Summary
Vi beskriver en metode for stabil merking av pasient avledet xenografter (PDXs) med lentiviral partikler uttrykker grønt fluorescerende protein og luciferase journalister. Denne metoden gjør det mulig for sporing vekst av PDXs på det primære stedet, samt å oppdage spontane og eksperimentelle metastaser ved hjelp av in vivo imaging-systemer.
Introduction
Utviklingen av pasient avledet tumorxenotransplantater (PDXs), hvor kirurgisk resected tumorprøver er innpodet direkte inn med svekket immunforsvar mus, har flere fordeler i forhold til standard celle linjer xenograft modeller, og representerer et stort fremskritt i kreftforskning 1,2. PDXs kan opprettholdes og utvides ved suksessive passasjer med minimal endring av de genetiske og biologiske karakteristika for tumor dyrket ved den første passasjen; og mer nøyaktig reflektere svulst heterogenitet enn xenografter avledet fra humane kreftcellelinjer 3-8. Disse modellene er nå mye brukt som en plattform for å tilpasse kreftbehandling 9,10, som en preklinisk plattform i legemiddelutvikling 6,11 og som en eksperimentell verktøy for å studere kreft biologi 4,12.
De fleste PDXs blir implantert og spredte subkutant, som praktisk mulig tillater måling av tumorvekst over tid ved hjelp calipers. derimot, Metastatisk sykdom har vært vanskeligere å modellere ved hjelp PDXs. Spesielt for brystkreft, xenografter med metastaserende kapasitet til ulike organer har blitt beskrevet 3,5,13, men frekvensen av spontan spredning til metastaser er ekstremt lav. Hvor rapportert, identifisering og kvantifisering av metastatisk belastning avhenger i møysommelige histologisk undersøkelse av målorganer post-mortem. Kreftcellelinjer som uttrykker bioluminescent (luciferase, Luc) eller fluoriserende (grønt fluorescerende protein, GFP) genet journalister blir ofte brukt i eksperimentelle modeller av brystkreft metastaser til hjernen, lungene, bein og lever etter intrakardiell, hale-vene, intrafemoral og milten injeksjon 14-16. Selv om disse modellene omgå formidling fra de primære svulster, de er verdifulle for å studere mekanismene for orgel tropisme og metastatisk kolonisering. Imidlertid kan celler avledet fra primære pasientsvulster og PDXs har lav transfeksjon eller transduksjon priser using standard fremgangsmåter. Et alternativ er å etablere PDX-avledede cellelinjer in vitro 17, som kan deretter merkes ved hjelp av konvensjonelle vevskultur protokoller. Denne fremgangsmåten er imidlertid ikke egnet for merking av de fleste PDXs, hvor cellelinje avledning er vanskelig og kan endre fenotypen av cellene. Her presenterer vi en protokoll for transduksjon av PDX-dissosierte tumorceller med lentivirale vektorer som er egnet for in vivo avbildning. I tillegg beskriver vi eksperimentelle metastase ved hjelp intrakardiell injeksjon av dissosierte luc-GFP merket PDX celler hos immunsupprimerte mus.
En grunnleggende protokollen for transduksjon av PDX-dissosierte organoids med gen-reporter som uttrykker lentivirus har tidligere blitt beskrevet 18. I den nåværende protokoll beskriver vi flere metoder for å anrike for humane tumorceller og oppnår nesten 100% effektivitet transduksjon, så vel som anvendelse av merkede PDXs for detektering av eksperimentell brystkreftmetastaser. Denne protokollen kan tilpasses for merking av flere cancertyper PDXs med ulike selvlysende og fluorescerende markører, så vel som modulering av gen-ekspresjon (dvs. shRNA knockdown av gener som er av interesse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trinn som krever bruk av dyr i denne protokollen følger retningslinjene fra University of Colorado dyr forskningsetisk komité (IACUC).
1. Utarbeidelse av instrumenter, Culture Media og andre reagenser
- Fremstille 100 ml mammosphere medium inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagle-medium og Han F-12 medium (DMEM / F12) (1: 1), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal vekstfaktor (EGF 10 ng / ml ), heparin (4 ug / ml), 1x B27, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml). Gjør media i sterile forhold og oppbevares ved 4 ° C i inntil 3 måneder.
- Forbered epitelial anrikning buffer (EEB) inneholdende PBS pH 7,2, 0,5% bovin serum albumin (BSA), 2 mM EDTA. Filter sterilisere og oppbevar ved 4 ° C i opp til 6 måneder.
- Gjør 5 ml porsjoner av fordøyelsen buffer i sterile 15 ml koniske rør og oppbevar ved -20 ° C i flere måneder. Natten før svulsten fordøyelsen, tine fordøyelsen buffer (5 ml per 500 mgtumor) på is ved 4 ° C. Legg 1x antibiotika-antimykotisk blanding før bruk.
- Autoklav (121 ° C i 30 min) minst to tang, skalpell og saks for disseksjon av PDXs.
- Gjør 500 ml vaskebuffer inneholdende DMEM: F12 og 5% føtalt bovint serum (FBS). Oppbevar ved 4 ° C i månedsvis. Delmengde 10 ml pr svulst dagen for svulst disseksjon.
- Forbered en polybrene lager ved 4 ug / ul med sterilt vann. Filter og delmengde inn 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 100 mL hver, butikken ved -20 ° C.
2. generasjon av høy titer Lentiviral Partikler Bæresporbare Markers
- Kjøpe eller genererer høy titer lentivirale partikler som bærer et reportergen (f.eks., GFP og Luc for in vivo sporing av tumorvekst) 18,19.
MERK: En lentiviral titer av> 10 8 TU / ml (transduksjon enheter per milliliter) anbefales for vellykket transduksjon av PDXs. Den lentiviral partiklene bør være pseudotyped med en konvolutt G-glykoproteinet fra vesikulær stomatitt-virus (VSV-G), slik at transduksjon av en rekke forskjellige pattedyrceller.
MERK: Protokollen som brukes her for generering og titrering av høy titer lentiviral partikler er tilgjengelig på www.kottonlab.com . Vektorer som brukes i denne protokollen er pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro og dual promoter fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Denne vektor ble generert ved å erstatte DsRed med luciferase genet nedstrøms EF1aL promoter i fag-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vektor, en slags gave av Darrell Kotton, Boston University.
3. generasjon av pasient-avledet xenografter
- Generer pasient avledet xenografter (PDX) fra brystkreft ved implantering av primær eller metastatisk brystkreft svulster i melkefettpute av immunsupprimerte mus 3,4. Generer svulster på et maksimalt anbefalt størrelse på 1 cm diameter som større svulster er likely å inneholde nekrotiske kjerner.
MERK: Detaljert metoder for å etablere og transplantere xenografter er beskrevet i DeRose et al 18.. Vekst av etablerte-trans PDXs inn> svulster 1 cm diameter tar mellom 4 og 24 uker etter implantasjon i immunsupprimerte NOD / SCID / ILIIrg - / - (NSG), avhengig av iboende svulst vekst. Selv om denne protokollen beskriver transduksjon av brystkreft PDXs, kan den brukes for viral transduksjon av en hvilken som helst tumor egnet for kortvarig in vitro passasje. Sensitiviteten av PDXs til kortsiktig (24-96 timer) in vitro overlevelse er iboende i hver svulst og må bestemmes eksperimentelt.
4. Tumor Dissection og dissosiasjon av PDX-avledet tumorceller
- Avlive mus som bærer PDX å bruke CO 2 innånding fulgt ved halshugging (følg institusjonelle retningslinjer for dyreforsøk etisk komité). Senk mus i en 0,2% Chlorhexidine løsning i 1 min. Sett musen på en liggende posisjon på toppen av en disseksjon bord, og bruker pinner til å fikse den utvidede øvre og nedre lemmer til styret.
- Bruk aseptisk teknikk, bruk en skalpell til å kutte huden rundt svulsten. Trekk huden med et sett av pinsetter og skille det fra svulsten ved hjelp av en skalpell ren inntil tumoren er fullstendig eksponert. Ved hjelp av en ren sett med pinsett og skalpell, fjerne svulsten og legg den i 5 ml vaske media på is.
- Ta preparat svulst i en BLS2 skap for videre behandling. Fjern media og skyll tumor med 10 ml Hank Balanced Salt Sodium modifisert med 10 mM Hepes (HBSS / Hepes), to ganger.
- Slipp tumor i et sterilt forhånd veiede 60 cm vevsdyrkningsplate. Veie plate som inneholder svulsten til å anslå tumormassen.
- Ved hjelp av en skalpell, kutt svulst i to, og deretter klippe en 3 mm plate fra den ene halvdelen og legg den i en beholder med 10% formalin i 24 timer. Bruk av dette vev til å bekrefte heterogenitet avtumorprøve (foreldre PDX). Tilsett 200 ul HBSS / Hepes (nok for å unngå vevet for å tørke ut) og hakke den gjenværende tumor i de minste mulige stykker ved hjelp av tenger og en ren skalpell.
- Overfør den hakkede svulsten inn i et sterilt 50 ml konisk rør. Legg til minst 1 ml fordøyelsen buffer som inneholder 1x antimycotic-antibiotika per 100 mg av tumor.
MERK: Tilsetning av antibiotika / antimykotisk forhindrer kontaminering av tumorceller in vitro. - Fordøye svulst i 3 timer ved 30 ° C, rist ved 125-200 rpm.
MERK: Økende temperatur opp til 37 ° C øker effektiviteten av fordøyelsen (flere enkeltceller over tid), men det er vanligvis ledsaget av øket celledød. For de fleste tumorer, for å fordøyelse ved 30 ° C i 3 timer resulterer i tilstrekkelig antall levedyktige dissosierte celler fortsette til markeringstrinn. - Stopp fordøyelsen tilsette 35 ml vaske media (DMEM / F12 med 5% FBS). Filtrer gjennom et 70 um nylonnett til et rent 50 ml conical røret for å fjerne ufordøyd vev. Sentrifuger filtrerte medier som inneholder fordøyd cellene ved 400 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml røde blodceller lyseringsbuffer. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Tilsett 10 ml vaskebuffer (DMEM: F12, 5% FBS) for å stoppe lysis. Pass celler gjennom en 40 mikrometer nylon mesh for å fjerne klumper. Sentrifuger ved 400 xg i 5 min og fjerne supernatanten, legg på is.
- Resuspender spaltet celler i 5 ml vaskebuffer og telle både levedyktige og ikke-levedyktige celler ved hjelp av trypanblått-eksklusjon. Kort beskrevet blandes 50 ul av celler og 50 ul av trypanblått og telle trypan-blått-ekskluderende celler ved bruk av et hemocytometer.
MERK: Dette urene fordøyelse produktet vil inneholde humane tumorceller avledet fra PDX, samt mus stromale celler (fibroblaster, blodceller, osv.). Fordøyde celler kan nå bli behandlet for merking (trinn 6), eller humane kreftceller kan anrikes ved hjelp av en av fremgangsmåtene som beskrivesi Ref 5.
5. berikelse av menneskelige epithelial kreft celler
- Utarme de mus stromale celler ved hjelp av en avstamning (Lin +) celle uttømming kit 20.
MERK: Anbefalt for høyt vaskularisert svulster og / eller svulster med høy stromal innhold som EpCAM uttrykket er ukjent eller tapt).- Ta opp til 10 7 levedyktige celler i en ren 5 ml polypropylen rør, tilsett 2 ml EEB og sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Pipette av supernatanten helt.
- Resuspender cellepelleten i 40 ul iskald EEB per 10 7 celler.
- Tilsett 10 ul biotin-antistoff-cocktail per 10 7 celler, blandes ved forsiktig pipettering, og inkuber ved 4 ° C i 10 min (cocktail inneholder antistoffer mot Lin + museceller).
- Tilsett 30 ul kald EEB per 10 7 celler, blandes ved forsiktig pipettering.
- Tilsett 20 mL av anti-biotin microbeads per 10 7 celler bland forsiktig pipettering og inkuberes ved 4 & #176 C i 15 min.
- Vask cellene med 3 ml kald EEB, sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. aspirer nøye supernatant. Resuspender pellet i 500 mL av EEB og legg på is.
- Plasser kolonne i det magnetiske felt av en magnetisk separator. Skyll kolonne med 0,5 ml epithelial berikelse buffer og la det dryppe gjennom. Ikke la kolonnen til å tørke ut.
- Plasser en ny polypropylen oppsamlingsrør under kolonnen. Tilsett langsomt 500 ul innehold merkede celler over kolonnen (Lin + merkede celler vil bli beholdt i den magnetiske spalte). Samle effluent som en fraksjon med umerkede celler, som representerer den anrikede linjen negativ (tumor) cellefraksjon.
- Skyll kolonne 3 ganger med 500 mL av EBB og samle avløpet i det samme røret som avløp fra trinn 5.1.8. Hold avløpet på is og videre til merking trinn (6).
- Valgfritt: Ta kolonne utsiden av det magnetiske felt. Plasser en ny polypropylen rør underog eluere LIN + fraksjonen ved å tilsette 500 mL av EEB, tre ganger og ved hjelp av den medfølgende stempelet.
- Anriking av menneskelige EpCAM + epiteliale kreftceller (anbefales for svulster som er kjent for å uttrykke CD326 + og inneholder høy mus stromal innhold).
- Ta opp til 10 7 levedyktige celler i en ren 5 ml polypropylen rør, tilsett 2 ml kald EEB og sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Pipette av supernatanten helt.
- Resuspender cellepelleten i 60 mL av iskald EBB per 10 7 celler.
- Tilsett 20 ul EpCAM-mikroperler pr 10 7 celler, blandes ved forsiktig pipettering, og inkuber ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellene med 3 ml kald EEB, sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. aspirer nøye supernatant. Resuspender pellet i 500 mL av EEB og lagt på is.
- Plasser kolonne i det magnetiske felt av en mini-separator. Skyll kolonne med 0,5 ml EEB og la det dryppe gjennom. Ikke la kolonnen til tørkute.
- Plasser en ny polypropylen oppsamlingsrør under kolonnen. Tilsett langsomt 500 ul innehold merkede celler over kolonnen (EpCAM + merkede celler vil bli beholdt i den magnetiske spalte). Samle avløpsvann som en brøk med umerkede celler, som representerer mus stromale celler.
- Skyll kolonne 4 ganger med 500 ul Buffer ME og samle avløpet i det samme røret som avløp fra trinn 5.1.8.
- Ta kolonne utsiden av det magnetiske felt. Plasser en ny polypropylen rør under og eluere EpCAM + fraksjonen ved å tilsette 500 mL av ME buffer, tre ganger. Spyle ut de magnetisk merkede celler ved fast å skyve stempelet inn i kolonnen. Samle avløpsvann som inneholder beriket EpCAM + tumor cellefraksjon og holde på is. Gå videre til trinn 6.
6. Transduksjon av PDX-avledet tumorceller
- Sentrifuger dissosiert kreftceller 300 gx 5 min og resuspender i 2 ml mammosphere medien. Count levedyktige celler ved hjelp trypan blå utelukkelse som i 4.11.
- Forbered 10 ml mammosphere medier som inneholder 8 mg / ml polybrene (2 ul på lager polybrene per ml media).
- Bestemme volumet som er nødvendig for 2 x 10 5 levedyktige tumorceller. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min, og resuspender pelleten i 2 ml polybren inneholdende medium. Plate 2 x 10 5 levedyktige tumorceller per brønn i en 6-brønns ultra-lav tilslutning vevskulturplate.
MERK: Dette er et optimalt antall celler som kreves for transduksjon med en lentiviral vektor.
OBS! Lentiviral partikler og alle forbruksvarer som brukes med lentiviral partikler bør håndteres ifølge institusjonelle prosedyrer for rekombinant DNA biohazards.
MERK: Lentiviral transduksjon av primære bryst celler favoriserer sterkt korgcellene som kan resultere i dårlig merking av luminal celler og valg av subpopulasjoner av tumorceller under merking 21. <li> Inkuber viruset med 200 mU / ml neuraminidase ved 37 ° C i 1 time før transduksjon for å øke bindingen av viruspartikler til forskjellige primære celle subpopulasjoner, og korrigere for dette potensialet skjevhet 21. - Legg lentiviral partikler på 10 MOI (2 x 10 6 TU i 2 x 10 5 levedyktige celler) hvis PDX-dissosierte celler er oppbrukt fra Lin + museceller eller anriket i EpCAM + celler. Legg lentiviral partikler på 30 MOI (6 x 10 6 TU i 2 x 10 5 levedyktige celler) ved bruk av ikke-beriket PDX-dissosierte celler.
MERK: Den økte MOI gir mulighet for effektiv transduksjon selv i nærvær av store mengder avfall og døde celler i råekstrakter. Hold en brønn med umerkede celler for å tjene som en kontroll for levedyktighet og transduksjon effektivitet. - Swirl å blande virus med celler. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i opp til 96 timer. Legg 500 mL av fersk mammosphere media 24 timer etter transfeksjon. Cellene vil ikke Attact til plater, ikke aspirer media.
7. Evaluering av Transduksjon Effektivitet og Re-implantasjon av merkede celler hos immunsupprimerte mus
- Overvåk uttrykk for sporbar markør (GFP) hver 24. time ved hjelp av et fluorescerende mikroskop på 10X forstørrelse.
MERK: GFP uttrykk kan observeres så tidlig som 24 timer etter smitte, men i de fleste PDXs GFP uttrykk er godt synlig etter 72 timer (figur 1). - Beregne effektivitet transduksjon ved å vurdere den prosentandel av GFP + celler innenfor den totale brønn.
Merk Fordi kulturer inneholder tumorceller, rest stromale celler og døde celler i forskjellige grader, kan brønner med så lav som 10% GFP + celler bli implantert i en vert mus. - Overfør transduserte celler fra seks-brønns plater i et 15 ml konisk rør. Tilsett 1 ml mammosphere media til brønnen for å samle alle cellene etterlatt. Plasser på is.
- Tilsett 10 ml HBSS / hepes til transduserte celler og centrifuge ved 300 xg i 5 min, 4 ° C. aspirere nøye supernatant og resuspender i 50 ul kjeller matrise ekstrakt (BME) på is.
MERK: BME porsjoner må tines på is, 1-2 timer før bruk. BME vil størkne ved romtemperatur; holde på is hele tiden. - Last BME-innebygde celler i en 0,5 ml insulinsprøyte, holde på is, og ta med til dyret anlegget for reimplantasjon i NSG mus.
- Anesthetize kvinnelige 4-8 uker gamle NSG mus, ved hjelp av 5% isofluran / 95% oksygen for 5min, etterfulgt av 2% isofluran / 98% oksygen eller i henhold til godkjente dyre forskningsetikk godkjent protokoll.
- Når dyret er ikke responderer på smertestimuli (tå-pinch), rengjør injeksjon området med betadine fulgt av etanol kluter, og injisere 50 mL av celler i 4. melkefettpute. Gi mus med analgetika å lindre injeksjon ubehag som angitt i godkjent protokoll.
- Tillat celler til å danne svulster (2 - 12 uker) og overvåke GFP og / ellerluciferase-aktivitet ved bruk av en avstembar lys system og / eller in vivo-luciferase-avbildningssystem (figur 2).
MERK: Følg retningslinjene for anestesi, analgesi, tumor byrde målinger og eutanasi kriterier som er godkjent av institusjonelle dyr forskningsetisk komité.
8. Kvalitetskontroll av merket PDXs
- Bestem effektiviteten av merking ved å vurdere luciferase og GFP uttrykk i merkede svulster.
MERK: Følg institusjonell dyr forskningsetisk komité godkjente prosedyrer for in vivo bioluminesens avbildning (figur 2, 3).- Dissekere svulster fra mus avlivet når tumorstørrelsen har nådd 1,0 til 1,5 cm diameter (eller før henhold til vedtatte protokoller, slik som beskrevet i 4). Dissection bør utføres under en fleksibel lys system (eller et tilsvarende system som gjør at GFP fluorescens evaluering).
- Fra hver svulst, kvalitativt anslå percentage av GFP + tumor ved hjelp av mikroskopi. Dersom mindre enn 100%, dissekere bare GFP + parti. Dissekere en mm disk 3 og fikse i 10% formalin for parafin innebygging og histologisk analyse, lagre et lite stykke for RNA eller andre ønskede analyser, og lagre så mye av svulsten som mulig i enkelt 1,5 ml cryotubes inneholder 90% FBS / 10% DMSO for nedfrysing.
- Re-implantat stykker av merket svulst i ny mottaker NSG mus 18 for å utvide og bruke i eksperimentelle metastase studier.
- Utfør standard immunhistokjemisk farging av parafin innebygd vev innhentet fra svulster før transduksjon og hver generasjon etterpå for å kontrollere at merket PDXs forbli histologisk lik den originale PDXs.
MERK: Markørene brukes til kvalitetskontroll variere med hver PDXs. For brystkreft PDXs, ekspresjon av østrogenreseptoren, progesteron-reseptor, epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2), epidermal vekstfaktor-reseptor 1 (HER1 eller EGFR), pan-cytokeratin (pan-CK) anbefales for innledende screening.
9. Experimental metastase Modeller med Merkede PDXs
- Følge trinnene som er beskrevet i kapittel 4, distansere tumorceller fra en merket PDX. Hvis svulsten er svært vaskularisert eller rik på mus stroma, utføre anriking av kreftceller som beskrevet i 4.5 eller 4.6.
- Count levedyktige celler ved hjelp trypan blå eksklusjon, og fortynne 250.000 celler i 100 mL PBS (Ca 2+, Mg 2+ gratis) per mus. Hold celler på is. For injeksjon av flere mus, justerer tallene tilsvarende (og fremstille et overskudd av minst en ekstra injeksjon for å gjøre rede for pipettering feil).
- Ta med celler på is til riktig dyr prosedyre plass og fortsett til intra-hjerte injeksjon i henhold til godkjent IACUC protokollen.
MERK: Detaljert protokoller for intra-hjerte injeksjon av kreftceller har blitt beskrevet andre steder 22,23. - Spor og kvantifisere metastatiskspredt over tid ved hjelp av selvlysende avbildning. Visualiser makroskopiske metastaser på forskjellige organer ved hjelp av bioluminesens og / eller GFP avbildning av isolerte organer ved obduksjon 24 (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden beskriver transduksjon av PDX-dissosierte brystkreft celler med høy titer lentiviral vektorer pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro og fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Disse vektorene uttrykker en fluoriserende markør som gjør det mulig å beregne effektiviteten av overføring in vitro, så tidlig som 24 timer etter infeksjon (figur 1a). For de fleste PDXs, vil ekspresjon av GFP bli forsinket inntil 72 timer etter infeksjon (figur 1b), ved dette tidspunktet dannelsen av celleaggregater er ofte observert. Transduksjon kan oppnås etter å anrike for humane kreftceller (dvs. ved bruk av Lin + celleutarming, figur 1a) eller i rå PDX-dissosierte celler (figur 1b). Anrikning av tumor epitelceller er anbefalt for høyt vaskulariserte svulster var museblodcellene representerer en betydelig prosentandel av det totale antall levedyktige celler.
in vitro, er merkede celler samlet og suspendert i ekstracellulær matriks og gjen implantert i NSG mus. Merkede kreftceller regenerere svulster som kan spores ved hjelp av bioluminesens eller fluorescens (figur 2). Transduksjon effektivitet må vurderes følgende tumordannelse, og den vil variere avhengig av følsomheten av forskjellige PDXs for in vitro transduksjon. En vellykket merket PDX vil være i nærheten av 100% GFP + i det første generasjon etter transduksjon (figur 2b, c) og blir liggende i nærheten av 100% GFP + i etterfølgende passasjer (figur 3). Imidlertid vil noen PDXs vise "usammenhengende" fordeling av GFP + celler (figur 4), noe som indikerer en suboptimal in vitro transduksjon. I disse tilfellene kan tumorene dissekert under et fluorescens-visningssystem for å velge GFP + områder som kan re-implanterte for utvidelse av den merkede SUBPOPgler, eller tumorer kan bli dissosiert og GFP + celler kan bli isolert ved hjelp av FACS, etterfulgt av re-implantering i NSG mus.
Siden PDX dissosiasjon og transduksjon kan resultere i valg av celle subpopulasjoner i svulsten, etterforskere må bekrefte at merket svulster likne foreldre svulster som de ble hentet. PDXs bør være farget av IHC ved hver generasjon å demonstrere at kritiske markører EGFR, hormonreseptorer (dvs. østrogen reseptor) og pan-cytokeratins (PanCK, markører for epitelceller) er bevart i merkede PDXs. Figur 5 viser flekker for EGFR og panCK i en trippel negativ brystkreft PDX (hormonreseptor farging er ikke vist som dette PDX mangler østrogen og progesteron reseptor).
Merkede PDXs kan brukes til å spore spontan metastatisk spredning samt eksperimentelle metastatiskspres ved såing av cellene direkte inn i sirkulasjonen. Spontane metastaser fra brystkreft PDXs oppstår sjeldnere, men har blitt rapportert av flere grupper 3,13,25. Eksperimentelle modeller av metastaser gi et alternativ til å studere orgel tropisme og orgel-kolonisering trinnene i metastatisk kaskade. Celler dissosiert fra merket svulster blir injisert intracardially og metastatisk belastning spores ved hjelp av selvlysende bildebehandling. Som vist i figur 6, en PDX transdusert med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W injisert med 250.000 celler / mus dannet metastaser i lungene og leveren som var lett identifiseres med luciferase avbildning in vivo, og GFP-ekspresjon i organer ex vivo .
Figur 1:. Sporing Transduksjon Effektivitet i Spaltet PDX Cells A) B) PDX-dissosiert celler fra en separat eksperiment, uten epitelcelledifferensiering berikelse, 72 timer etter transduksjon med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Begge panelene viser levende celler. BF: Bright felt bilder, bar representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Etablering av merket PDXs i verts Mus Celler transduced med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W for 72 timer ble implantert i melkefettpute av en kvinnelig NSG mus. Tumoren ble latt vokse i 14 uker etter injeksjon. A) Luciferase reporter aktivitet bedømmes ved in vivo-avbildning etter intraperitoneal injeksjon av luciferin. B) GFP uttrykk kan observeres gjennom intakt hud ved hjelp av et fluorescens visningssystem. C) GFP uttrykk skal også kontrolleres ved disseksjon for å bestemme graden av tumor merking. Dette eksemplet viser allestedsnærværende GFP uttrykke svulst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Merket PDXs Behold Sporbare Markers etter flere passasjer i Vivo En brystkreft PDX merket med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W er vist 3 passasjer etter transduksjon.. GFP uttrykk forblir på nesten 100% i passaged tumor.54944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Eksempel på et PDXs med-optimal Transduksjon effektivitet. A) Brystkreft PDX merket med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W ble passert etter en suboptimal transduksjon fant sted. De resulterende tumorer inneholder blandede bestander av GFP + og GFP- tumorceller. Den venstre tumor er ikke egnet for ytterligere formering. Retten svulst kan formeres ved å dissekere GFP + regionene under en fluorescens visning system. B) kan Regioner av GFP + celler i mixed svulster lett identifiseres under fluorescerende lys. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Kvalitetskontroll av PDX Funksjoner etter Transduksjon og aging. Uttrykk av EGFR og Pan-cytokeratin (PanCK) i parafin innebygd vev fra en trippel negativ brystkreft PDX F2-7 ved passering 2 (P2, før transduksjon), svulsten dannet umiddelbart etter transduksjon (P2-I0), og den følgende passasje (P2-i1). 20X bilder, Barer representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Eksperimentell Metastase Bruke Merkede PDXs. En PDX uttrykker fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W ble dissosiert i 3 timer som beskrevet i fire, og 250.000 celler vire injisert i venstre hjerte ventrikkel NSG mus. A) metastatisk vekst kan spores i levende dyr ved hjelp av luminescens bildebehandling. Metastatisk belastning av denne brystkreft PDX kan observeres i B) lever og lunger C) ved hjelp av ex vivo avbildning av organer dissekert under et fluorescens visningssystem. Barer representerer ca 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinnene i protokollen:
Bruk av høy titer lentiviral partikler (> 10 8 TU / ml) er et kritisk punkt i suksessen til denne protokollen, som tillater nøye kontroll av media sammensetning i løpet av in vitro transduksjon. Mens flere metoder for produksjon av høy-titer viruspartikler har blitt godt beskrevet 18,19; denne protokollen bruker lentivirale partikler produsert som beskrevet i detalj i det www.kottonlab.com . En mild metode for fordøyelsen av svulster og dissosiasjon av kreftceller er avgjørende for vellykket merking og vekst av merket svulster. Forlenge koketiden ut over tre timer eller økning av fordøyelse temperaturen til 37 ° C øker antall dissosierte celler, men avtar celleviabilitet og suksess for merking i de fleste tumorer.
Modifikasjoner og feilsøking:
Denne protokollen bør vurderes dynamisk og krever tilpasning for unike PDX med nøye overvåking på hvert trinn. Selv om dette standard protokoll fungerer godt for de fleste xenopodet svulster, kan små variasjoner være nødvendig å optimalisere merking av forskjellige PDXs. For eksempel, overflod og sammensetningen av stroma og ekstracellulær matriks vanligvis variere mellom PDXs, noe som kan påvirke den tid som er nødvendig for dissosiasjon og utbyttet av tumorceller erholdt etterpå. Store tumorer som blir nekrotiske og høyt vaskulariserte tumorer kan være vanskelig å merke på grunn av rusk og overdreven mus blodceller. Bruken av Lin + utarming og epitelial EpCAM + celle berikelse beskrevet i denne protokollen forbedrer effektiviteten av transduksjon i slike PDXs. Men uttrykk for EpCAM + celler varierer også i svulster fra epitelial opprinnelse, og dermed dens uttrykk må verifiseres i hvert PDX før bruk som metode for celle berikelse.
Limitasjoner av teknikk:
Transduksjon av dissosierte celler og deres midlertidige kultur in vitro kan føre til valg av cellepopulasjoner, som da vil gi opphav til merket svulster fundamentalt forskjellige fra foreldre PDXs. Den pre-inkubering av lentivirale partikler med neuraminidase anbefales for å øke bindingen av viruspartikler til celle subpopulasjoner 21 vanskelige å transdusere, og dermed redusere den transduksjon skjevhet som kan bli innført på dette trinnet. I vår erfaring, svulster rekonstituert av transduced celler ligner egenskapene til foreldre PDXs ikke bare histologisk, men også ved hjelp av hierarkisk clustering analyse av mRNA uttrykk (RNA seq, data ikke vist). Kvalitetskontroll i form av merking effektivitet og tumor troskap skal utføres for hver PDX hver passering. Siden PDX merking krever utvidelse av tumoren in vivo og tumor drift kan forekomme etter gjentatt passaging, transduksjon skal utføres ved første passering mulig.
Betydningen av teknikken:
Denne protokollen beskriver hvordan brystkreft PDXs kan være fluorescerende en bioluminescently merket in vitro og re-implantert in vivo for sporing av orthotopic og metastatisk tumorvekst. Mens tidligere studier har benyttet en lignende strategi for å merke PDX-avledede organoids 18, omfatter den aktuelle protokoll variasjoner i tumor fordøyelse og etiketten som resulterer i en høy virkningsgrad transduksjon av flere PDXs.
Fremtidige applikasjoner eller retninger etter å mestre denne teknikken:
Evnen til å stabilt uttrykke spormarkører (GFP, luciferase), og for å overuttrykker eller knockdown spesifikke gener (dvs. pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro kan brukes til å levere shRNAs) tillater bruk av PDXs for å svare på spørsmål om fundamentaletumorvekst og metastase i en lignende måte til etablerte cellelinjer. Konkret viser denne protokollen bruk av merket PDXs i eksperimentelle metastase modeller for å studere orgel-kolonisering skritt i metastatisk kaskade. Metastaser til ulike organer kan enkelt visualiseres og kvantifisert ved hjelp av selvlysende bildebehandling i levende dyr, og GFP uttrykk som brukes guidede disseksjoner og visualisere metastaser i skåret organer. Dette representerer et kraftig verktøy for å forenkle bruken av PDXs for metastase forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Darrel Kotton ved Boston University for å gi fag-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vektor og protokoller for høy titer lentiviral produksjon brukt i disse studiene. Dette arbeidet ble finansiert av DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) og R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Senter stipend støttet in vivo avbildning og vev kultur kjerner ved University of Colorado AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M.
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
