Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .
Introduction
Die Entwicklung von Patienten stamm Tumorxenografte (PDXs), wobei operativ reseziert Tumorproben direkt transplantiert werden in immungeschwächten Mäusen, bietet mehrere Vorteile gegenüber Standard - Zell-Linie Xenotransplantatmodellen und stellt einen großen Fortschritt in der Krebsforschung 1,2. PDXs können durch aufeinanderfolgende Durchgänge mit minimalen Veränderung der genetischen und biologischen Eigenschaften des Tumors bei der ersten Passage gezüchtet gepflegt und erweitert werden; und genauer widerspiegeln Tumor Heterogenität als abgeleitet Xenotransplantate von menschlichen Krebszelllinien 3-8. Diese Modelle werden nun in großem Umfang als Plattform genutzt zur Personalisierung von Krebstherapeutika 9,10, als präklinische Plattform in der Medikamentenentwicklung 6,11 und als experimentelles Werkzeug für das Studium der Krebsbiologie 4,12.
Die meisten PDXs implantiert werden und subkutan propagiert, die feasibly Messung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit ermöglicht Sätteln mit. abermetastatische Erkrankung hat, war schwieriger zu modellieren PDXs verwenden. Speziell für Brustkrebs - Xenotransplantaten mit metastatischen Kapazität verschiedenen Organen haben 3,5,13 beschrieben worden ist , aber die Frequenz der spontanen Verbreitung an metastatischen Stellen ist extrem niedrig. Wo berichtet, stützt sich die Identifizierung und Quantifizierung von metastasierendem Belastung in mühsamer histologische Untersuchung von Zielorganen post-mortem. Krebs-Zelllinien Biolumineszenz (Luciferase, Luc) exprimieren, oder fluoreszierend (Green Fluorescent Protein, GFP) Gen-Reporter werden in experimentellen Modellen von Brustkrebs Metastasen in Gehirn, Lunge, Knochen und Leber nach intrakardial, Schwanz-Vene, intrafemoral und splenic Injektion häufig verwendete 14-16. Während diese Modelle Verbreitung von den primären Tumoren umgehen, sie sind wertvoll, die Mechanismen der Organtropismus und metastatischen Kolonisation zu studieren. Doch von primären Patiententumoren und PDXs abgeleiteten Zellen können niedrige Transfektion oder Transduktionsraten haben using Standardverfahren. Eine Alternative ist PDX-abgeleiteten Zelllinien in vitro zu etablieren 17, die als herkömmliche Gewebekulturprotokollen markiert werden können. Dieser Ansatz ist jedoch nicht geeignet für die meisten PDXs Kennzeichnung, für die Zell-Linie Ableitung schwierig und kann den Phänotyp der Zellen verändern. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Weiterleitung von PDX-distanzierte Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren , die sich für die in - vivo - Bildgebung. Darüber hinaus beschreiben wir experimentelle Metastasierung mit Intrakardial dissoziierter luc-GFP-markierten PDX-Zellen bei immunsupprimierten Mäusen.
Ein Basisprotokoll für die Transduktion von PDX-distanzierte Organoide mit Gen-Reporter exprimieren Lentiviren zuvor 18 beschrieben. In der aktuellen Protokoll beschreiben wir zusätzliche Methoden für das menschliche Tumorzellen zu bereichern und in der Nähe von 100% Transduktionseffizienz, sowie die Verwendung von markierten PDXs zum Nachweis von experimentellen Brustkrebs erhaltenMetastasen. Dieses Protokoll kann für die Markierung von mehreren Krebsarten PDXs mit verschiedenen Leucht und Fluoreszenzmarker sowie Modulation der Genexpression (dh shRNA Knockdown von Genen von Interesse) angepasst werden.
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Protocol
Alle Schritte folgt die Verwendung von Tieren in diesem Protokoll erfordert die Richtlinien der University of Colorado Tierforschung Ethikkommission (IACUC).
1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und andere Reagenzien
- Herstellung von 100 ml mammosphere enthaltenden Medien Dulbeccos Modified Eagle Medium und Han F-12-Medium (DMEM / F12) (1: 1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF, 20 ng / ml), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 10 ng / ml ), Heparin (4 & mgr; g / ml), 1x B27, Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml). Machen Medien unter sterilen Bedingungen und lagern bei 4 ° C für bis zu 3 Monate.
- Bereiten epithelial Anreicherungspuffer (EEB) mit PBS pH 7,2, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM EDTA. Filter zu sterilisieren und lagern bei 4 ° C für bis zu 6 Monaten.
- Machen Sie 5 ml Aliquoten Verdauungspuffer in sterilen 15 ml konischen Röhrchen und bei -20 ° C für Monate. In der Nacht vor Tumor Verdauung, Tauwetter Verdauungspuffer (5 ml pro 500 mgTumor) auf Eis bei 4 ° C. In 1x Antibiotikum-Antimykotikum Mischung vor dem Gebrauch.
- Autoklav (121 ° C für 30 min) mindestens zwei Zangen, Skalpell und Schere für die Präparation von PDXs.
- Make 500 ml Waschpuffer, enthaltend DMEM: F12 und 5% fötalem Rinderserum (FBS). Lagerung bei 4 ° C für Monate. Aliquotieren 10 ml pro Tumor am Tag der Tumor Dissektion.
- Bereiten Sie eine Polybren Lager bei 4 ug / ul mit sterilem Wasser. Filter und aliquoten in 1,5 ml Mikroröhrchen, die jeweils 100 ul, bei -20 ° C.
2. Erzeugung von hohen Titern Lentivirale Partikel Tragen Nachvollziehbare Marker
- Kauf oder erzeugen mit hohem Titer lentivirale Partikel mit einem Reporter - Gen tragen (dh., GFP und Luc für in vivo - Tracking des Tumorwachstums) 18,19.
HINWEIS: Ein lentiviralen Titer von> 10 8 TU / ml (Transduktion Einheiten pro Milliliter) ist für eine erfolgreiche Transduktion von PDXs empfohlen. Die lentiviralen pArtikel sollten mit einem Umschlag G-Glykoprotein von Vesicular Stomatitis Virus (VSV-G), so dass die Transduktion von einer Vielzahl von Säugetierzellen pseudotypisierten sein.
HINWEIS: Das Protokoll hier für die Erzeugung und Titration von hohem Titer lentivirale Partikel bei verfügbar verwendet www.kottonlab.com . Vektoren in diesem Protokoll sind pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro und der Dual-Promotor Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W verwendet. Dieser Vektor wurde erzeugt durch dsRed mit dem Luciferase-Gen stromabwärts von EF1aL Promotor in der Phage-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W Vektor, eine Art Geschenk von Darrell Kotton, Boston University zu ersetzen.
3. Erzeugung von Patienten stamm Xenografts
- Generieren Patienten abgeleitet Xenotransplantaten (PDX) von Brustkrebs um 3,4 primären oder metastatischen Brusttumoren in der Brustfettpolster von immunsupprimierten Mäusen implantiert wird . Erzeugen Tumoren bei maximal empfohlene Größe von 1 cm Durchmesser größeren Tumoren l sindikely nekrotischen Kerne enthalten.
HINWEIS: Detaillierte Methoden zur Festlegung und Umpflanzen Xenotransplantate sind in DeRose et al . 18. Wachstum von etablierten transplantierbaren PDXs in> 1 cm Durchmesser Tumoren dauert zwischen 4 und 24 Wochen nach der Implantation in immunsupprimierten NOD / SCID / ILIIrg - / - (NSG), abhängig von intrinsischen Tumorwachstumsraten. Während dieses Protokoll Transduktion von Brustkrebs PDXs beschreibt, kann sie für die virale Transduktion von jedem Tumor geeignet kurzfristige in vitro Durchgang verwendet werden. Die Empfindlichkeit der PDXs kurzfristige (24-96 h) in vitro das Überleben zu jedem Tumor intrinsische und muß experimentell bestimmt werden.
4. Tumor Dissection und des Zerfalls von PDX-abgeleiteten Tumorzellen
- Euthanize Mäusen , die PDX mit CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte (folgen Richtlinien des Instituts der Tierforschungsethikkommission). Unterzutauchen Mäuse in einer 0,2% Chlorhexidine Lösung für 1 min. Setzen Sie die Maus auf einem Rückenlage auf einer Dissektion Bord, und verwenden Stifte, die erweiterten oberen und unteren Extremitäten an der Platte zu befestigen.
- Unter aseptischen Bedingungen verwenden, um ein Skalpell die Haut zu schneiden, um den Tumor. Ziehen Sie die Haut mit einem Satz von Zangen und trennen es vom Tumor mit einem sauberen Skalpell, bis der Tumor vollständig ausgesetzt ist. Mit einem sauberen Satz von Pinzette und Skalpell, entfernen Sie den Tumor und legen Sie sie in 5 ml waschen Medien auf Eis.
- Nehmen Sie seziert Tumor in einen Bls2 Schrank zur weiteren Verarbeitung. Medium entfernen und spülen Tumor mit 10 ml Hanks Balanced Salt Sodium modifiziert mit 10 mM Hepes (HBSS / Hepes), zweimal.
- Lassen Sie den Tumor in einer sterilen vorgewogen 60 cm Gewebekulturplatte. Wiegen Sie die Platte um den Tumor enthält Tumormasse zu schätzen.
- Mit einem Skalpell, schneiden Sie den Tumor in der Hälfte, dann schneiden Sie ein 3-mm-Scheibe aus einer Hälfte und legen Sie sie in einen Behälter mit 10% Formalin für 24 Stunden. Verwenden Sie dieses Gewebe die Heterogenität der zu verifizierenTumorprobe (Eltern PDX). In 200 ul HBSS / Hepes (genug, um das Gewebe zu vermeiden austrocknen) und Hackfleisch den verbleibenden Tumor in möglichst kleinen Stücke Zange und ein sauberes Skalpell.
- Übertragen Sie die gehackten Tumor in einen sterilen 50 ml konischen Röhrchen. Fügen mindestens 1 ml Verdauungspuffer 1x antimykotischen-Antibiotikum pro 100 mg Tumor enthält.
HINWEIS: Die Zugabe von Antibiotika / Antimykotika verhindert die Kontamination von Tumorzellen in vitro. - Digest-Tumor für 3 Stunden bei 30 ° C, Schütteln bei 125 bis 200 Umdrehungen pro Minute.
HINWEIS: Bei steigender Temperatur bis zu 37 ° C erhöht die Effizienz der Verdauung (mehr einzelne Zellen im Laufe der Zeit), aber es wird in der Regel durch erhöhte Zelltod begleitet. Für die meisten Tumoren Verdau bei 30 ° C für 3 Stunden zu einer ausreichenden Zahl von lebensfähigen dissoziierten Zellen zu dem Markierungsschritt fortzufahren. - Stoppen Sie die Verdauung Zugabe von 35 ml Medium (DMEM / F12 mit 5% FBS) waschen. Man filtriert durch ein 70 um Nylon Netz in einen sauberen 50 ml conical Rohr unverdaute Gewebe zu entfernen. Zentrifugieren der gefilterten Medien mit verdauten Zellen bei 400 xg für 5 min.
- Überstand entfernen und Pellet in 1 ml Rote Blut Puffer Zell-Lyse. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- 10 ml Waschpuffer (DMEM: F12, 5% FBS) Lyse zu stoppen. Pass-Zellen durch ein 40 & mgr; m Nylon-Mesh-Klumpen zu entfernen. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min und entfernen Überstand auf Eis.
- Resuspendieren verdaute Zellen in 5 ml Waschpuffer und Trypanblau mit lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen zu zählen. Kurz gesagt, mit Trypanblau und zählen Trypan-blau mit Ausnahme von Zellen 50 ul Zellen und 50 ul einer Zählkammer mischen.
HINWEIS: Dies wird grob Verdauungsprodukt menschlichen Tumorzellen enthalten aus dem PDX abgeleitet sowie Maus Stromazellen (Fibroblasten, Blutzellen, usw.). Verdauten Zellen können nun für die Markierung (Schritt 6) oder menschliche Krebszellen angereichert werden können, eines der Verfahren unter Verwendung verarbeitet werden beschriebenin Ref 5.
5. Anreicherung von humanen epithelialen Krebszellen
- Verbrauchen Sie den Zellen der Maus Stromazellen eine Linie (Lin +) Zell - Depletion Kit 20 verwendet wird .
HINWEIS: Empfohlen für gefäßreiche Tumoren und / oder Tumoren mit hoher Stroma-Gehalt in dem EpCAM-Expression ist unbekannt oder verloren).- Nehmen Sie bis zu 10 7 lebenden Zellen in einem sauberen 5 ml Polypropylen - Röhrchen, 2 ml EEB und Zentrifuge bei 300 g für 5 min. Pipette vollständig aus Überstand.
- Resuspendieren Zellpellet in 40 ul eiskaltem EEB pro 10 7 Zellen.
- In 10 ul Biotin-Antikörper - Cocktail pro 10 7 Zellen, mischen durch vorsichtiges Pipettieren und Inkubation bei 4 ° C für 10 min (Cocktail enthält Antikörper gegen Lin + Maus - Zellen).
- In 30 ul kaltem EEB pro 10 7 Zellen, mischen durch vorsichtiges Pipettieren.
- In 20 ul anti-Biotin - Mikrokugeln pro 10 7 Zellen mischen durch vorsichtiges Pipettieren und Inkubation bei 4 & #176; C für 15 min.
- Wasche die Zellen mit 3 ml kaltem EEB, Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Sorgfältig absaugen Überstand. Pellet in 500 ul EEB und auf Eis.
- Platzieren Säule in das Magnetfeld eines Magnetscheiders. Spülen Sie Säule mit 0,5 ml epithelialen Anreicherung Puffer und lassen Sie es durch tropfen. Nicht in die Spalte austrocknen.
- Legen Sie ein neues Polypropylen Sammelröhrchen unter der Spalte. Langsam fügen Sie die 500 ul markierten Zellen über die Säule, die (Lin + markierten Zellen in der magnetischen Säule zurückgehalten wird). Sammeln Abwasser als Bruch mit unmarkierten Zellen, die die angereicherten Linie negativ (Tumor) Zellfraktion.
- Spülen der Säule 3-mal mit 500 ul EBB und sammeln das Abwasser in das gleiche Rohr als Abstrom von Schritt 5.1.8. Halten Sie Abwasser auf Eis und fahren Sie mit Markierungsschritt (6).
- Optional: Nehmen Sie die Spalte außerhalb des Magnetfeldes. Legen Sie ein neues Polypropylenröhrchen unterund Eluieren des LIN + Fraktion durch Zugabe von 500 & mgr; l von EEB, dreimal und mit dem mitgelieferten Kolben.
- Anreicherung von menschlichen EpCAM + epithelialen Krebszellen (empfohlen für Tumoren bekannt CD326 + auszudrücken und hohe Maus Stromazellen Inhalt enthalten).
- Nehmen Sie bis zu 10 7 lebenden Zellen in einem sauberen 5 ml Polypropylen - Röhrchen, 2 ml kaltem EEB und Zentrifuge bei 300 g für 5 min. Pipette vollständig aus Überstand.
- Resuspendieren Zellpellet in 60 ul eiskaltem EBB pro 10 7 Zellen.
- In 20 ul EpCAM Mikrokügelchen pro 10 7 Zellen, mischen durch vorsichtiges Pipettieren und Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
- Wasche die Zellen mit 3 ml kaltem EEB, Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Sorgfältig absaugen Überstand. Pellet in 500 ul EEB und auf Eis gelegt.
- Platzieren Säule in das Magnetfeld eines Mini-Separator. Spülen Sie Säule mit 0,5 ml EEB und lassen Sie es durch tropfen. Nicht in die Spalte, um zu trocknenaus.
- Legen Sie ein neues Polypropylen Sammelröhrchen unter der Spalte. Langsam fügen Sie die 500 ul markierten Zellen über die Säule (EpCAM + markierten Zellen in der magnetischen Säule zurückgehalten wird) enthält. Sammeln Abwasser als Bruch mit unmarkierten Zellen, die die Maus Stromazellen.
- Spülen Sie die Säule 4-mal mit 500 ul ME Buffer und sammeln das Abwasser in das gleiche Rohr als Abstrom von Schritt 5.1.8.
- Nehmen Sie die Spalte außerhalb des Magnetfeldes. Legen Sie ein neues Polypropylen-Röhrchen unterhalb und Eluieren des EpCAM + Fraktion durch Zugabe von 500 ul ME-Puffer, dreimal. Spülen Sie die magnetisch markierten Zellen, indem Sie den Kolben in die Säule schieben. Sammeln Abwasser mit dem angereicherten EpCAM + Tumorzellfraktion und halten auf dem Eis. Gehen Sie zu Schritt 6.
6. Transduction von PDX-abgeleiteten Tumorzellen
- Zentrifuge distanzierte Tumorzellen bei 300 gx 5 min und Resuspendieren in 2 ml mammosphere mediein. Graf lebenden Zellen unter Verwendung von Trypanblau wie in 4.11.
- Bereiten Sie 10 ml mammosphere Medien mit 8 ug / ml Polybren (2 ul Lager Polybren pro ml Medium).
- Bestimmen Sie die für 2 x 10 5 lebensfähige Tumorzellen benötigt Volumen. Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 Minuten und Resuspendieren Pellet in 2 ml Polybren enthaltenden Medien. Plate 2 x 10 5 lebensfähige Tumorzellen pro Vertiefung einer 6-Well - Ultra-Low - Adhärenz - Gewebekulturplatte.
Hinweis: Dies ist eine optimale Anzahl von für die Transduktion mit einem lentiviralen Vektor erforderlich Zellen.
VORSICHT! Lentivirale Partikel und alle mit lentiviralen Partikeln verwendet Verbrauchsmaterialien sollten folgende institutionellen Verfahren für die rekombinante DNA biohazards behandelt werden.
HINWEIS: Lentivirale Transduktion von primären Brustzellen begünstigt stark Myoepithelzellen , die in einem schlechten Markierung von Luminal Zellen und Selektion von Subpopulationen von Tumorzellen während der Markierung 21 zur Folge haben kann. <li> Inkubieren des Virus mit 200 mU / ml Neuraminidase bei 37 ° C für 1 h vor der Transduktion 21 um die Bindung der viralen Partikel an unterschiedlichen primären Zell - Subpopulationen und korrekte für dieses Potentialvorspannung zu erhöhen. - Hinzufügen lentivirale Partikel bei 10 MOI (2 x 10 6 TU für 2 x 10 5 lebensfähige Zellen) , wenn PDX-dissoziierten Zellen von Lin + Mauszellen aufgebraucht sind oder in EpCAM + Zellen angereichert. Hinzufügen lentivirale Partikel bei 30 MOI (6 x 10 6 TU für 2 x 10 5 lebensfähige Zellen) , wenn nicht-angereicherte PDX-dissoziierten Zellen.
HINWEIS: Die erhöhte MOI ermöglicht eine effiziente Transduktion auch in Gegenwart von großen Mengen an Schmutz und tote Zellen in Rohextrakten. Halten Sie eine gut mit unmarkierten Zellen als Kontrolle für die Lebensfähigkeit und die Transduktionseffizienz zu dienen. - Drall-Virus mit Zellen mischen. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für bis zu 96 Stunden. In 500 ml frisches mammosphere Medien 24 Stunden nach der Transfektion. Die Zellen werden nicht attach auf Platten, nicht Medien ansaugen.
7. Bewertung von Transduktionseffizienz und Re-Implantation der markierten Zellen in immunsupprimierten Mäusen
- Überwachen Sie die Expression des rückverfolgbar Marker (GFP) alle 24 Stunden ein Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung verwendet wird.
HINWEIS: Die GFP - Expression kann bereits 24 h nach Infektion beobachtet werden , aber in den meisten PDXs GFP - Expression ist deutlich sichtbar nach 72 h (Figur 1). - Abschätzung der Effizienz der Transduktion durch den Prozentsatz der GFP + -Zellen in der gesamten Auswertung gut.
HINWEIS: Da Kulturen von Tumorzellen, residual Stromazellen, und tote Zellen in verschiedenen Graden, Vertiefungen mit so niedrig wie 10% GFP + -Zellen enthalten, können in einer Wirtsmaus implantiert werden. - Übertragen transduzierten Zellen aus Platten mit 6 Vertiefungen in einem 15 ml konischen Röhrchen. 1 ml mammosphere Medien zum Brunnen, die alle Zellen zurückgelassen zu sammeln. Legen Sie auf dem Eis.
- 10 ml HBSS / Hepes zu transduzierten Zellen und centrifuge bei 300 xg für 5 min, 4 ° C. vorsichtig absaugen Überstand und resuspendieren in 50 ul Keller Matrix-Extrakt (BME) auf dem Eis.
HINWEIS: BME Aliquots muß auf Eis aufgetaut werden, 1 - 2 Stunden vor der Verwendung. BME wird bei Raumtemperatur verfestigen; auf Eis halten zu allen Zeiten. - Laden Sie BME-eingebetteten Zellen in ein 0,5 ml Insulinspritze, auf Eis halten, und bringen in die Tieranlage für Reimplantation in NSG-Mäusen.
- Anesthetize weiblich 4 - 8 Wochen alten NSG Mäuse unter Verwendung von 5% Isofluran / 95% Sauerstoff für 5min, gefolgt von 2% Isofluran / 98% Sauerstoff oder nach anerkannten Tierforschung Ethik genehmigten Protokoll.
- Wenn Tier auf Schmerzreize (toe-Pinch) nicht reagiert, reinigen Sie den Injektionsbereich mit durch Ethanol Tüchern gefolgt betadine und injizieren die 50 ul Zellen im 4. Brustfettpolster. Geben Sie Mäuse mit Analgesie Injektion Beschwerden zu lindern, wie in genehmigten Protokoll angegeben.
- Erlauben Zellen zu bilden Tumoren (2-12 Wochen) und zu überwachen GFP und / oderLuciferase - Aktivität eine abstimmbare Lichtsystem und / oder in vivo - Luciferase - Bildgebungssystem (Abbildung 2).
Hinweis: Folgen Sie Richtlinien für Anästhesie, Analgesie, Tumorlast Messungen und Euthanasie Kriterien wie von institutionellen Tierforschung Ethikkommission genehmigt.
8. Qualitätskontrolle von Beschriftete PDXs
- Bestimmen Sie die Effizienz der Markierung durch Luciferase und GFP-Expression in markierten Tumoren zu bewerten.
HINWEIS: Folgen Sie institutionellen Tierforschung Ethikkommission genehmigten Verfahren für In - vivo - Biolumineszenz - Bildgebung (2, 3).- Präparieren Tumoren von Mäusen eingeschläfert, wenn die Tumorgröße 1,0 erreicht hat - 1,5 cm Durchmesser (oder vor dem genehmigten Protokollen nach, wie in 4 beschrieben). Dissection sollte unter einem abstimmbaren Lichtsystem (oder einem gleichwertigen System, das GFP-Fluoreszenz Auswertung erlaubt) durchgeführt werden.
- Von jedem Tumor, schätzen qualitativ die percentage von GFP + Tumormikroskopie. Wenn weniger als 100%, GFP + Teil nur sezieren. Präparieren Sie ein 3-mm-Scheibe und fixieren in 10% Formalin für Paraffineinbettung und histologische Analyse, ein kleines Stück für RNA oder anderen gewünschten Analysen zu speichern, und so viel des Tumors wie möglich in den einzelnen 1,5 ml Kryoröhrchen mit 90% FBS / 10% sparen DMSO für die Kryokonservierung.
- Re-Implantat Stücke markierten Tumor in neue Empfänger NSG Mäuse 18 zu erweitern und in der experimentellen Metastasierung Studien verwenden.
- Führen Standard immunhistochemischen Färbung von in Paraffin eingebetteten Gewebe von Tumoren erhalten vor der Transduktion und bei jeder Generation danach zu überprüfen, ob die markierten PDXs bleiben histologisch ähnlich den ursprünglichen PDXs.
HINWEIS: Die Markierungen für die Qualitätskontrolle verwendet variieren je nach PDXs. Für Brustkrebs PDXs Expression von Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor, epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2), epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (HER 1 oder EGFR), pan-Cytokeratin (Pan-CK) sind für die ersten Screening empfohlen.
9. Experimentelle Metastasierung Modelle mit beschrifteten PDXs
- Im Anschluss an die beschriebenen Schritte in Abschnitt 4, Tumorzellen von einem markierten PDX distanzieren. Wenn Tumor stark vaskularisierten oder reich an Maus Stroma ist, führen die Anreicherung von Krebszellen in 4,5 oder 4,6, wie beschrieben.
- Zählen lebensfähiger Zellen Trypanblauausschluß unter Verwendung und verdünnter 250.000 Zellen in 100 ul PBS (Ca 2+, Mg 2+ frei) pro Maus. Halten Sie Zellen auf Eis. Für die Injektion mehrerer Mäuse, stellen Sie die Zahlen entsprechend (und einen Überschuss von mindestens einer zusätzlichen Einspritzung vorzubereiten Pipettierfehler zu berücksichtigen).
- Bringen Sie Zellen auf Eis in den entsprechenden Tierbehandlungsraum und fahren Sie mit intrakardiale Injektion nach anerkannten IACUC Protokoll.
HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die intrakardiale Injektion von Krebszellen wurden an anderer Stelle 22,23 beschrieben. - Verfolgen und quantifizieren metastasierendemverteilt über die Zeit Biolumineszenz-Bildgebung. Visualisieren makroskopischen Metastasen in verschiedenen Organen unter Verwendung von Biolumineszenz und / oder GFP Bildgebung von isolierten Organen bei der Nekropsie 24 (Abbildung 6).
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Representative Results
Diese Methode beschreibt die Transduktion von PDX-dissoziierten Zellen Brustkrebs mit hohem Titer unter Verwendung von lentiviralen Vektoren pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro und Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W. Diese Vektoren exprimieren einen fluoreszierenden Marker, der die Effizienz der Transduktion in vitro ermöglicht die Abschätzung bereits 24 h nach der Infektion (Abbildung 1a). Für die meisten PDXs Expression von GFP wird 72 Stunden nach der Infektion (Abbildung 1b) verzögert werden, zu dieser Zeit die Bildung von Zellaggregaten üblicherweise beobachtet wird. Transduktion kann nach der Anreicherung für die menschlichen Krebszellen erreicht werden (dh unter Verwendung von Lin + Zell - Depletion, 1a) oder in rohem PDX-dissoziierten Zellen (Abbildung 1b). Anreicherung von Tumor Epithelzellen für stark vaskularisierten Tumoren waren Maus Blutzellen einen erheblichen Prozentsatz der Gesamtzahl der lebenden Zellen dar empfohlen.
in vitro überprüft werden markierte Zellen in der extrazellulären Matrix und reimplantierten in NSG - Mäusen gesammelt und suspendiert. Markierten Tumorzellen regenerieren Tumoren, Biolumineszenz oder Fluoreszenz (Abbildung 2) verfolgt werden können. Transduktionseffizienz müssen folgende Tumorbildung ausgewertet werden, und es wird in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit der verschiedenen PDXs in vitro Transduktion variieren. Eine erfolgreich markiert PDX wird nahezu 100% GFP + sein bei der ersten Generation post-Transduktion (2b, c) und in der Nähe von 100% GFP + in nachfolgenden Durchgängen (3) bleiben. Allerdings werden einige PDXs zeigen "lückenhaft" Verteilung von GFP + Zellen (Abbildung 4), ein suboptimales in vitro Transduktion hindeutet. In diesen Fällen kann Tumoren unter einem Fluoreszenz-Betrachtungssystem zerlegt werden GFP + Bereiche auszuwählen, die für die Erweiterung des markierten subpop wieder implantiert werden kannulation oder Tumoren können dissoziiert und durch eine erneute Implantation in Mäuse NSG gefolgt FACS isoliert werden können Zellen, die GFP + werden.
Da PDX Dissoziation und Transduktion in der Auswahl von Zell-Subpopulationen innerhalb des Tumors führen kann, müssen Forscher zu verifizieren, dass eng markierten Tumoren die parentalen Tumore ähneln, von denen sie abgeleitet wurden. PDXs sollte bei jeder Generation durch IHC gefärbt werden , dass kritische Marker, EGFR, Hormonrezeptoren (dh Östrogen - Rezeptor) und pan-Zytokeratine zu demonstrieren (PanCK, Marker von Epithelzellen) in etikettierten PDXs konserviert. Abbildung 5 zeigt die Färbung für EGFR und panCK in einem dreifach negativem Brustkrebs PDX (Hormonrezeptor-Färbung ist nicht gezeigt, da diese PDX Östrogen und Progesteron-Rezeptor fehlt).
Beschriftete PDXs kann spontan metastasierenden zu verfolgen Ausbreitung sowie experimentelle metastasierendem verwendet werdenverbreiten, indem sie Zellen direkt in den Kreislauf der Aussaat. Spontane Metastasen bei Brustkrebs PDXs treten weniger häufig, aber wurden von mehreren Gruppen 3,13,25 berichtet. Experimentelle Modelle von Metastasen bieten eine Alternative zu Organtropismus und Organbesiedlung Schritte in der metastatischen Kaskade studieren. Die Zellen aus markierten Tumoren gelöst sind intrakardial und metastatischen Belastung injiziert wird, unter Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung verfolgt. Wie in 6 gezeigt ist , injiziert , um eine PDX transduziert mit phagen EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W auf 250.000 Zellen / Maus gebildeten Metastasen in Lunge und Leber , die leicht mit Luciferase - Bildgebung in vivo identifiziert wurden, und die GFP - Expression in Organen ex vivo .
Abb . 1: Tracking - Transduktionseffizienz in Dissociated PDX Cells A) B - Zellen) aus einem separaten Experiment PDX-distanzierte, ohne epithelialen Zellanreicherung, 72 h nach Transduktion mit dem Phagen-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W. Beide Panels zeigen lebenden Zellen. BF: Hellfeld Bilder, Balken steht für 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Etablierung von Beschriftete PDXs in Host Mäuse Zellen transduziert mit Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W für 72 Stunden wurden in der Brustfettpolster eines weiblichen NSG Maus implantiert. Der Tumor wurde 14 Wochen nach der Injektion wachsen gelassen. A) Luciferase Reporter - Aktivität kann durch die intakte Haut unter Verwendung eines Fluoreszenz - Beobachtungssystem. C) GFP - Expression sollte auch überprüft werden dissection beobachtet werden , indem in - vivo - Bildgebung nach intraperitonealer Injektion von Luciferin. B) GFP - Expression bewertet das Ausmaß der Tumormarkierung zu bestimmen. Dieses Beispiel zeigt , allgegenwärtige GFP - exprimierenden Tumor. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Beschriftet PDXs beibehalten Nachvollziehbare Marker nach Multiple Passages In Vivo A PDX Brustkrebs markiert mit Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W 3 Passagen nach Transduktion gezeigt.. GFP-Expression bleibt bei fast 100% im agierten Tumor.54944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Beispiel für eine PDXs mit Suboptimale Transduktionswirksamkeit. A) Brustkrebs PDX markiert mit Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W agiert wurde nach einer suboptimalen Übertragung stattfand. Die resultierenden Tumoren enthalten gemischte Populationen von GFP + und GFP- Tumorzellen. Der linke Tumor ist für die weitere Vermehrung nicht geeignet. Der rechte Tumor kann durch Sezieren die GFP + Regionen unter einem Fluoreszenzbetrachtungssystem. B) Regionen von GFP + Zellen in gemischten Tumoren leicht identifiziert werden können , unter Fluoreszenzlicht propagiert werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Qualitätskontrolle von PDX Eigenschaften nach Transduction und Passagierung. Die Expression von EGFR und Pan-Cytokeratin (PanCK) in Paraffin eingebetteten Gewebeproben aus einem dreifach negativem Brustkrebs PDX F2-7 bei Passage 2 (P2, vor der Transduktion), der Tumor erzeugt unmittelbar nach Transduktion (P2-i 0), und die folgende Passage (P2-i1). 20X Bilder stellt Bars 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Experimentelle Metastasierung Verwendung beschrifteter PDXs. Ein PDX exprimierenden Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W für 3 Stunden distanzierte wurde wie in 4 beschrieben, und 250.000 Zellen , die wirre in der linken Herzkammer von NSG - Mäuse injiziert. A) metastatischen Wachstums kann in lebenden Tieren unter Verwendung von Lumineszenz - Bildgebung verfolgt werden. Metastasiertem Last dieser PDX Brustkrebs kann in B) Leber und C) Lungen mit ex-vivo - Bildgebung von seziert Organe unter einem Fluoreszenzbetrachtungssystem beobachtet werden. Bars steht für ca. 1 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls:
Die Verwendung hoch Titer Lentivirale Partikel (> 10 8 TU / ml) ist ein entscheidender Schritt in den Erfolg dieses Protokolls, die sorgfältige Kontrolle der während der in vitro Transduktion Medienzusammensetzung ermöglicht. Während mehrere Methoden für die Herstellung von High-Titer viralen Partikel wurden gut 18,19 beschrieben; Dieses Protokoll verwendet lentivirale Partikel , wie im Detail in beschrieben hergestellten www.kottonlab.com . Eine sanfte Methode für die Verdauung von Tumoren und Dissoziation von Krebszellen ist entscheidend für eine erfolgreiche Kennzeichnung und das Wachstum von markierten Tumoren. die Aufschlusszeit über 3 Stunden verlängern oder die Verdauung Temperatur auf 37 ° C zu erhöhen erhöht die Anzahl der dissoziierten Zellen, verringert aber die Lebensfähigkeit der Zellen und der Erfolg der Kennzeichnung in den meisten Tumoren.
Technische Änderungen und Fehlersuche:
Dieses Protokoll sollte dynamisch betrachtet werden und erfordert Anpassung für einzigartige PDX mit sorgfältiger Überwachung bei jedem Schritt. Während dieses Standardprotokoll gut für die meisten xenografted Tumoren arbeitet, können kleine Veränderungen notwendig Kennzeichnung verschiedener PDXs zu optimieren. Beispielsweise unterscheiden sich die Fülle und Zusammensetzung von Stroma und der extrazellulären Matrix in der Regel unter PDXs, die die benötigte Zeit für die Dissoziation und die Ausbeute an Tumorzellen danach erhalten beeinflussen können. Große Tumoren, die nekrotischen und gefäßreiche Tumoren werden kann schwierig sein, aufgrund von Schmutz und übermäßige Maus Blutzellen zu beschriften. Die Verwendung von Lin + Verarmungs und epithelialen EpCAM + Zellanreicherung in diesem Protokoll beschrieben verbessert die Effizienz der Transduktion in solchen PDXs. Die Expression von EpCAM + Zellen variiert auch in Tumoren, die aus epithelialen Ursprungs, also ihren Ausdruck in jeder PDX überprüft werden müssen, bevor als Methode zur Anreicherung von Zellen zu verwenden.
limitagen der Technik:
Transduction von dissoziierten Zellen und deren temporäre Kultur in vitro in Auswahl von Zell - Subpopulationen führen könnte, die dann Anlass zu markierten Tumoren grundsätzlich verschieden von den elterlichen PDXs geben wird. Die Vorinkubation von lentivirale Partikel mit Neuraminidase wird empfohlen , um die Bindung der viralen Partikel an Zellsubpopulationen 21 schwierig zu transduzieren, was zu einer Erhöhung der Transduktion Vorspannung abnimmt , die bei diesem Schritt eingeführt werden könnten. Nach unserer Erfahrung von transduzierten Zellen rekonstituiert Tumoren eng die Eigenschaften der parentalen PDXs ähneln histologisch nicht nur, sondern auch hierarchischen Clustering-Analyse der mRNA-Expression unter Verwendung von (RNA seq, Daten nicht gezeigt). Qualitätskontrolle in Bezug auf die Markierungseffizienz und Tumor Treue sollte für jeden PDX bei jedem Durchgang durchgeführt werden. Da PDX Markierungs drift Ausdehnung des Tumors in vivo und Tumor erfordert konnte nach mehrmaliger p auftretenassaging, Transduktion sollte möglich bei der ersten Passage durchgeführt werden.
Bedeutung der Technik:
Dieses Protokoll beschreibt , wie Brustkrebs PDXs bioluminescently fluoreszierend sein , kann in vitro und reimplantierten in vivo für die Verfolgung von orthotoper und metastatischem Tumorwachstum gekennzeichnet. Während frühere Studien eine ähnliche Strategie verwendet zu etikettieren Organoide 18 PDX-derived enthält das aktuelle Protokoll Variationen in Tumor Verdauung und eine Kennzeichnung, die in einer hohen Transduktionseffizienz mehrerer PDXs führen.
Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach dieser Technik zu meistern:
Die Fähigkeit, stabil rückverfolgbar Marker (GFP, Luciferase) exprimieren und zu überexprimieren oder spezifische Gene Knockdown (dh pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro verwendet werden können shRNAs zu liefern) ermöglicht die Verwendung von PDXs grundlegende Fragen zu beantworten überTumorwachstum und Metastasierung in einer ähnlichen Weise zu etablierten Zelllinien. Insbesondere zeigt dieses Protokoll, um die Verwendung von markierten PDXs in experimentellen Metastasierung Modelle Organbesiedlung Schritte in der metastatischen Kaskade zu studieren. Metastasen an verschiedenen Organen lassen sich leicht sichtbar gemacht und quantifiziert Biolumineszenz-Bildgebung in lebenden Tieren verwendet und die GFP-Expression zu geführten Dissektionen und zu visualisieren Metastasen in ausgeschnittenen Organen verwendet. Dies stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Verwendung von PDXs für die Metastasierung Forschung zu erleichtern.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Darrel Kotton an der Boston University für die Bereitstellung der Phage-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W-Vektor und Protokolle für hohe Titer lentiviralen Produktion in diesen Studien verwendet. Diese Arbeit wurde von DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) und R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Zentrum Zuschuss unterstützt in - vivo - Bildgebung gefördert und Gewebekultur-Kerne an der University of Colorado AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
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