Summary
אנו מתארים שיטת תיוג יציב של xenografts נגזרות החולות (PDXs) עם חלקיקי lentiviral להביע כתבי חלבון בלוציפראז ירוקים-ניאון. שיטה זו מאפשרת מעקב צמיחת PDXs המצוי באתר הראשי, כמו גם באיתור גרורות ספונטניות ניסיון באמצעות במערכות הדמית vivo.
Introduction
התפתחות xenografts גידול נגזר החולה (PDXs), שבו ניתוח דגימות גידול resected הן engrafted ישירות לעכברי חיסון נפגע, מציעה מספר יתרונות על פני מודלי xenograft תא-קו רגילים ומייצגת התקדמות גדולה בחקר סרטן 1,2. PDXs יכול להישמר והרחיב על ידי קטעים רצופים עם שינוי מזערי של תכונות גנטיות וביולוגיות של הגידול גדל במעבר הראשון; ועוד לשקף במדויק ההטרוגניות גידול מ xenografts נגזר שורות תאים אנושיים סרטן 3-8. מודלים אלה נמצאים כיום בשימוש נרחב כפלטפורמה אישית בריפוי הסרטן 9,10, בתור פלטפורמה פרה בפיתוח תרופות 6,11 וככלי ניסיוני לחקר הביולוגיה סרטן 4,12.
רוב PDXs מושתל מופץ תת עורי, אשר יתכן מאפשר מדידה של גידול לאורך זמן באמצעות מחוגה. למרות זאתהמחלה, גרורתי כבר יותר קשה מודל באמצעות PDXs. באופן ספציפי לסרטן השד, xenografts עם קיבולת גרורתי לאיברים שונים תואר 3,5,13, אבל התדר של הפצה ספונטנית לאתרים גרורתי הוא נמוך ביותר. איפה דוח זיהוי וכימות של ניטל גרורתי מסתמכים בבדיקה היסטולוגית מייגעת של אברי מטרה שלאחר מוות. שורות תאים סרטניים המבטאים bioluminescent (בלוציפראז, לוק) או פלורסנט (חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) לכתבי גן משמשות בדרך כלל במודל ניסיוני של גרורות סרטן השד למוח, ריאות, עצמות וכבדות לאחר intracardiac, זנב-וריד, intrafemoral הזרקת טחול 14-16. בעוד המודלים האלה לעקוף הפצה מן הגידולים הראשוניים, הם בעלי ערך כדי לחקור את המנגנונים של כמיהות איברי קולוניזציה גרורתית. עם זאת, בתאים שמקורם בגידולים ו PDXs מטופל עיקריים יכולים להיות שיעורי תמרה או transfection נמוך usinנהלים קבועים גרם. חלופה אחת היא להקים שורות תאי PDX-derived במבחנת 17, אשר יכול להיות מתויג מכן באמצעות פרוטוקולים בתרבית רקמה קונבנציונליים. גישה זו לעומת זאת, אינה מתאימה התיוג ביותר PDXs, עבורו גזירת תא אונליין קשה והוא יכול לשנות את הפנוטיפ של התאים. כאן אנו מציגים פרוטוקול התמרה של תאים סרטניים PDX-ניתק עם וקטורים lentiviral מתאים הדמיה in vivo. בנוסף, אנו מתארים גרורים הניסיונות באמצעות הזרקת intracardiac של תאי PDX-GFP לוק שכותרתו ניתקו בעכברי immunocompromised.
פרוטוקול בסיסי עבור התמרה של organoids PDX-ניתק עם lentivirus להביע כתב הגן בעבר תוארה 18. בפרוטוקול הנוכחי אנו מתארים שיטות נוספות להעשיר עבור תאים סרטניים אנושיים ולקבל ליד יעילות התמר 100%, כמו גם את השימוש PDXs שכותרתו לגילוי סרטן השד הניסיוןגרורות. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור תיוג סוגי הסרטן מרובים של PDXs עם סמנים זורחים ניאון שונים כמו גם אפנון של ביטוי גנים (כלומר, shRNA מציאה של גנים של עניין).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הצעדים המחייבים את השימוש בבעלי חיים בפרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ועדת האתיקה במחקר בבעלי חיים קולורדו (IACUC).
1. הכנת מכשירים, מדיה התרבות ריאגנטים אחרים
- הכן 100 מ"ל mammosphere מדיה המכילה בינוני הנשר שונה של Dulbecco והאן של F-12 בינוני (DMEM / F12) (1: 1), פקטור גדילה בסיסי פיברובלסטים (bFGF, 20 ng / ml), גורם הגדילה באפידרמיס (EGF, 10 ng / ml ), הפרין (4 מיקרוגרם / מ"ל), 1x B27, פניצילין (100 U / ml), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל). הפוך מדיה בתנאים ולאחסן סטרילי ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
- הכן חיץ העשרה אפיתל (EEB) המכיל PBS pH 7.2, 0.5% שור סרום אלבומין (BSA), 2 מ"מ EDTA. סנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
- הפוך 5 מ"ל aliquots של חיץ העיכול ב 15 מ"ל סטרילי צינורות חנות חרוטי ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודשים. בלילה שלפני עיכול גידול, חיץ עיכול הפשרה (5 מ"ל לכל 500 מ"גגידול) על קרח, ב 4 מעלות צלזיוס. להוסיף תערובת אנטיביוטיקה antimycotic 1x לפני השימוש.
- חיטוי (121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות) לפחות שני מלקחיים, אזמל ומספריים לנתיחה של PDXs.
- הפוך 500 מיליליטר חיץ לשטוף המכיל DMEM: F12 ו -5% עובריים שור סרום (FBS). חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. Aliquot 10 מיליליטר לכל גידול היום לנתיחת גידול.
- הכינו מלאי polybrene ב 4 מיקרוגרם / μl עם מים סטריליים. סינון aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל 100 μl כל, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
2. דור של חלקיקי Lentiviral כייל גבוהים נשיאת מרקרים לעקיבים
- לרכוש או ליצור חלקיקים lentiviral כייל גבוה נושאת גן הכתב (כלומר., GFP ולוק למעקב in vivo של הגידול) 18,19.
הערה: כייל lentiviral של> 10 8 TU / ml (יחידות התמרו למיליליטר) מומלצת עבור התמרה מוצלחת של PDXs. Lentiviral pמאמרים צריכים להיות Pseudotyped עם גליקופרוטאין G מעטפה מפני וירוסי Stomatitis שלפוחי (VSV-G), המאפשר תמרה של מגוון רחב של בתאי יונקים.
הערה: הפרוטוקול משמש כאן עבור הדור ואת טיטרציה של חלקיקי lentiviral כייל גבוה זמין בכתובת www.kottonlab.com . וקטורים שימוש בפרוטוקול זה הם pSIH1-H1-copGFP-T2a-פורו ואת כפול מקדם הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP-W. וקטור הזה נוצר על ידי החלפת dsRed עם הגן בלוציפראז במורד הזרם של האמרגן EF1aL ב וקטור הפאג-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W, מתנה סוג של דארל קוטון, אוניברסיטת בוסטון.
3. דור של xenografts נגזרות החולות
- צור xenografts נגזר החולה (PDX) מסרטן השד באמצעות השתלת גידולים בשד ראשוני או גרורתי בפנקס שומן החלב של עכברים immunocompromised 3,4. צור גידולים בגודל מקסימאלי מומלץ בקוטר 1 סנטימטר כפי גידולים גדולים הם likely להכיל ליבות נמקי.
הערה: פרטני שיטות לקביעתם השתלת xenografts מתוארות דה-רוז ואח 18.. צמיחה של PDXs להשתלה מבוססת לתוך> גידולים 1 ס"מ קוטר לוקח בין 4 ו -24 שבועות לאחר ההשתלה NOD מדוכאי חיסון / SCID / ILIIrg - / - (NSG), תלוי שיעורי צמיחת הגידול המהותי. בעוד פרוטוקול זה מתאר תמרה של PDXs סרטן השד, ניתן להשתמש בו עבור תמרה ויראלית של כל גידול מתאים לטווח קצר מעבר במבחנה. הרגישות של PDXs כדי לטווח קצר (24 - 96 שעות) בהישרדות במבחנה היא מהותית לכל גידול צריך להיקבע באופן ניסיוני.
4. גידול Dissection ו דיסוציאציה של תאים סרטניים שמקורם PDX
- עכברים להרדים נושאת PDX באמצעות CO 2 משאיפת ואחריו נקע בצוואר רחם (פעלו בהתאם להנחיות מוסדיות של ועדת אתיקה במחקר בבעלי חיים). לצלול עכברים% 0.2 Chפתרון lorhexidine דקות 1. גדר עכבר על שכיבה על גבי קרש חיתוך, ולהשתמש סיכות כדי לתקן את הגפיים עליונים ותחתונים המורחבים ללוח.
- באמצעות טכניקה האספטי, ובעזרת אזמל לחתוך את העור סביב הגידול. משוך את העור עם סט של מלקחיים להפריד אותו מן הגידול באמצעות אזמל נקי עד הגידול נחשף לחלוטין. באמצעות סט נקי של מלקחי אזמל, להסרת הגידול ולמקם אותו ב 5 מיליליטר לשטוף תקשורת על קרח.
- קח גידול גזור לתוך ארון BLS2 לעיבוד נוסף. הסר מדיה ולשטוף הגידול עם 10 מ"ל של נתרן מלח מאוזן של האנק השתנה עם 10 מ"מ Hepes (HBSS / Hepes), פעמיים.
- זרוק את הגידול בצלחת בתרבית רקמה טרום שקל סטרילית 60 ס"מ. לשקול את הצלחת המכילה את הגידול להעריך מסת גידול.
- באמצעות אזמל, לחתוך את הגידול לשניים, ואז לחתוך דיסק 3 מ"מ מחצי אחד ומניחים אותו בתוך מכולה עם פורמלין 10% למשך 24 שעות. השתמש רקמה זו כדי לאמת את ההטרוגניות שלבמדגם גידול (הורי PDX). הוסף 200 μl של HBSS / Hepes (מספיק כדי למנוע את הרקמות להתייבש) ו לרכך את הגידול שנותר החתיכות הקטנות ביותר האפשריות באמצעות מלקחי אזמל נקי.
- מעבירים את הגידול טחון לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי. הוסף לפחות 1 מ"ל של חיץ העיכול המכיל 1x antimycotic-אנטיביוטיקה לכל 100 מ"ג של הגידול.
הערה: תוספת של אנטיביוטיקה / antimycotic מונעת זיהום של תאים סרטניים במבחנה. - תקציר גידול עבור 3 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, רועד ב 125 - סל"ד 200.
הערה: הגדלת הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס מגביר את היעילות של מערכת העיכול (תאים בודדים יותר לאורך זמן), אבל זה בדרך כלל מלווה מוות של תאים מוגברת. עבור רוב הגידולים, עיכול ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 תוצאות hr בכמות מספקת של תאים ניתק קיימא כדי להמשיך לשלב תיוג. - עצור את מערכת העיכול הוספת 35 מ"ל לשטוף התקשורת (DMEM / F12 עם 5% FBS). סינון דרך ניילון 70 מיקרומטר רשת לתוך ג 50 מ"ל נקיצינור onical להסרת רקמה מעוכלת. צנטריפוגה התקשורת המסוננת המכילה תאים מתעכלים ב 400 XG במשך 5 דקות.
- supernatant ו resuspend גלולה לשאוב ב 1 מ"ל חיץ תמוגה תא דם אדום. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף 10 מ"ל לשטוף חיץ (DMEM: F12, 5% FBS) להפסיק תמוגה. Pass תאים דרך ניילון 40 מיקרומטר Mesh כדי להסיר גושים. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר supernatant, ומניחים על קרח.
- Resuspend מתעכל תאי 5 מיליליטר חיץ לשטוף ולספור הן תאי קיימא ושאינו קיימא באמצעות הרחקת trypan כחולה. בקצרה, לערבב 50 μl של תאים ו -50 μl של trypan כחול ולספור תאים trypan כחול למעט באמצעות hemocytometer.
הערה: מוצר עיכול הראשוני הזה יכיל תאים סרטניים אנושיים נגזרים PDX, כמו גם בתאי סטרומה עכבר (פיברובלסטים, תאי דם, וכו '.). תאים מתעכלים ניתן לעבד תיוג (שלב 6), או תאים סרטניים אנושיים יכולים להיות מועשרים באמצעות אחד מההליכים המתואריםנ"צ 5.
5. העשרה של תאים סרטניים אנושיים אפיתל
- לרוקן את תאי עכבר סטרומה באמצעות שושלת (Lin +) ערכת תא דלדול 20.
הערה: מומלץ עבור גידולים vascularized ביותר ו / או גידולים עם תוכן סטרומה גבוה שבה ביטוי EpCAM אינו ידוע או מאבד).- קח עד 10 7 תאים קיימא בתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל נקי, להוסיף 2 מ"ל EEB צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. פיפטה את supernatant לחלוטין.
- גלולה תא גלולה ב 40 μl של EEB קר כקרח לכל 10 7 תאים.
- הוסף 10 μl של קוקטייל ביוטין נוגדנים לכל 10 7 תאים, ומערבבים על ידי pipetting בעדינות דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (קוקטייל מכיל נוגדנים לתאי העכבר לין +).
- הוסף 30 μl של EEB קר לכל 10 7 תאים, ומערבבים על ידי pipetting בעדינות.
- הוסף 20 μl של microbeads אנטי ביוטין לכל 10 7 תאים מערבבים על ידי pipetting בעדינות דגירה על 4 & #176; צלזיוס למשך 15 דקות.
- שטפו תאים עם EEB, צנטריפוגות קר 3 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 500 μl של EEB ומניחים על קרח.
- מקום עמודה בשדה המגנטי של מפריד מגנטי. לשטוף טור עם חיץ העשרה 0.5 מ"ל אפיתל ולאפשר לו לטפטף דרך. אל תאפשר בעמודה להתייבש.
- מניח צינור איסוף הפוליפרופילן חדש תחת העמודה. לאט, מוסיף את 500 μl המכיל תאים שכותרתו על הטור (Lin + שכותרתו תאים יישמרו בעמודה המגנטית). אסוף שפכים כשבר עם תאים ללא תווית, המייצג את שלילית שושלת מועשרת שבריר התא (גידול).
- יש לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 500 μl של גאות לאסוף את השפכים באותו הצינור כפי השפכים של צעד 5.1.8. שמור שפכים על קרח והמשיכו לשלב תיוג (6).
- אופציונאלי: קח את הטור מחוץ לשדה המגנטי. מניחים צינור פוליפרופילן חדש מתחתו elute השבר LIN + על ידי הוספת 500 μl של EEB, שלוש פעמים באמצעות הבוכנה מסופק.
- העשרה של תאים סרטניים אנושיים EpCAM + אפיתל (מומלץ עבור גידולים הידועים להביע CD326 + ומכיל תוכן סטרומה עכבר גבוה).
- קח עד 10 7 תאים קיימא בתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל נקי, להוסיף 2 מ"ל EEB צנטריפוגות קר בבית XG 300 במשך 5 דקות. פיפטה את supernatant לחלוטין.
- גלולה תא גלולה ב 60 μl של גאות קר כקרח לכל 10 7 תאים.
- הוסף 20 μl של microbeads EpCAM לכל 10 7 תאים, ומערבבים על ידי pipetting בעדינות דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- שטפו תאים עם EEB, צנטריפוגות קר 3 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 500 μl של EEB ולשים על הקרח.
- מקום עמודה בשדה המגנטי של מפריד מיני. לשטוף טור עם EEB 0.5 מ"ל ולאפשר לו לטפטף דרך. אל תאפשרו בעמודה להתייבשהַחוּצָה.
- מניח צינור איסוף הפוליפרופילן חדש תחת העמודה. לאט, מוסיף את 500 μl המכיל תאים שכותרתו על הטור (תאי EpCAM + שכותרתו יישמרו בעמודה המגנטית). אסוף שפכים כשבר עם תאים ללא תווית, המייצגים את תאי סטרומה עכבר.
- יש לשטוף את העמודה 4 פעמים עם 500 μl של ME הצפת לאסוף את השפכים באותו הצינור כפי השפכים של צעד 5.1.8.
- קח את הטור מחוץ לשדה המגנטי. מניחים צינור פוליפרופילן חדש מתחת ו elute EpCAM + חלק על ידי הוספת 500 μl של חיץ ME, שלוש פעמים. לשטוף את התא המגנטי שכותרתו ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה. אסוף קולחים אשר מכילים תא EpCAM + גידול המועשר בשבריר ולשמור על קרח. עבור לשלב 6.
6. התמרה של תאים סרטניים שמקורם PDX
- צנטריפוגה ניתק תאים סרטניים ב 300 GX 5 דקות ו resuspend ב 2 מ"ל mammosphere Mediא. ספירת תאי קיימא באמצעות הרחקת trypan כחולה כמו 4.11.
- כן 10 מיליליטר של תקשורת mammosphere המכילה 8 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene (2 μl של polybrene מניות לכל מיליליטר של תקשורת).
- לקבוע את נפח הדרושים 2 x 10 5 תאים סרטניים קיימא. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות, ו resuspend גלולה ב 2 מ"ל של התקשורת המכיל polybrene. פלייט 2 x 10 5 תאים סרטניים קיימא לכל היטב צלחת תרבות 6 היטב נמוכה במיוחד הדבקות רקמות.
הערה: זהו מספר אופטימלי של תאי דרושים התמרנו עם וקטור lentiviral אחד.
זהירות! חלקיקים Lentiviral וכל מתכלים לשימוש עם חלקיקים lentiviral צריכים להיות מטופלים בעקבות הליכים מוסדיים biohazards DNA רקומביננטי.
הערה: תמרת Lentiviral של תאי שד ראשוניים טובה תאי myoepithelial מאוד אשר עלול לגרום תיוג עני של תאי luminal וגיוס כוח תת-האוכלוסיות של תאים סרטניים במהלך תיוג 21. <li> דגירה וירוס עם 200 mU / ml נורמינידאז על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לפני התמרה להגדיל את הכריכה של חלקיקים נגיפיים כדי subpopulations תא ראשוני שונה ונכון הטיה פוטנציאלית זו 21. - הוסף חלקיקים lentiviral ב -10 מואה (2 x 10 6 TU עבור 2 x 10 5 תאים קיימא) אם תאים ניתק PDX מתרוקנים מתאי העכבר לין + או מועשר בתאי EpCAM +. הוסף חלקיקים lentiviral 30 מואה (6 x 10 6 TU עבור 2 x 10 5 תאים קיימא) אם באמצעות תאים PDX-ניתק הלא מועשר.
הערה: משרד הפנים גדלו מאפשרים תמרה יעילה אפילו בנוכחות של כמויות גדולות של פסולת תאים מתים בתמציות גולמיות. שמור היטב אחד עם תאים ללא תווית כדי לשמש מלא עבור יעילות ויכולת קיום התמרה. - מערבולת לערבב וירוס עם תאים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד 96 שעות. הוסף 500 μl של התקשורת mammosphere טרי 24 שעות לאחר transfection. תאים לא attach צלחות, שלא תשאף תקשורת.
7. הערכת יעילות תמרה ו Re-השתלה של תאים שכותרתו עכברי immunocompromised
- צג ביטוי של הסמן למעקב (GFP) כל 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 10X.
הערה: הביטוי GFP ניתן להבחין מוקדם ככל 24 שעות לאחר ההדבקה אך ברוב PDXs ביטוי GFP נראה בבירור לאחר 72 שעות (איור 1). - להעריך את היעילות של תמרה על ידי הערכת אחוז תאי GFP + בתוך הבאר הכוללת.
הערה: מאז תרבויות מכילות תאים סרטניים, תאי סטרומה שיורית, ותאים מתים בבית בדרגות שונות, בארות עם נמוך כמו 10% GFP + תאים אפשר להשתיל עכבר מארח. - העבר תאים transduced מ 6-גם צלחות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של התקשורת mammosphere אל הבאר כדי לאסוף את כל התאים נשאר מאחור. מניחים על קרח.
- הוסף 10 מ"ל של HBSS / HEPES לתאים transduced ו- Centrifuge ב XG 300 במשך 5 דקות, 4 ° C. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend בתמצית מטריקס במרתף 50 μl (BME) על קרח.
הערה: aliquots BME חייב להיות מופשר על קרח, 1 - 2 שעות לפני השימוש. BME יהיה לגבש בטמפרטורת החדר; לשמור על הקרח בכל עת. - טען תאים BME-מוטבע לתוך מזרק 0.5 מ"ל אינסולין, ולשמור על הקרח, ולהביא למתקן בעלי חיים שתילתם מחדש לעכברים NSG.
- להרדים 4 נקבה - 8 שבוע עכברים NSG הישן, באמצעות חמצן 5% isoflurane / 95% עבור 5min, ואחריו 2% isoflurane / 98% חמצן או על פי האתיקה במחקר בבעלי חיים אושרה פרוטוקול שאושר.
- כאשר החיה אינה מגיב לגירויי כאב (בוהן קמצוץ), לנקות את האזור הזרקה בבטאדין ואחריו מגבונים אתנול, ולהזריק את 50 μl של תאי כרית שומן 4 th חלב. ספק עכברים עם שיכוך כאבים כדי להקל נוחות הזרקה כמצוין פרוטוקול שאושר.
- אפשר תאים כדי ליצור גידולים (2 - 12 שבועות) ולנטר GFP ו / אופעילות בלוציפראז באמצעות מערכת אור מתכוננת ו / או במערכת ההדמיה בלוציפראז vivo (איור 2).
הערה: פעל בהתאם להנחיות עבור הרדמה, שיכוך כאבים, מדידות נטל הגידול וקריטריונים המתת חסד כפי שאושר על ידי ועדת האתיקה במחקר בבעלי חיים מוסדיים.
8. בקרת איכות של PDXs תווית
- לקבוע את היעילות של תיוג על ידי ההערכה בלוציפראז וביטוי GFP בגידולים שכותרתו.
הערה: בצע ועדת אתיקה במחקר בבעלי חיים מוסדיים מאושרת נהלים ב פליטת אור vivo הדמיה (איורים 2, 3).- לנתח גידולים מעכברים מורדמים כאשר גודל גידול הגיע 1.0 - סנטימטר קוטר 1.5 (או לפני פי פרוטוקולים שאושרו, כמתואר 4). לנתיחה צריכה להתבצע תחת מערכת אור מתכונן (או מערכת מקבילה המאפשרת ערכת קרינת GFP).
- מתוך כל גידול, איכותי להעריך את PErcentage של GFP + הגידול באמצעות מיקרוסקופ. אם פחות מ -100%, לנתח חלק + GFP בלבד. לנתח דיסק 3 מ"מ ולתקן בפורמלין 10% להטבעת פרפין וניתוח היסטולוגית, להציל פיסה קטנה עבור RNA או ניתוחים רצויים אחרים, ולשמור כמה שיותר הגידול ככל האפשר 1.5 בודדי מיליליטר cryotubes המכיל 90% FBS / 10% DMSO עבור cryopreservation.
- חתיכות מחדש שתל של גידול שכותרתו לתוך נמען חדש עכברי NSG 18 להרחיב ולהשתמש במחקרים גרורים הניסיונות.
- בצע סטנדרטי מכתים immunohistochemical של רקמות פרפין מוטבעות המתקבלות גידולים לפני תמרה ובכל דור לאחר מכן כדי לוודא שכותרתו כי PDXs להישאר היסטולוגית דומה PDXs המקורי.
הערה: סמנים המשמשים לבקרת איכות להשתנות עם כל PDXs. לקבלת PDXs סרטן השד, ביטוי של קולטן אסטרוגן, קולטני פרוגסטרון, גורם הגדילה באפידרמיס קולטן 2 (HER2), הקולטן לגורם אפידרמיס הצמיחה 1 (HER1 או EGFR), pan-cytokeratin (פאן-CK) מומלצי סינון ראשוני.
9. מודלים גרורים הניסויי עם PDXs תווית
- ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 4, לנתק תאים סרטניים מתוך PDX שכותרתו. אם הגידול הוא מאוד בכלי דם או עשיר stroma עכבר, לבצע העשרה של תאים סרטניים, כמתואר 4.5 או 4.6.
- ספירת תאים קיימא באמצעות הרחקה trypan כחול, לדלל 250,000 תאים 100 μl PBS (Ca 2+, Mg 2+ חינם) לכל עכברים. שמור את התאים על הקרח. עבור זריקה של עכברים רבים, להתאים את מספרי בהתאם (ולהכין מעודף לפחות זריקה אחת נוספת כדי לקחת בחשבון את שגיאות pipetting).
- תביאו את התאים על הקרח לחדר הליך חיה המתאים והמשך הזרקה תוך הלב על פי פרוטוקול IACUC אושרה.
הערה: פרטני פרוטוקולי הזרקה תוך לב של תאים סרטניים תוארו במקומות אחרים 22,23. - עקוב אחר ולכמת גרורתיהתפשט על פני זמן באמצעות הדמיה bioluminescent. דמיינו גרורות מקרוסקופיות בבית איברים שונים באמצעות פליטת אור ו / או הדמיה GFP של איברים מבודדים necropsy 24 (איור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו מתארת את התמרה של תאים סרטניים בשד PDX-ניתק באמצעות וקטורים lentiviral כייל גבוה pSIH1-H1-copGFP-T2a-פורו ו הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP-W. וקטורים אלה מבטאים בסמן פלורסנטי המאפשר לאמוד את היעילות של תמרה במבחנה, מוקדם ככל 24 שעות לאחר ההדבקה (איור 1 א). עבור רוב PDXs, ביטוי של GFP יעוכב עד 72 שעות לאחר ההדבקה (איור 1b), בשלב זה ההיווצרות של אגרגטים תא הוא ציין נפוצה. תמרה יכולה להיות מושגת לאחר מעשיר תאים סרטניים אנושיים (כלומר, באמצעות דלדול תא לין +, איור 1 א) או ב גולמי PDX-תאים ניתקים (איור 1b). העשרה של תאי אפיתל גידול מומלץ עבור גידולים vascularized ביותר היו תאי דם עכבר מהווים אחוז משמעותי של המספר הכולל של תאי קיימא.
: לשמור-together.within-page = "1"> לאחר יעילות התמרה מאומתת במבחנה, תאים שכותרתו נאספים המרחפים תאי מטריקס ו-מושתל מחדש בעכברים NSG. תאים סרטניים שכותרתו להתחדש גידולים שניתן לעקוב אחריהם באמצעות פליטת אור או פלואורסצנטי (איור 2). יעילות תמרה חייבת להיות מוערכת היווצרות גידול הבאה, וזה ישתנה בהתאם הרגישות של PDXs השונה התמר במבחנה. שכותרתו בהצלחה PDX יהיה קרוב ל- 100% GFP + ב הדור הראשון שלאחר התמרה (איור 2b, ג) ויישאר קרוב ל- 100% GFP + בקטעים הבאים (איור 3). עם זאת, חלק PDXs נראה הפצה "במקוטע" של GFP + תאים (איור 4), מה שמעיד על לא טוב ב התמר במבחנה. במקרים אלה, גידולים יכולים להיות גזור תחת מערכת צפייה הקרינה לבחור GFP + תחומים שיכולים להיות מחדש מושתל להרחבת subpop שכותרתוulation, או גידולים ניתן ניתק GFP + תאים ניתן לבודד באמצעות FACS ואחריו מחדש ההשתלה בעכברים NSG.
מאז ניתוק תמרת PDX יכולים לגרום הבחירה של תת-אוכלוסיות תאים בתוך הגידול, חוקרים צריכים לוודא כי גידולים שכותרתו דומים גידולי ההורים שממנו הם נשאבו. PDXs צריך להיות מוכתם על ידי IHC בכל דור על מנת להוכיח כי סמנים קריטי EGFR כזה, קולטני הורמון (כלומר, קולטן אסטרוגן) ו-cytokeratins פאן (PanCK, סמנים של תאי אפיתל) שמורים ב PDXs שכותרתו. איור 5 מראה מכתים עבור EGFR ו panCK בתוך PDX שד סרטן משולש שלילי (מכתים הקולטן להורמון אינו מוצג כפי PDX זה חסר אסטרוגן קולטני פרוגסטרון).
PDXs שכותרתו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התפשטות גרורתית ספונטנית וכן גרורתי ניסיונישהפיצו זריעת תאים ישירות לתוך מחזור הדם. גרורות ספונטניות מן PDXs סרטן השד מתרחשות בתדירות נמוכה יותר, אך דווחו על ידי מספר קבוצות 3,13,25. דגמים ניסיוניים של גרורות לספק אלטרנטיבה ללמוד כמיהות איבר וצעדי האיבר-קולוניזציה במפל גרורתי. תאים ניתקו מגידולים שכותרתו מוזרקים intracardially וניטל גרורתי מעקב באמצעות הדמית bioluminescent. כפי שניתן לראות בתרשים 6, PDX transduced עם הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP-W מוזרק 250,000 תאים / יצרו עכבר גרורות הריאות והכבד שזוהו בקלות עם הדמיה בלוציפראז in vivo, וביטוי GFP באיברים vivo לשעבר .
איור 1:. מעקב יעילות התמרה בתאים ניתק PDX א) B) PDX-תאים ניתק מן בניסוי נפרד, ללא העשרה תא אפיתל, 72 שעות לאחר התמרה עם-W הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP. לוחות שניהם להראות תאים חיים. BF: תמונות שדה מוארות, עמודה מייצגת 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. הקמת PDXs תווית עכברים מארח תאים transduced עם הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP-W טוב 72 שעות הושתלו כרית שומן החלב של עכבר NSG הנשי. הגידול הורשה לגדול במשך 14 שבועות לאחר ההזרקה. א) בלוציפראז פעילות כתב נבחנת על ידי הדמית in vivo לאחר הזרקת intraperitoneal ביטוי GFP לוציפרין. B) ניתן לראות דרך העור ללא פגע באמצעות מערכת צפיית קרינה. C) ביטוי של GFP צריך להיות מאומת גם לנתיחה כדי לקבוע את מידת תיוג גידול. דוגמה זו מראה גידול להביע GFP בכל מקום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: PDXs תווית שמור מרקרים לעקיבה אחרי מעברים מרובים Vivo PDX סרטן השד שכותרתו עם הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP-W מוצג 3 קטעים לאחר התמרה.. ביטוי של GFP נשאר כמעט 100% בגידול passaged. 54,944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. דוגמא של PDXs עם יעילות תמרה לא אופטימלית. א) סרטן השד PDX שכותרתו עם הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP-W היה passaged לאחר התמרה הכי מוצלחת התקיימה. הגידולים וכתוצאה מכילים אוכלוסייה מעורבת של + GFP ותאי הגידול GFP-. הגידול השמאלי אינו מתאים התפשטות נוספת. הגידול הנכון יכול להיות מופץ על ידי לנתח את ה- GFP + אזורים תחת מערכת צפיית קרינה. B) אזורים של GFP + תאים בגידולים מעורבים ניתן לזהות בקלות תחת אור פלורסנט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
-together.within-page = "1"> 
איור 5. בקרת איכות של PDX תכונות לאחר התמרה ו Passaging. הביטוי של EGFR ופאן-cytokeratin (PanCK) ברקמת מוטבע פרפין מסרטן השד שלילי לשלושת הסמנים PDX F2-7 ב מעבר 2 (P2, לפני התמרה), הגידול שנוצר מיד לאחר התמרה (P2-i0), ואת המעבר (P2-i1) הבאים. תמונות 20X, ברים מייצגים 100 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. גרורה ניסויית שימוש PDXs תווית. PDX להביע הפאג-EF1aL בלוציפראז-UBC-GFP-W היה ניתק עבור 3 שעות כמתואר 4, ו 250,000 תאים אנחנומחדש מוזרק חדר הלב השמאלי של עכברי NSG. א) גידול גרורתי ניתן לייחס בבעלי חיים באמצעות הדמית הארה. נטלו גרורתי של PDX סרטן שד זה ניתן להבחין ב ') כבד ו- C) ריאות באמצעות הדמיה לשעבר vivo של איברים גזורים תחת מערכת צפיית קרינה. ברים מייצגים כ 1cm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול:
שימוש חלקיקי lentiviral גבוהה כייל (> 10 8 TU / ml) הוא צעד חיוני בהצלחתה של פרוטוקול זה, כמו מאפשר שליטה קפדנית של רכב התקשורת במהלך תמרה במבחנה. בעוד מספר שיטות לייצור חלקיקים נגיפיים גבוהה כייל תוארו היטב 18,19; פרוטוקול זה משתמש חלקיקים lentiviral מיוצר כמתואר בפירוט www.kottonlab.com . שיטה עדינה לעיכול של גידולים דיסוציאציה של תאים סרטניים היא קריטית עבור תיוג וצמיחה מוצלחים של גידולים שכותרתו. הארכת זמן העיכול מעבר שלוש שעות או הגדלת הטמפרטורה עיכול עד 37 מעלות צלזיוס מגדיל את מספר התאים ניתק אבל פוחתת כדאיות התא והצלחה של תיוג ברוב הגידולים.
שינויים ופתרון בעיות:
פרוטוקול זה צריך להיחשב דינמי ודורש הסתגלות עבור PDX הייחודי עם מעקב צמוד בכל שלב. בעוד פרוטוקול סטנדרטי זה עובד היטב עבור רוב גידולי xenografted, וריאציות קטנות עשויות להיות נחוצות כדי לייעל את התיוג של PDXs השונה. לדוגמא, את שפע רכב stroma ו מטריקס בדרך כלל שונה בין PDXs, אשר יכולים להשפיע על הזמן הדרוש דיסוציאציה לבין התשואה של תאים סרטניים שהושגה לאחר מכן. גידולים גדולים שהופכים גידולים נמקי vascularized מאוד יכול להיות קשה לתייג בשל פסולת ותאי דם העכבר מוגזם. שימוש דלדול לין + והעשרת EpCAM + תא אפיתל המתואר בפרוטוקול זה משפר את היעילות של תמרה ב PDXs כזה. עם זאת, ביטוי של EpCAM תאים + משתנה אפילו בגידולים ממקור אפיתל, ובכך ביטויו יש לאמת כל PDX לפני שימוש כשיטה להעשרת תא.
Limitaמשא של הטכניקה:
תמרה של תאים ניתקים והתרבות הזמנית שלהם במבחנה יכולה לגרום מבחר תת-אוכלוסיות תאים, אשר לאחר מכן יהיה להצמיח גידולים שכותרתו ביסודו שונים PDXs ההורית. הדגירה מראש של חלקיקים lentiviral עם נורמינידאז מומלץ להגדיל את הכריכה של חלקיקים נגיפיים כדי subpopulations תא 21 קשה transduce, וכך להקטין את ההטיה התמרה שאפשר הציג בשלב זה. מניסיוננו, גידולים מחדש על ידי תאים transduced דומות התכונות של PDXs ההורים לא רק היסטולוגית, אלא גם באמצעות ניתוח אשכולות היררכי של ביטוי mRNA (seq RNA, מידע לא מוצג). בקרת איכות במונחים של יעילות תיוג ונאמנות הגידול צריכה להתבצע עבור כל PDX בכל מעבר. מאז תיוג PDX דורש הרחבה של הגידול in vivo וסחיפה הגידול יכול להתרחש אחרי עמ 'חזרassaging, צריכה להתבצע התמר במעבר המוקדם ביותר האפשרי.
המשמעות של הטכניקה:
פרוטוקול זה מתאר כיצד PDXs סרטן השד יכול להיות fluorescently שכותרתו bioluminescently במבחנה מחדש מושתל vivo מעקב אחר צמיחת גידולים orthotopic ו גרורתי. בעוד מחקרים קודמים השתמשו באסטרטגיה דומה לתייג organoids נגזרת PDX 18, הפרוטוקול הנוכחי כולל וריאציות לעיכול גידול וסימון שתוצאתן היא יעילות התמרה גבוהה של PDXs המרובה.
יישומים עתידיים או כיוונים אחרי מאסטרינג טכניקה זו:
היכולת להביע סמנים למעקב ביציבות (GFP, בלוציפראז), וכדי ביטוי יתר או מציאה גנים ספציפיים (כלומר, pSIH1-H1-copGFP-T2a-פורו יכול לשמש כדי לספק shRNAs) מאפשר שימוש PDXs לענות על שאלות בסיסיות אודותצמיחה גרורה של גידולים באופן דומה שורות תאים הוקמו. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגים את השימוש PDXs שכותרתו במודלים גרורים ניסיוני ללמוד צעדי האיבר-קולוניזציה במפל גרורתי. גרורות לאיברים שונים ניתן דמיינו בקלות לכמת באמצעות הדמיה bioluminescent בבעלי חיים, וביטוי GFP המשמש והניתוחים מודרך ולדמיין גרורות באיברים נכרת. זה מייצג כלי רב עצמה כדי להקל על השימוש PDXs למחקר גרור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים ד"ר דארל Kotton באוניברסיטת בוסטון למתן וקטור הפאג-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W ופרוטוקולים לייצור lentiviral כייל גבוה שימוש במחקרים אלה. עבודה זו מומנה על ידי DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) ו R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 מרכז נתמך מענק בתחום ההדמיה vivo תרבות רקמות ליבות באוניברסיטת קולורדו AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M.
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
