Summary
We beschrijven een methode voor stabiele kenmerken van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDXs) met lentivirale deeltjes uiten van groen fluorescerend eiwit en luciferase reporters. Deze werkwijze maakt het volgen van de groei van PDXs op de primaire locatie, alsmede detectie spontane en experimentele metastasen gebruik in vivo beeldvorming.
Introduction
De ontwikkeling van de patiënt afgeleide tumor xenotransplantaten (PDXs), waarbij chirurgisch weggesneden tumor samples direct in immuun-gecompromitteerde muizen worden geënt, biedt een aantal voordelen ten opzichte van standaard cellijn xenograft modellen en vormt een belangrijke stap vooruit in het onderzoek naar kanker 1,2. PDXs kunnen worden gehandhaafd en uitgebreid door opeenvolgende doorgangen met een minimale verandering van de genetische en biologische eigenschappen van de tumor gegroeid bij de eerste doorgang; en een betere weerspiegeling van de tumor heterogeniteit dan xenotransplantaten afgeleid van kanker bij de mens cellijnen 3-8. Deze modellen worden nu op grote schaal gebruikt als platform voor het personaliseren van kanker geneeswijze 9,10, als een preklinische platform in de ontwikkeling van geneesmiddelen 6,11 en als een experimenteel instrument voor de studie van de biologie van kanker 4,12.
De meeste PDXs worden geïmplanteerd en subcutaan gepropageerd, die haalbaar maakt meting van de groei van de tumor in de tijd met behulp van remklauwen. Echter, Metastatische ziekte is moeilijker geweest om te modelleren met behulp van PDXs. Specifiek voor borstkanker xenotransplantaten met metastatische vermogen uiteenlopende organen beschreven 3,5,13, maar de frequentie van spontane verspreiding metastasen is extreem laag. Wanneer gemeld, de identificatie en kwantificatie van metastatische last beroept zich moeizaam histologisch onderzoek van doelorganen post-mortem. cel kanker lijnen tot expressie bioluminescent (luciferase, Luc) of fluorescentie (Green Fluorescent Protein, GFP) gen reporters worden vaak gebruikt in experimentele modellen van borstkanker uitzaaiingen hersenen, longen, bot en lever na intracardiale, staart-ader, intrafemoral en milt injectie 14-16. Hoewel deze modellen omzeilen verspreiding van de primaire tumoren, zijn ze waardevol voor de mechanismen van orgaan tropisme en metastatische kolonisatie bestuderen. Echter, cellen afkomstig van primaire tumoren en patiënt PDXs kunnen lage transfectie of transductie tarieven usin hebbeng-standaard procedures. Een alternatief is PDX-afgeleide cellijnen in vitro vastgesteld 17, die vervolgens kan worden gelabeld met conventionele weefselkweek protocollen. Deze aanpak is echter niet geschikt voor het labelen meeste PDXs waarvoor cellijn afleiding moeilijk en kan het fenotype van de cellen te veranderen. Hier presenteren we een protocol voor transductie van PDX-gedissocieerde tumorcellen met lentivirale vectoren die geschikt zijn voor in vivo beeldvorming. Daarnaast beschrijven we experimenteel métastase via intracardiale injectie van gedissocieerde luc-GFP gemerkte cellen PDX in immuungecompromitteerde muizen.
Een basis protocol voor transductie van PDX-gedissocieerd organoids met gen-reporter tot expressie lentivirus is eerder beschreven 18. In het huidige protocol andere methoden beschrijven we te verrijken voor humane tumorcellen en het verkrijgen van bijna 100% transductie efficiëntie en het gebruik van gelabelde PDXs voor het detecteren experimentele borstkankermetastasen. Dit protocol kan worden aangepast voor het labelen van verschillende kankersoorten PDXs met verschillende luminescerende en fluorescerende merkers en modulatie van genexpressie (dat wil zeggen, shRNA knockdown van genen van belang).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle stappen die het gebruik van dieren in dit protocol volgt de richtlijnen van de Universiteit van Colorado onderzoek dier ethische commissie (IACUC).
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en andere reagentia
- Bereid 100 ml mammosphere medium dat Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium en Han's F-12 medium (DMEM / F12) (1: 1), basische fibroblast groeifactor (bFGF, 20 ng / ml), epidermale groeifactor (EGF, 10 ng / ml ), heparine (4 gg / ml), 1x B27, penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml). Voeg media in steriele omstandigheden en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
- Bereid epitheliale verrijking buffer (EEB) met PBS pH 7,2, 0,5% runderserumalbumine (BSA), 2 mM EDTA. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C tot 6 maanden.
- Voeg 5 ml aliquots digestiebuffer in steriele 15 ml conische buizen en bewaar bij -20 ° C gedurende maanden. De nacht voor de spijsvertering tumor, dooi spijsvertering buffer (5 ml per 500 mgtumor) op ijs bij 4 ° C. Voeg 1x antibiotica-antimycotische mix voor gebruik.
- Autoclaaf (121 ° C gedurende 30 min) ten minste twee forceps, scalpel en scharen dissectie van PDXs.
- Voeg 500 ml wasbuffer bevattende DMEM: F12 en 5% foetaal runderserum (FBS). Bewaren bij 4 ° C gedurende maanden. Aliquot 10 ml per tumor de dag van de tumor dissectie.
- Bereid een polybreen voorraad bij 4 ug / ul met steriel water. Filter en aliquot in 1,5 ml microcentrifuge buisjes die 100 ul elk bewaar bij -20 ° C.
2. Het genereren van hoge titer Lentiviral Deeltjes Carrying Traceable Markers
- Aanschaffen of het genereren van een hoge titer lentivirale deeltjes die een reporter-gen (bijv., GFP en Luc voor in vivo volgen van tumorgroei) 18,19.
LET OP: Een lentivirale titer van> 10 8 TU / ml (transductie eenheden per milliliter) wordt aanbevolen voor een succesvolle transductie van PDXs. De lentivirale partikelen moeten pseudo met een envelop glycoproteïne G van vesiculaire stomatitis (VSV-G), waardoor transductie van diverse zoogdiercellen.
OPMERKING: Het protocol hier gebruikt voor het genereren en titratie van hoge titer lentivirale deeltjes beschikbaar www.kottonlab.com . Vectoren die in dit protocol zijn pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro en de dubbele promotor faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Deze vector werd gegenereerd door het vervangen van DsRed met het luciferasegen stroomafwaarts van EF1aL promotor in de faag-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vector, een soort geschenk van Darrell Kotton, Boston University.
3. Productie van Patient afgeleide Xenograften
- Genereer patiënt afgeleid xenotransplantaten (PDX) van borstkanker door het implanteren van primaire of metastatische borstkanker tumoren in de uiervet pad van immuungecompromitteerde muizen 3,4. Genereer tumoren op maximaal aanbevolen grootte van 1 cm diameter grotere tumoren likely necrotisch kernen bevatten.
OPMERKING: Gedetailleerde methoden voor de vaststelling en het transplanteren van xenotransplantaten worden beschreven in DeRose et al. 18. Groei van gevestigde-transplantable PDXs in> 1 cm diameter tumoren draait tussen 4 en 24 weken na implantatie in immuungecompromitteerde NOD / SCID / ILIIrg - / - (NSG), afhankelijk van de intrinsieke tumorgroeisnelheden. Hoewel dit protocol beschrijft transductie van borstkanker PDXs, kan het worden gebruikt voor virale transductie van elke tumor geschikt op korte termijn in vitro passage. De gevoeligheid van PDXs op korte termijn (24-96 uur) in vitro overleving is inherent aan elke tumor en moet proefondervindelijk worden bepaald.
4. Tumor ontleding en dissociatie van PDX-afgeleide tumorcellen
- Euthanaseren muizen die PDX met behulp van CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie (volg de institutionele richtlijnen van dierlijke onderzoek ethische commissie). Onderdompelen muizen in een 0,2% Chlorhexidine oplossing gedurende 1 min. Zet muis op een liggende positie op de top van een dissectie board, en het gebruik van pinnen om de verlengde bovenste en onderste ledematen vast te stellen aan de raad.
- Aseptische wijze, gebruik een scalpel om de huid rond de tumor snijden. Trek de huid met een reeks pincet en scheiden van de tumor met een schone scalpel totdat de tumor geheel is blootgesteld. Met behulp van een schone set van pincet en scalpel, verwijder de tumor en plaats het in 5 ml wassen media op ijs.
- Neem ontleed tumor in een BLS2 kast voor verdere verwerking. Verwijder media en spoel tumor met 10 ml Hank's Balanced Salt Natrium gemodificeerd met 10 mM Hepes (HBSS / Hepes), tweemaal.
- Laat de tumor in een steriele vooraf gewogen 60 cm weefselkweek plaat. Weeg de plaat met de tumor tumor massa te schatten.
- Met behulp van een scalpel, snijd de tumor in de helft, dan snijd een 3 mm schijf van de ene helft en plaats het in een container met 10% formaline gedurende 24 uur. Gebruik dit weefsel aan de heterogeniteit van de te controlerentumor monster (ouderlijk PDX). Voeg 200 ul HBSS / Hepes (genoeg om het weefsel te voorkomen uitdrogen) en gehakt de overblijvende tumor in de kleinst mogelijke stukken behulp van een tang en een schone scalpel.
- Breng het gehakt tumor in een steriele 50 ml conische buis. Voeg ten minste 1 ml digestiebuffer uit 1x antimycotische antibiotica per 100 mg van de tumor.
OPMERKING: Toevoeging van antibiotica / antimycotische voorkomt vervuiling van tumorcellen in vitro. - Digest tumor 3 uur bij 30 ° C, onder schudden bij 125-200 rpm.
OPMERKING: Verhoging temperatuur tot 37 ° C verhoogt de efficiëntie van de spijsvertering (meer afzonderlijke cellen in de tijd), maar het is meestal gepaard met een verhoogde celdood. Voor de meeste tumoren, digestie op 30 ° C gedurende 3 uur resulteert in voldoende aantallen levensvatbare cellen gedissocieerd om naar de labeling stap. - Stop de spijsvertering te voegen 35 ml wassen media (DMEM / F12 met 5% FBS). Filteren door middel van een 70 um nylon mesh in een schone 50 ml conical buis onverteerd weefsel te verwijderen. Centrifugeer de gefilterde media die gedigereerd cellen bij 400 g gedurende 5 min.
- Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml rode bloedcel lysisbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Voeg 10 ml wasbuffer (DMEM: F12, 5% FBS) aan lysis stoppen. Passeren cellen door middel van een 40 uM nylon Mesh om klonten te verwijderen. Centrifugeren bij 400 g gedurende 5 minuten en verwijder supernatant, plaats op het ijs.
- Resuspendeer gedigereerd cellen in 5 ml wasbuffer en tel zowel levensvatbare en niet-levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw exclusie. Kort samengevat, meng 50 pi cellen en 50 pi trypan blauw en tel trypan-blauw uitsluiting cellen met een hemocytometer.
Opmerking: Dit ruwe product digestie humane tumorcellen verkregen uit de PDX, en muis stromale cellen bevatten (fibroblasten, bloedcellen, enz.). Gedigereerde cellen kunnen nu worden verwerkt voor het kenmerken (stap 6), of menselijke kankercellen kan worden verrijkt via een van de beschreven proceduresin 5 Ref.
5. Verrijking van Human Epitheliale kankercellen
- Afbreken van de muis stromale cellen met behulp van een geslacht (Lin +) cel depletie kit 20.
OPMERKING: aanbevolen voor vaatrijke tumoren en / of tumoren met een hoog gehalte aan stromale waarin EpCAM expressie is onbekend of verloren).- Neem maximaal 10 7 levensvatbare cellen in een schone 5 ml polypropyleen buis, voeg 2 ml EEB en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Pipet off supernatant volledig.
- Hersuspenderen celpellet in 40 ul ijskoude EEB per 10 7 cellen.
- Voeg 10 ul van biotine-antilichaam cocktail per 10 7 cellen Meng door voorzichtig pipetteren en incuberen bij 4 ° C gedurende 10 min (cocktail bevat antilichamen tegen Lin + muizencellen).
- Voeg 30 ul van koude EEB per 10 7 cellen, meng door voorzichtig pipetteren.
- Voeg 20 ul van anti-biotine microbolletjes per 10 7 cellen mix door voorzichtig pipetteren en incuberen bij 4 & #176; C gedurende 15 minuten.
- Was de cellen met 3 ml koude EEB, centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zorgvuldig aspireren supernatant. Resuspendeer pellet in 500 ui van EEB en leg ze op ijs.
- Plaats de kolom in het magnetische veld van een magnetische scheider. Spoel kolom met 0,5 ml epitheliale verrijking buffer en laat deze druppelen. Sta niet toe dat de kolom te drogen.
- Plaats een nieuwe polypropyleen collectie buis onder de kolom. Voeg langzaam de 500 ul bevattende gelabelde cellen in de kolom (Lin + gelabelde cellen in de magnetische kolom worden vastgehouden). Verzamel effluent als een breuk met ongelabelde cellen, die de verrijkte lineage negatieve (tumor) cel fractie.
- Spoel de kolom 3 maal met 500 ul van eb en het verzamelen van het effluent in dezelfde buis als effluent van stap 5.1.8. Houd effluent op ijs en ga verder met de etikettering stap (6).
- Optioneel: Neem de kolom buiten het magnetisch veld. Plaats een nieuwe polypropyleen buis eronderen elueer het LIN + fractie door toevoeging van 500 pl EEB, drie keer en met de bijgeleverde zuiger.
- Verrijking van de menselijke EpCAM + epitheliale kankercellen (aanbevolen voor tumoren bekend om uit te drukken CD326 + en bevatten een hoog muis stromale inhoud).
- Neem maximaal 10 7 levensvatbare cellen in een schone 5 ml polypropyleen buis, voeg 2 ml koude EEB en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Pipet off supernatant volledig.
- Hersuspenderen celpellet in 60 ul ijskoude EBB per 10 7 cellen.
- Voeg 20 ul van EpCAM microkralen per 10 7 cellen Meng door voorzichtig pipetteren en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Was de cellen met 3 ml koude EEB, centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zorgvuldig aspireren supernatant. Resuspendeer pellet in 500 ui van EEB en op ijs gezet.
- Plaats de kolom in het magnetische veld van een mini separator. Spoel kolom met 0,5 ml EEB en laat het door te druppelen. Sta niet toe dat de kolom te drogenuit.
- Plaats een nieuwe polypropyleen collectie buis onder de kolom. Voeg langzaam de 500 ul bevattende gelabelde cellen in de kolom (EpCAM + gelabelde cellen in de magnetische kolom worden vastgehouden). Verzamel effluent als een breuk met ongelabelde cellen, die de muis stromale cellen.
- Spoel de kolom 4 maal met 500 ui buffer ME en verzamel de spoelvloeistof net buis effluent van stap 5.1.8.
- Neem de kolom buiten het magnetisch veld. Plaats een nieuwe polypropyleenbuis onder elueren en het EpCAM + fractie door toevoeging van 500 pl ME buffer, drie keer. Spoel de magnetisch gemerkte cellen door stevig indrukken van de zuiger in de kolom. Verzamel effluent met de verrijkte EpCAM + tumorcel fractie en blijf op ijs. Ga verder met stap 6.
6. Transductie van PDX-afgeleide tumorcellen
- Centrifuge gescheiden tumorcellen bij 300 GX 5 min en resuspendeer in 2 ml mammosphere medieen. Count levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting in 4.11.
- Bereid 10 ml van mammosphere medium met 8 ug / ml polybreen (2 pl voorraad polybreen per ml media).
- Bepaal het benodigde volume van 2 x 10 5 levensvatbare tumorcellen. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten en resuspendeer pellet in 2 ml polybreen bevattende media. Plate 2 x 10 5 levensvatbare tumorcellen per putje in een 6-well ultra-lage therapietrouw weefselkweek plaat.
Opmerking: Dit is een optimaal aantal cellen nodig voor transductie met een lentivirale vector.
LET OP! Lentivirale deeltjes en alle hulpstoffen met lentivirale deeltjes moeten worden behandeld volgende institutionele procedures voor recombinant DNA biohazards.
OPMERKING: Lentivirale transductie van primaire borstcellen lans worden myoepitheelcellen die kan leiden tot een slechte etikettering van luminale cellen en selectie van subpopulaties van tumorcellen tijdens labelen 21. <li> Incubeer het virus met 200 mU / ml neuraminidase bij 37 ° C gedurende 1 uur voorafgaand aan transductie om de binding van virale deeltjes verschillende primaire celtypes en correct te verhogen voor deze mogelijke vertekening 21. - Voeg lentivirale deeltjes bij 10 MOI (2 x 10 6 TU gedurende 2 x 10 5 levensvatbare cellen) indien PDX-gedissocieerde cellen worden uitgeput van Lin + muizencellen of verrijkt in EpCAM + cellen. Voeg lentivirale deeltjes bij 30 MOI (6 x 10 6 TU gedurende 2 x 10 5 levensvatbare cellen) indien het gebruik van niet-verrijkte PDX-gedissocieerde cellen.
OPMERKING: De verhoogde MOI zorgt voor efficiënte transductie, zelfs in aanwezigheid van grote hoeveelheden puin en dode cellen in ruwe extracten. Houd een goed met niet-gelabelde cellen om te dienen als een controle voor de levensvatbaarheid en transductie efficiency. - Swirl virus te mengen met cellen. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende maximaal 96 uur. Voeg 500 ul van verse mammosphere media 24 uur na transfectie. Cellen zullen niet Attach platen, niet zuigen media.
7. Evaluatie van de Transductie Efficiëntie en Re-implantatie van gelabelde cellen in Immuungecompromitteerde Muizen
- Monitor expressie van het traceerbare marker (GFP) elke 24 uur met behulp van een fluorescentie microscoop bij 10x vergroting.
OPMERKING: GFP expressie kan worden reeds na 24 uur na infectie, maar in de meeste PDXs GFP-expressie duidelijk zichtbaar na 72 uur (figuur 1). - Schat de efficiëntie van transductie door het evalueren van het percentage GFP + cellen in het totaal ook.
OPMERKING: Aangezien kweken bevatten tumorcellen residuele stromale cellen en dode cellen dat in verschillende mate, kan putjes zo laag als 10% GFP + cellen worden geïmplanteerd in een gastheer muis. - Transfer getransduceerde cellen uit 6-well platen in een 15 ml conische buis. Voeg 1 ml mammosphere media naar de bron om alle cellen achter laat. Leg ze op ijs.
- Voeg 10 ml HBSS / Hepes te getransduceerde cellen en centrifuge bij 300 g gedurende 5 min, 4 ° C. Zorgvuldig aspireren supernatant en resuspendeer in 50 ul kelder matrix extract (BME) op ijs.
OPMERKING: BME aliquots worden ontdooid op ijs, 1-2 uur vóór gebruik. BME stollen bij kamertemperatuur; houden op ijs te allen tijde. - Laad BME-ingebed cellen in een 0,5 ml insulinespuit, houden op het ijs, en breng aan het dier faciliteit voor reimplantation in NSG muizen.
- Verdoven vrouwelijke 4-8 weken oude NSG muizen, met behulp van 5% isofluraan / 95% zuurstof gedurende 5 minuten, gevolgd door 2% isofluraan / 98% zuurstof of volgens erkende dierproeven ethische goedgekeurd protocol.
- Wanneer dier niet reageert op pijnprikkels (teen-snuifje), het reinigen van de injectie met betadine, gevolgd door ethanol doekjes, en injecteer de 50 ul van de cellen in de 4 e uiervet pad. Zorg voor muizen met pijnstilling injectie pijn te verlichten, zoals aangegeven in het goedgekeurde protocol.
- Een cel in staat om tumoren te vormen (2-12 weken) en monitor GFP en / ofluciferase activiteit met een afstembare licht en / of in vivo luciferase beeldvormingssysteem (figuur 2).
LET OP: Volg de richtlijnen voor anesthesie, analgesie, tumorlast metingen en euthanasie criteria zoals goedgekeurd door institutionele dierproeven ethische commissie.
8. Quality Control van gelabelde PDXs
- Bepaal de efficiëntie van de etikettering door het beoordelen van luciférase en GFP expressie in geëtiketteerde tumoren.
LET OP: Volg de institutionele dierproeven ethische commissie goedgekeurde procedures voor in vivo bioluminescentie beeldvorming (figuren 2, 3).- Ontleden tumoren van muizen geëuthanaseerd wanneer tumorgrootte bereikt 1,0-1,5 cm diameter (of vóór volgens erkende protocollen, zoals in 4). Dissection moeten worden uitgevoerd in het kader van een afstembare lichtsysteem (of een gelijkwaardig systeem dat GFP fluorescentie evaluatie mogelijk maakt).
- Van elke tumor, kwalitatief een schatting van de percentage van GFP + tumor met behulp van microscopie. Als minder dan 100%, ontleden alleen GFP + gedeelte. Ontleden van een mm schijf 3 en plaats in 10% formaline voor het inbedden in paraffine en histologische analyse, sparen een klein stukje voor RNA of andere gewenste analyses en bespaart zo veel van de tumor mogelijk in afzonderlijke 1,5 ml cryotubes met 90% FBS / 10% DMSO voor cryopreservatie.
- Re-implantaat stukken van gelabelde tumor in nieuwe ontvanger NSG muizen 18 om uit te breiden en te gebruiken in de experimentele metastase studies.
- Voer standaard immunohistochemische kleuring van paraffine ingebed weefsel verkregen van tumoren voorafgaande transductie en bij elke generatie daarna controleren of gelabelde PDXs blijven histologisch vergelijkbaar met de originele PDXs.
Attentie: de markers gebruikt voor de kwaliteitscontrole variëren met elke PDXs. Voor borstkanker PDXs expressie van oestrogeen receptor, progesteron receptor, epidermale groeifactor receptor 2 (HER2), epidermale groeifactor receptor 1 (HER1 of EGFR), pan-cytokeratine (pan-CK) worden aanbevolen voor de initiële screening.
9. Experimentele metastase Modellen met gemerkt PDXs
- Naar aanleiding van de stappen beschreven in punt 4, distantiëren tumorcellen uit een gelabelde PDX. Als tumor vaatrijke of rich in muizen stroma Voer verrijking van kankercellen zoals beschreven in 4,5 of 4,6.
- Count levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting, en verdun 250.000 cellen in 100 ul PBS (Ca 2+, Mg 2+ gratis) per muizen. Houd cellen op ijs. Voor injectie van meervoudige muizen, pas de nummers daarvan (en bereidt een overmaat van ten minste één extra injectie om rekening te pipetteren fouten).
- Breng cellen op ijs naar de juiste dier procedure kamer en ga aan de intra-cardiale injectie volgens de goedgekeurde IACUC protocol.
OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor intra-cardiale injectie van kankercellen zijn elders 22,23 beschreven. - Track en kwantificeren van metastatischegespreid in de tijd met behulp van bioluminescentie beeldvorming. Visualiseren macroscopische metastasen in verschillende organen met behulp van bioluminescentie en / of GFP beeldvorming van geïsoleerde organen bij autopsie 24 (figuur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode beschrijft de transductie van PDX-gesplitste borstkankercellen met behulp van hoge titer lentivirale vectoren pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro en faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Deze vectoren drukken een fluorescente merker die het mogelijk maakt het schatten van de efficiëntie van transductie in vitro, al 24 uur na infectie (figuur 1a). Voor de meeste PDXs, zal expressie van GFP worden uitgesteld tot 72 uur na infectie (figuur 1b), op dit ogenblik de vorming van cel aggregaten wordt vaak waargenomen. Transductie kan worden bereikt na verrijking voor menselijke kankercellen (bijv behulp Lin + cellen depletie figuur 1a) of ruwe PDX-gedissocieerde cellen (Figuur 1b). Verrijking van tumor epitheelcellen wordt aanbevolen voor sterk gevasculariseerde tumoren muis bloedcellen vormen een aanzienlijk percentage van het totale aantal levensvatbare cellen.
in vitro worden gelabelde cellen verzameld en gesuspendeerd in extracellulaire matrix en opnieuw geïmplanteerd in muizen NSG. Gelabelde tumorcellen regenereren tumoren die kunnen worden gevolgd met behulp van bioluminescentie en fluorescentie (figuur 2). Transductierendement moet volgende tumorvorming geëvalueerd en deze zal variëren afhankelijk van de gevoeligheid van verschillende PDXs in vitro transductie. Een succesvol label PDX zich dicht bij 100% GFP + in eerste generatie na transductie (figuur 2b, c) en nabij 100% GFP + in latere passages blijven (figuur 3). Echter, sommige PDXs "fragmentarische" verdeling van GFP + cellen (Figuur 4) tonen, die op een suboptimaal in vitro transductie. In deze gevallen kunnen tumoren worden ontleed onder een fluorescentie zichtsysteem om GFP + gebieden die opnieuw kan worden geïmplanteerd voor uitbreiding van de gelabelde SubPop selecterenning, of tumoren kan worden losgekoppeld en GFP + cellen kunnen worden geïsoleerd met behulp van FACS gevolgd door re-implantatie in NSG muizen.
Aangezien PDX dissociatie en transductie kan leiden tot de selectie van celtypes in de tumor, onderzoekers moet controleren of gelabelde tumoren sterk lijken op de ouderlijke tumoren waarvan ze zijn afgeleid. PDXs moet worden gekleurd door IHC bij elke generatie aan te tonen dat kritische markers zoals EGFR, hormoonreceptoren (dat wil zeggen, oestrogeen receptor) en pan-cytokeratines (PanCK, markers van epitheelcellen) zijn geconserveerd in geëtiketteerde PDXs. Figuur 5 toont kleuring voor EGFR en panCK in een triple negatieve borstkanker PDX (hormoonreceptorpositieve kleuring wordt niet getoond als deze PDX ontbreekt aan oestrogeen en progesteron receptor).
Gelabelde PDXs kan worden gebruikt om spontane metastatische verspreiding en experimentele metastatische bijhoudenverspreid door enten van cellen direct in de circulatie. Spontane uitzaaiingen van borstkanker PDXs komen minder vaak voor, maar zijn gemeld door verschillende groepen 3,13,25. Experimentele modellen metastasen bieden een alternatief orgaan tropisme en orgaanspecifieke kolonisatie stappen in de metastatische cascade te bestuderen. Cellen losgekoppeld van gelabelde tumoren worden intracardiaal geïnjecteerd en metastatische last wordt gevolgd met behulp van bioluminescentie beeldvorming. Zoals getoond in figuur 6, een PDX getransduceerd met faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W geïnjecteerd met 250.000 cellen / muis gevormd metastasen in longen en lever die gemakkelijk met luciferase beeldvorming in vivo en GFP-expressie geïdentificeerd in organen ex vivo .
Figuur 1:. Tracking Transductie Efficiency in Gescheiden PDX Cells A) B) PDX-gesplitste cellen van een afzonderlijk experiment, zonder epitheelcellen verrijking, 72 uur na transductie met faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-w. Beide panelen tonen levende cellen. BF: Bright gebied beelden, balk geeft 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Instelling van Gelabelde PDXs Host muizen cellen getransduceerd met faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W gedurende 72 uur werden geïmplanteerd in de borstklier vetkussentje van een vrouwelijke muis NSG. De tumor werd toegestaan te groeien gedurende 14 weken na injectie. A) Luciferase reporter activiteit wordt bepaald door in vivo beeldvorming na intraperitoneale injectie van luciferine. B) GFP expressie kan worden waargenomen door de intacte huid met fluorescentie- visualisatiesysteem. C) GFP expressie moet worden gecontroleerd bij dissectie om de mate van tumor labeling. Dit voorbeeld toont alomtegenwoordige GFP tot expressie tumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Labeled PDXs Behoud Traceable Markers na meerdere passages in Vivo Een borstkanker PDX gelabeld met faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W wordt getoond 3 passages na transductie.. GFP expressie blijft bijna 100% in de passage onderworpen tumor.54.944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Voorbeeld van een PDXs met suboptimale Transductie Efficiency. A) Borstkanker PDX gelabeld met faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W werd gepasseerd na een suboptimale transductie plaatsvond. De resulterende tumoren bevatten gemengde populaties van GFP + en GFP- tumorcellen. De linker tumor is niet geschikt voor verdere vermeerdering. De juiste tumor kan worden vermeerderd door het ontleden van de GFP + regio onder een fluorescentie het bekijken systeem. B) Regio's van GFP + cellen in gemengde tumoren kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd onder TL-licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Kwaliteitscontrole van PDX Features na Transductie en passage. Expressie van EGFR en Pan-cytokeratine (PanCK) in paraffine ingebedde weefsel van een triple negatieve borstkanker PDX F2-7 bij passage 2 (P2, voorafgaand aan transductie), de tumor gegenereerd onmiddellijk na transductie (P2-i0) en de volgende passage (P2-i1). 20X beelden, Bars vertegenwoordigt 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Experimenteel metastase gebruiken Labeled PDXs. Een PDX expressie faag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W werd gedissocieerd gedurende 3 uur zoals beschreven in 4 en 250.000 cellen weopnieuw geïnjecteerd in de linker ventrikel van cardiale NSG muizen. A) metastatische groei kan worden getraceerd in levende dieren met behulp van luminescentie beeldvorming. Metastatische last van deze borstkanker PDX kan in B) lever en C) longen worden waargenomen met behulp van ex-vivo beeldvorming van ontleed organen onder een fluorescentie het bekijken systeem. Bars vertegenwoordigt ongeveer 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol:
Het gebruik van hoge titer lentivirale deeltjes (> 10 8 TU / ml) is een kritische stap in het succes van dit protocol, zoals laat zorgvuldige controle van de mediumsamenstelling tijdens in vitro transductie. Hoewel verschillende werkwijzen voor de productie van hoge titer virale deeltjes zijn goed beschreven 18,19; Dit protocol gebruikt lentivirale deeltjes zoals uitgebreid beschreven in www.kottonlab.com . Een zachte Werkwijze voor vertering van tumoren en dissociatie van kankercellen is essentieel voor een succesvolle etikettering en groei van gelabelde tumoren. Verlenging van de digestietijd dan drie uur of verhogen van digestie temperatuur tot 37 ° C verhoogt het aantal gedissocieerde cellen maar vermindert cellevensvatbaarheid en het succes van de etikettering in de meeste tumoren.
Wijzigingen en het oplossen van problemen:
Dit protocol moet dynamisch worden beschouwd en vereist aanpassing voor het unieke PDX met zorgvuldige controle bij elke stap. Hoewel deze standaard protocol werkt goed voor de meeste xenogetransplanteerde tumoren, kunnen kleine variaties nodig zijn om de etikettering van verschillende PDXs optimaliseren. Bijvoorbeeld, de dichtheid en samenstelling van stroma en extracellulaire matrix verschillen gewoonlijk tussen PDXs, waarbij de tijd die dissociatie en de opbrengst van tumorcellen daarna verkregen kunnen beïnvloeden. Grote tumoren die necrotische en sterk gevasculariseerde tumoren worden soms moeilijk te labelen door vuil en overmatige muis bloedcellen. Het gebruik van Lin + depletie en epitheliale EpCAM + celverrijking in dit protocol beschreven verbetert de efficiëntie van transductie in dergelijke PDXs. Echter, expressie van EpCAM + cellen varieert ook in tumoren van epitheliale oorsprong, dus moet het begrip per PDX worden gecontroleerd voor gebruik als werkwijze voor celverrijking.
Limitagen van de techniek:
Transductie van gedissocieerde cellen en hun tijdelijke cultuur in vitro kunnen leiden tot selectie van celtypes, die dan aanleiding geven gelabelde tumoren fundamenteel verschilt van de ouderlijke PDXs. De pre-incubatie van lentivirale deeltjes met neuraminidase wordt aanbevolen om de binding van virale deeltjes verhogen cel subpopulaties 21 moeilijk te transduceren, waardoor de transductie vooroordeel dat in deze stap kunnen worden ingevoerd verminderen. Onze ervaring tumoren gereconstitueerd door getransduceerde cellen lijken op de eigenschappen van de ouderlijke PDXs niet alleen histologisch, maar ook met behulp van hiërarchische clustering analyse van mRNA-expressie (RNA volgende, gegevens niet getoond). Kwaliteitscontrole op het gebied van etikettering efficiency en tumor trouw moet worden uitgevoerd voor elke PDX bij elke passage. Aangezien PDX labeling uitbreiding van de tumor in vivo en tumor drift vereist kunnen optreden na herhaalde passaging, transductie worden uitgevoerd zo snel passeren is.
Belang van de techniek:
Dit protocol wordt beschreven hoe borstkanker PDXs kan een fluorescent gelabeld bioluminescently in vitro en opnieuw geïmplanteerd in vivo volgen van orthotope en metastatische tumorgroei. Hoewel eerdere studies een soortgelijke strategie PDX-afgeleide organoids 18 label gebruikt, wordt dit protocol omvat variaties in tumor spijsvertering en kenmerken die resulteren in een hoge transductie efficiëntie van meerdere PDXs.
Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het beheersen van deze techniek:
Het vermogen om stabiel tot expressie traceerbare markers (GFP, luciferase) en overexpressie of knockdown specifieke genen (bijv pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro kan worden gebruikt om shRNAs leveren) staat het gebruik van PDXs fundamentele vragen te beantwoordengroei en metastase tumor in een soortgelijke wijze als gevestigde cellijnen. In het bijzonder, dit protocol toont het gebruik van gelabelde PDXs in experimentele metastase modellen orgel-kolonisatie stappen studeren in de metastatische cascade. Uitzaaiingen naar andere organen kan gemakkelijk worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van bioluminescentie beeldvorming in levende dieren en GFP uitdrukking gebruikt om begeleide dissecties en te visualiseren uitzaaiingen in uitgesneden organen. Dit is een krachtig hulpmiddel om het gebruik van PDXs voor metastase onderzoek te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken dr Darrel Kotton aan de Boston University voor het verstrekken van de faag-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vector en protocollen voor hoge titer lentivirale productie gebruikt in deze studies. Dit werk werd gefinancierd door DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) en R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Center subsidie ondersteund in vivo imaging en weefselkweek kernen aan de Universiteit van Colorado AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M.
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
