदान vivo इमेजिंग में समर्थित और टिशू कल्चर कोलोराडो एएमसी के विश्वविद्यालय में कोर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 (1:1) Hyclone SH30023.01
bFGF BD Biosciences 354060
EGF BD Biosciences 354001
Heparin Sigma H4784
B27 Gibco/Thermo Fisher 17504-44
Anti-fungi-antibiotics Hyclone SV30010
Accumax Innovative Cell Technologies AM-105-500 Digestion Buffer
FBS Atlanta Biologicals S11550
HBSS Red Ca2+/Mg2+ free Hyclone SH30031.02
Hepes
10x PBS Hyclone SH30258.01
Cultrex Cultrex 3433-005-01 Basement Matrix Extract (BME)
30 °C shaker NewBrunswick Scientific CO. INC Series 25 Incubator Shaker
70 μm filters Falcon 7352350
scalpels Fisher 22079690
Clorhexidine disinfectant Durvet  NDC# 30798-624-35
Red blood  cell lysis reagent Sigma R7757
Neuraminidase Sigma N7885-1UN
EpCAM (CD326+) microbeads* Miltenyil Biotec 130-061-101
Lineage cell depletion Kit, mouse* Miltenyil Biotec 130-090-858
MiniMACS Separator  Miltenyil Biotec 130-042-102
Mini MACS Magnetic Stand Miltenyil Biotec 130-042-303
MS Columns Miltenyil Biotec 130-042-201 MS or LS columns can be used, adjust to number of cells.
Illumatool Tunable light system Lightools research Various For in vivo fluorescence imaging
Xenogen IVIS200 imaging device Xenogen Various For in vivo luminiscence imaging
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody DAKO M0821 Pan-cytokeratin 
Epidermal Growth factor receptor antibody Cell signaling 4267S EGFR

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References

  1. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
  2. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
  5. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  6. Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
  7. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  8. Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
  9. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
  10. Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
  11. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  12. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
  13. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  14. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  16. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  17. Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
  18. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
  19. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  20. Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
  21. Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
  22. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260 (2012).
  23. Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
  24. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
  25. Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).

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Hanna, C., Kwok, L., Finlay-Schultz, J., Sartorius, C. A., Cittelly, D. M. Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies. J. Vis. Exp. (117), e54944, doi:10.3791/54944 (2016).

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