Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til stabil mærkning af patient-afledte xenotransplantater (PDXs) med lentivirale partikler, der udtrykker grønt-fluorescerende protein og luciferase reportere. Denne fremgangsmåde muliggør sporing af væksten af PDXs ved det primære sted, samt detektering spontane og eksperimentelle metastaser anvendelse af in vivo-billeddannelse.
Introduction
Udviklingen af patient-afledt tumorxenoplantater (PDXs), hvor kirurgisk resektion tumor prøver indpodede direkte i immunsvækkede mus, tilbyder flere fordele i forhold til standard celle-line xenograftmodeller og repræsenterer et stort fremskridt i kræftforskning 1,2. PDXs kan opretholdes og ekspanderes ved successive passager med minimal ændring af de genetiske og biologiske karakteristika af tumoren dyrket ved den første passage; og mere præcist afspejler tumor heterogenitet end xenografter fra humant cancer cellelinjer 3-8. Disse modeller er nu flittigt brugt som platform for personalisering kræftmedicin 9,10, som en præklinisk platform i lægemiddeludvikling 6,11 og som en eksperimentel værktøj til at studere kræft biologi 4,12.
De fleste PDXs implanteres og opformeret subkutant, der indpasses tillader måling af tumorvækst over tid ved hjælp af calipre. Imidlertid, Metastatisk sygdom har været vanskeligere at modellere bruge PDXs. Specifikt for brystkræft, har xenografter med metastatisk kapacitet til forskellige organer blevet beskrevet 3,5,13, men hyppigheden af spontan formidling til metastatiske steder er meget lav. Hvor rapporteret, identifikation og kvantificering af metastatisk byrde er afhængig i møjsommelige histologisk undersøgelse af målorganer efter slagtning. Cancercellelinier udtrykker bioluminiscerende (luciferase, Luc) eller fluorescerende (grønt fluorescerende protein GFP) -gen reportere er almindeligt anvendt i eksperimentelle modeller af brystkræft metastaser til hjerne-, lunge-, knogle- og lever efter intrakardial, hale-vene, intrafemoral og milt injektion 14-16. Mens disse modeller omgå formidling fra de primære tumorer, de er værdifulde til at undersøge mekanismerne for orgel tropisme og metastatisk kolonisering. celler afledt af primære patient tumorer og PDXs, kan dog have lav transfektion eller transduktion satser using standardprocedurer. Et alternativ er at etablere PDX-afledte cellelinier in vitro 17, som kan derefter mærket under anvendelse af konventionelle vævskulturplader protokoller. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke egnet til mærkning fleste PDXs, for hvilke cellelinje afledning er vanskelig og kan ændre fænotypen af cellerne. Her præsenterer vi en protokol for transduktion af PDX-dissocierede tumorceller med lentivirusvektorer egnede til in vivo billeddannelse. Derudover beskriver vi eksperimentel metastase hjælp intrakardial injektion af dissocierede luc-GFP mærkede PDX celler hos immunkompromitterede mus.
En grundlæggende protokol for transduktion af PDX-dissocierede organoids med gen-reporter udtrykker lentivirus er tidligere blevet beskrevet 18. I den nuværende protokol beskriver vi yderligere fremgangsmåder til berigelse for humane tumorceller og opnå nær 100% transduktionseffektivitet, samt anvendelsen af mærkede PDXs til detektering eksperimentelle brystcancermetastaser. Denne protokol kan tilpasses til mærkning flere cancertyper af PDXs med forskellige selvlysende og fluorescerende markører samt modulation af genekspression (dvs. shRNA knockdown af gener af interesse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trin kræver brug af dyr i denne protokol følger retningslinjerne fra University of Colorado dyr videnskabsetisk komité (IACUC).
1. Fremstilling af instrumenter, Kultur Medier og andre reagenser
- Fremstilling af 100 ml mammosphere medier indeholdende Dulbeccos modificerede Eagle-medium og Han F-12-medium (DMEM / F12) (1: 1), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal vækstfaktor (EGF, 10 ng / ml ), Heparin (4 ug / ml), 1x B27, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml). Gør medier i sterile betingelser og opbevares ved 4 ° C i op til 3 måneder.
- Forbered epithelial berigelse puffer (EEB) indeholdende PBS pH 7,2, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 2 mM EDTA. Filtersteriliser og opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
- Foretag 5 ml portioner af digestionspuffer i sterile 15 ml koniske rør og opbevares ved -20 ° C i flere måneder. Natten før tumor fordøjelse, tø fordøjelse buffer (5 ml pr 500 mgtumor) på is ved 4 ° C. Tilføj 1x antibiotikum-antimykotisk blanding før brug.
- Autoklave (121 ° C i 30 minutter) mindst to pincet, skalpel og sakse til dissektion af PDXs.
- Gør 500 ml vaskebuffer indeholdende DMEM: F12 og 5% kalvefosterserum (FBS). Opbevar ved 4 ° C i flere måneder. Portion 10 ml pr tumor dagen tumor dissektion.
- Forbered en polybren lager ved 4 pg / ul med sterilt vand. Filter og alikvot i 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 100 pi hver, opbevares ved -20 ° C.
2. generation af high Titer Lentiviral Partikler Regnskabsmæssig Traceable Markers
- Køb eller generere høj titer lentivirale partikler bærer et reporter gen (dvs.., GFP og Luc til in vivo sporing af tumorvækst) 18,19.
BEMÆRK: En lentiviral titer på> 10 8 TU / anbefales ml (transduktion enheder per milliliter) for en vellykket transduktion af PDXs. Den lentivirale partikler bør være pseudotype med en konvolut G glycoprotein fra vesikulær stomatitis-virus (VSV-G), hvilket muliggør transduktion af en bred række af mammale celler.
BEMÆRK: protokol, der bruges her til generering og titrering af høj titer lentivirale partikler findes på www.kottonlab.com . Vektorer anvendes i denne protokol er pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro og den dobbelte promotor fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Denne vektor blev genereret ved at erstatte dsRed med luciferasegenet nedstrøms for EF1aL promotor i phag-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W vektor, en venlig gave fra Darrell Kotton, Boston University.
3. generation af Patient-afledte Xenografter
- Generer patient afledte xenotransplantater (PDX) fra brystkræft ved at implantere primære eller metastatiske brysttumorer i brystfedtpuden af immunsvækkede mus 3,4. Generer tumorer på et maksimalt anbefalede størrelse på en cm i diameter som større tumorer er likely at indeholde nekrotiske kerner.
BEMÆRK: Detaljeret metoder til oprettelse og omplantning implanteret er beskrevet i DeRose et al 18.. Vækst af etablerede-transplanterbare PDXs ind> tumorer cm diameter 1 tager mellem 4 og 24 uger efter implantation i immunsvækkede NOD / SCID / ILIIrg - / - (NSG), afhængig af iboende tumor vækst. Mens denne protokol beskriver transduktion af brystkræft PDXs, kan det bruges til viral transduktion af enhver tumor egnet til kortvarig in vitro passage. Følsomheden af PDXs til kortvarig (24-96 timer) in vitro overlevelse er uløseligt forbundet med hver tumor og skal bestemmes eksperimentelt.
4. Tumor Dissektion og dissociering af PDX-afledte tumorceller
- Aflive mus, der bærer PDX hjælp CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation (følg institutionelle retningslinier af animalsk forskning etiske udvalg). Sænk mus i en 0,2% Chlorhexidine opløsning i 1 min. Sæt musen på en liggende stilling på toppen af en dissektion bord, og bruge stifter til at løse de udvidede øvre og nedre lemmer til bestyrelsen.
- Under anvendelse af aseptisk teknik anvender en skalpel til at skære huden omkring tumoren. Trække huden med et sæt af pincet og adskille den fra tumoren ved anvendelse af en ren skalpel indtil tumoren er helt åbent. Brug en ren sæt af pincet og skalpel, fjerne svulsten og placere den i 5 ml vaske medier på is.
- Tag dissekeret tumor i en BLS2 kabinet til yderligere behandling. Fjern mediet og skyl tumor med 10 ml Hanks Balanced Salt Natrium modificeret med 10 mM Hepes (HBSS / Hepes), to gange.
- Drop tumoren i en steril forvejet 60 cm vævskulturplade. Afvej på underkanten af tumoren til at estimere tumormasse.
- Ved hjælp af en skalpel, skæres tumoren i halve, derefter skære en 3 mm skive fra den ene halvdel og læg den i en beholder med 10% formalin i 24 timer. Brug dette væv at kontrollere heterogenitettumor prøve (forældrenes PDX). Tilsæt 200 pi HBSS / HEPES (nok til at undgå væv at tørre ud) og mos resterende tumor i de mindst mulige stykker med pincet og en ren skalpel.
- Overfør det hakkede tumor i en steril 50 ml konisk rør. Tilsæt mindst 1 ml spaltningsbuffer indeholdende 1x antimykotisk-antibiotikum pr 100 mg tumor.
BEMÆRK: Tilsætning af antibiotika / antimykotika forhindrer forurening af tumorceller in vitro. - Fordøje tumor i 3 timer ved 30 ° C, rystning ved 125 - 200 rpm.
BEMÆRK: Stigende temperaturer op til 37 ° C øger effektiviteten af fordøjelsen (flere enkelte celler over tid), men det er som regel ledsaget af øget celledød. For de fleste tumorer, for fordøjelse ved 30 ° C i 3 timer resulterer i et tilstrækkeligt antal levedygtige dissocierede celler fortsætte til trin mærkning. - Stop fordøjelsen tilføje 35 ml vaske medier (DMEM / F12 med 5% FBS). Der filtreres gennem et 70 um nylon mesh i en ren 50 ml conical rør for at fjerne ufordøjet væv. Centrifuger de filtrerede medier indeholdende fordøjet celler ved 400 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 1 ml med røde blodlegemer lysepuffer. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsæt 10 ml vaskepuffer (DMEM: F12, 5% FBS) for at standse lysis. Pass celler gennem en 40 uM nylon Mesh at fjerne klumper. Centrifuger ved 400 x g i 5 minutter og fjern supernatanten, anbring på is.
- Resuspender fordøjet celler i 5 ml vaskebuffer og tælle både levedygtige og ikke-levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt-udelukkelse. Kort fortalt blandes 50 pi celler og 50 pi trypanblåt og tælle trypan-blå bortset celler under anvendelse af et hæmocytometer.
BEMÆRK: Dette rå fordøjelse produkt vil indeholde humane tumorceller afledt af PDX samt muse stromaceller (fibroblaster, blodceller, osv.). Fordøjede celler kan nu bearbejdes til mærkning (trin 6), eller humane cancerceller kan beriges ved hjælp af en af fremgangsmåderne beskreveti ref 5.
5. Berigelse af human epitelcancerceller
- Depletere mus stromale celler under anvendelse af en slægt (Lin +) celle depletion kit 20.
BEMÆRK: Anbefales til meget vaskulariserede tumorer og / eller tumorer med høj stromal indhold, hvor EpCAM udtryk er ukendt eller tabt).- Tag op til 10 7 levedygtige celler i et rent 5 ml polypropylen rør, tilsættes 2 ml EEB og centrifuger ved 300 xg i 5 min. Pipette off supernatant helt.
- Resuspender cellepelleten i 40 pi iskold EEB pr 10 7 celler.
- Tilsæt 10 pi biotin-antistof cocktail pr 10 7 celler, blandes ved forsigtigt at pipettere og inkuberes ved 4 ° C i 10 minutter (cocktail indeholder antistoffer mod Lin + museceller).
- Tilsæt 30 pi kold EEB per 10 7 celler, blandes ved forsigtigt at pipettere.
- Tilsæt 20 pi anti-biotin mikrokugler pr 10 7 celler Bland ved forsigtigt pipettering og inkuberes ved 4 & #176; C i 15 min.
- Vask cellerne med 3 ml kold EEB, centrifugeres ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. aspirere omhyggeligt supernatant. Resuspender pellet i 500 pi EEB og sted på is.
- Placer kolonne i magnetfeltet af en magnetisk separator. Skyl søjlen med 0,5 ml epitel berigelse buffer og lad det dryppe igennem. Lad ikke kolonnen til at tørre ud.
- Placer en ny kollektion polypropylenrør i kolonnen. Langsomt, tilsæt 500 pi indeholdende mærkede celler over søjlen (Lin + mærkede celler vil blive tilbageholdt i den magnetiske spalte). Saml spildevand som en fraktion med umærkede celler, der repræsenterer cellefraktion beriget afstamning negativ (tumor).
- Skyl kolonnen 3 gange med 500 pi EBB og samle spildevandet i det samme rør som afløb fra trin 5.1.8. Hold spildevand på is og fortsæt til trin mærkning (6).
- Valgfrit: Tag kolonne uden for det magnetiske felt. Placer en ny polypropylenrør nedenunderog eluering af LIN + fraktion ved tilsætning 500 pi EEB, tre gange, og med den medfølgende stemplet.
- Berigelse af humane EpCAM + epitelial kræftceller (anbefales til tumorer kendt for at udtrykke CD326 + og indeholder højt mus stromale indhold).
- Tag op til 10 7 levedygtige celler i et rent 5 ml polypropylen rør, tilsættes 2 ml kold EEB og centrifuger ved 300 xg i 5 min. Pipette off supernatant helt.
- Resuspender cellepelleten i 60 pi iskold EBB pr 10 7 celler.
- Tilsæt 20 pi EpCAM mikroperler pr 10 7 celler, blandes ved forsigtigt at pipettere og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellerne med 3 ml kold EEB, centrifugeres ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. aspirere omhyggeligt supernatant. Resuspender pellet i 500 pi EEB og lagt på is.
- Placer kolonne i magnetfeltet af en mini-separator. Skyl søjlen med 0,5 ml EEB og lad det dryppe igennem. Lad ikke kolonnen tørreud.
- Placer en ny kollektion polypropylenrør i kolonnen. Langsomt, tilsæt 500 pi indeholdende mærkede celler over søjlen (EpCAM + mærkede celler vil blive tilbageholdt i den magnetiske spalte). Saml spildevand som en fraktion med umærkede celler, der repræsenterer de mus stromale celler.
- Skyl kolonnen 4 gange med 500 pi ME Buffer og samle spildevandet i det samme rør som afløb fra trin 5.1.8.
- Tag kolonne uden for det magnetiske felt. Placere en ny polypropylenrør nedenunder og eluering af EpCAM + fraktion ved tilsætning 500 pi ME puffer, tre gange. Skylle de magnetisk mærkede celler ved kraftigt at trykke stemplet ind i søjlen. Indsamle spildevand, der indeholder det berigede EpCAM + tumorcelle fraktion og holde på is. Fortsæt til trin 6.
6. Transduktion af PDX-afledte tumorceller
- Centrifuger dissocierede tumorceller ved 300 gx 5 min og resuspenderes i 2 ml mammosphere medien. Tæl levedygtige celler ved hjælp trypanblåteksklusion som i 4.11.
- Forbered 10 ml mammosphere medier indeholdende 8 ug / ml polybren (2 pi stock polybren pr ml medium).
- Bestemme mængden nødvendig for 2 x 10 5 levedygtige tumorceller. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter, og resuspender pellet i 2 ml polybren holdige medier. Plate 2 x 10 5 levedygtige tumorceller per brønd i en 6-brønds ultralav adhærens vævskulturplade.
BEMÆRK: Dette er et optimalt antal celler, der kræves for transduktion med en lentiviral vektor.
ADVARSEL! Lentivirale partikler og alle hjælpematerialer med lentivirale partikler skal håndteres efter de institutionelle procedurer for rekombinant DNA biologiske risici.
BEMÆRK: Lentiviral transduktion af primære bryst celler favoriserer stærkt myoepitelcellerne, som kan resultere i dårlig mærkning af luminale celler og udvælgelse af subpopulationer af tumorceller under mærkning 21. <li> inkuberes virus med 200 mU / ml neuraminidase ved 37 ° C i 1 time forud for transduktion at øge bindingen af virale partikler til forskellige primære celle subpopulationer og korrigere for denne potentielle skævhed 21. - Tilføj lentivirale partikler ved 10 MOI (2 x 10 6 TU til 2 x 10 5 levedygtige celler) hvis PDX-dissocierede celler udtømmes fra Lin + museceller eller beriget med EpCAM + celler. Tilføj lentivirale partikler ved 30 MOI (6 x 10 6 TU til 2 x 10 5 levedygtige celler), hvis anvendelse af ikke-berigede PDX-dissocierede celler.
BEMÆRK: Den øgede MOI tillader effektiv transduktion selv i nærvær af store mængder snavs og døde celler i råekstrakter. Holde en brønd med umærkede celler for at tjene som kontrol for levedygtighed og transduktionseffektivitet. - Swirl at blande virus med celler. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i op til 96 timer. Tilføj 500 pi frisk mammosphere medier 24 timer efter transfektion. Celler vil ikke Attach til plader, ikke aspireres medier.
7. Evaluering af Transduktion Effektivitet og Re-implantation af mærkede celler hos immunkompromitterede mus
- Overvåg ekspression af sporbar markør (GFP) hver 24 timer under anvendelse af et fluorescerende mikroskop ved 10X forstørrelse.
BEMÆRK: GFP-ekspression kan observeres så tidligt som 24 timer efter infektion, men i de fleste PDXs GFP-ekspression er tydeligt synlig efter 72 timer (figur 1). - Estimere effektiviteten af transduktion ved at evaluere den procentdel af GFP + -celler inden for den samlede brønd.
BEMÆRK: Da kulturer indeholde tumorceller, restindhold stromale celler og døde celler ved forskellige grader, kan brønde med så lavt som 10% GFP + -celler implanteres i en vært mus. - Overfør transducerede celler fra plader med 6 brønde i en 15 ml konisk rør. Tilsæt 1 ml mammosphere medier til brønden for at indsamle alle de celler efterladt. Placer på is.
- Der tilsættes 10 ml HBSS / HEPES til transducerede celler og centrifuge ved 300 xg i 5 min, 4 ° C. aspirere Forsigtigt supernatanten og resuspender i 50 pi kælder matrix ekstrakt (BME) på is.
BEMÆRK: BME portioner skal optøs på is med 1 - 2 timer før anvendelse. BME vil størkne ved stuetemperatur; holde på is hele tiden. - Load BME-indlejrede celler i en 0,5 ml insulinsprøjte, holde på is, og bringe til dyret facilitet for reimplantation i NSG mus.
- Bedøver kvindelige 4-8 uger gamle NSG mus med 5% isofluran / 95% ilt i 5min, efterfulgt af 2% isofluran / 98% ilt eller efter godkendte dyr forskningsetik godkendte protokol.
- Når dyret ikke reagerer på smerte stimuli (toe-knivspids), rense injektionsstedet med betadin efterfulgt af ethanol klude, og injicere de 50 pi af celler i det 4. brystfedtpuden. Give mus med analgesi at lindre injektion ubehag som angivet i godkendt protokol.
- Tillad celler til at danne tumorer (2 - 12 uger) og overvåge GFP og / ellerluciferaseaktivitet under anvendelse en afstemmelig lyssystem og / eller in vivo luciferase imaging system (figur 2).
BEMÆRK: Følg retningslinjer for anæstesi, analgesi, tumor byrde målinger og eutanasi kriterier som godkendt af institutionel dyr videnskabsetisk komité.
8. Kvalitetskontrol af mærkede PDXs
- Bestem effektivitet mærkning ved at vurdere luciferase og GFP udtryk i mærkede tumorer.
BEMÆRK: Følg institutionelle dyr videnskabsetisk komité godkendte procedurer for in vivo bioluminescens imaging (figur 2, 3).- Dissekere tumorer fra aflivede mus, når tumorstørrelsen har nået 1,0 - 1,5 cm diameter (eller før ifølge godkendte protokoller, som beskrevet i 4). Dissektion bør udføres under en justerbar lys system (eller et tilsvarende system, der tillader GFP-fluorescens evaluering).
- Fra hver tumor, kvalitativt estimere percentage af GFP + tumor under anvendelse mikroskopi. Hvis mindre end 100%, dissekere kun GFP + del. Dissekere en 3 mm skive og fix i 10% formalin for paraffin indlejring og histologisk analyse, gem et lille stykke for RNA eller andre ønskede analyser, og spare så meget af tumor som muligt i individuelle 1,5 ml cryorør indeholdende 90% FBS / 10% DMSO til nedfrysning.
- Re-implantat stykker af mærket tumor i ny modtager NSG mus 18 til at udvide og bruge i eksperimentelle metastase studier.
- Udfør standard immunhistokemisk farvning af paraffin indlejret væv fremstillet af tumorer før transduktion og hver generation derefter at kontrollere, at mærkede PDXs forblive histologisk ligner de originale PDXs.
BEMÆRK: De markører, der anvendes til kvalitetskontrol variere med hver PDXs. For brystkræft PDXs, ekspression af østrogenreceptor, progesteron receptor, epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2), epidermal vækstfaktor receptor 1 (HER1 eller EGFR), pan-cytokeratin (pan-CK) anbefales til indledende screening.
9. Eksperimentel Metastase Modeller med Mærkede PDXs
- Efter de trin, der er beskrevet i afsnit 4, dissociere tumorceller fra en mærket PDX. Hvis tumoren er yderst vaskulariseret eller rig på muse stroma, udføre berigelse af cancerceller som beskrevet i 4.5 eller 4.6.
- Tæl levedygtige celler ved hjælp trypanblåteksklusion, og fortyndes 250.000 celler i 100 pi PBS (Ca 2+, Mg 2+ gratis) pr mus. Hold celler på is. Til injektion af flere mus, justere tallene tilsvarende (og forberede et overskud af mindst én ekstra injektion for at tage højde for pipetteringsfejl).
- Bring celler på is til den relevante dyr procedure værelse og gå videre til intra-hjerte-injektion efter godkendt IACUC protokol.
BEMÆRK: Detaljeret protokoller for intra-hjerte- injektion af kræftceller er blevet beskrevet andetsteds 22,23. - Spor og kvantificere metastatiskspredt over tid ved hjælp af selvlysende billeddannelse. Visualisere makroskopiske metastaser på forskellige organer ved anvendelse af bioluminescens og / eller GFP billeddannelse af isolerede organer ved obduktion 24 (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode beskriver transduktion af PDX-dissocierede brystkræftceller ved hjælp af høj titer lentivirusvektorer pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro og fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Disse vektorer udtrykker en fluorescerende markør, der tillader at vurdere effektiviteten af transduktion in vitro, så tidligt som 24 timer efter infektion (figur 1a). For de fleste PDXs, vil ekspression af GFP forsinkes op til 72 timer efter infektion (figur 1b), på dette tidspunkt dannelsen af celleaggregater er almindeligt forekommende. Transduktion kan opnås efter berigelse for humane cancerceller (dvs. ved brug Lin + celledepletering, figur 1a) eller i rå PDX-dissocierede celler (figur 1b). Berigelse af tumor epitelceller anbefales til stærkt vaskulariserede tumorer var musen blodlegemer udgør en betydelig procentdel af det samlede antal levedygtige celler.
in vitro, er mærkede celler opsamlet og suspenderet i ekstracellulær matrix og re-implanteres i NSG mus. Mærkede tumorceller regenerere tumorer, som kan spores ved hjælp af bioluminescens eller fluorescens (figur 2). Transduktionseffektivitet skal evalueres følgende tumordannelse, og den vil variere afhængigt af følsomheden hos forskellige PDXs til in vitro transduktion. Et succesfuldt mærkede PDX vil være nær 100% GFP + ved første generation efter transduktion (figur 2b, c) og vil forblive nær 100% GFP + i efterfølgende passager (figur 3). Dog vil nogle PDXs vise "pletvist" fordeling af GFP + -celler (figur 4), hvilket indikerer en suboptimal in vitro transduktion. I disse tilfælde kan tumorer dissekeres under en fluorescens-visning system til at vælge GFP + områder, der kan genbruges implanterede til udvidelse af det mærkede SUBPOPfolkning eller tumorer kan adskilles og GFP + celler kan isoleres under anvendelse af FACS efterfulgt af re-implantation i NSG mus.
Da PDX dissociation og transduktion kan resultere i udvælgelsen af cellesubpopulationer i tumoren, undersøgere nødt til at bekræfte, at mærkede tumorer ligner de parentale tumorer, hvorfra de blev afledt. PDXs skal farves ved IHC ved hver generation til at demonstrere, at kritiske markører, EGFR, hormonreceptorer (dvs. østrogen-receptor) og pan-cytokeratiner (PanCK, markører for epitelceller) er bevaret i mærkede PDXs. Figur 5 viser farvning for EGFR og panCK i en tredobbelt negativ brystkræft PDX (hormon receptor farvning er ikke vist, da dette PDX mangler østrogen og progesteron receptor).
Mærkede PDXs kan bruges til at spore spontan metastatisk spredning samt eksperimentel metastatiskspredes ved podning celler direkte til kredsløbet. Spontane metastaser fra brystkræft PDXs forekomme mindre hyppigt, men er blevet rapporteret af flere grupper 3,13,25. Eksperimentelle modeller af metastaser et alternativ til at studere orgel tropisme og orgel-kolonisering trin i den metastatiske kaskade. Celler adskilles fra mærkede tumorer injiceres intracardialt og metastatisk byrde spores ved hjælp af selvlysende billeddannelse. Som vist i figur 6, en PDX transduceret med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W injiceret ved 250.000 celler / mus dannet metastaser i lunger og lever, der var let identificeret med luciferase billeddannelse in vivo, og GFP-ekspression i organer ex vivo .
Figur 1:. Sporing Transduktion Effektivitet i Dissocierede PDX Cells A) B) PDX-dissocierede celler fra et separat eksperiment, uden epitelcelle berigelse, 72 timer efter transduktion med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Begge paneler viser levende celler. BF: Bright felt billeder, søjle repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Etablering af mærkede PDXs i Host Mus Celler transduceret med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W i 72 timer blev implanteret i brystfedtpuden af en kvindelig NSG mus. Tumoren fik lov at vokse i 14 uger efter injektion. A) Luciferase reporteraktivitet bedømmes ved in vivo-afbildning efter intraperitoneal injektion af luciferin. B) GFP-ekspression kan observeres gennem intakt hud under anvendelse af et fluorescens betragtningssystem. C) GFP-ekspression bør også kontrolleres ved dissektion for at bestemme omfanget af tumoren mærkning. Dette eksempel viser allestedsnærværende GFP tumor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mærket PDXs Behold Sporbare Markers efter flere passager i Vivo En brystkræft PDX mærket med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W er vist 3 passager efter transduktion.. GFP-ekspression forbliver på næsten 100% i passerede tumor.54944 / 54944fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Eksempel på en PDXs med suboptimal transduktion Effektivitet. A) Brystkræft PDX mærket med fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W blev passeret efter en suboptimal transduktion fandt sted. De resulterende tumorer indeholder blandede populationer af GFP + og GFP- tumorceller. Den venstre tumor er ikke egnet til yderligere formering. Den rigtige tumor kan formeres ved at dissekere GFP + regioner under et fluorescens visning system. B) regioner GFP + celler i blandede tumorer kan let identificeres under fluorescerende lys. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. kvalitetskontrol af PDX Egenskaber efter transduktion og Passage. Ekspression af EGFR og Pan-cytokeratin (PanCK) i paraffin indlejret væv fra en tredobbelt negativ brystkræft PDX F2-7 ved passage 2 (P2, før transduktion), tumoren genereret umiddelbart efter transduktion (P2-I0), og følgende passage (P2-i1). 20X billeder, barer repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Eksperimentel Metastase Brug Mærkede PDXs. En PDX udtrykker fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W blev dissocieret i 3 timer som beskrevet i fire, og 250.000 celler vire injiceret i den venstre hjerteventrikel af NSG mus. A) Metastatisk vækst kan spores i levende dyr ved anvendelse luminescens billeddannelse. Metastatisk byrde af denne brystkræft PDX kan observeres i B) lever og C) lunger hjælp ex-vivo billeddannelse af dissekerede organer under et fluorescens visning system. Barer repræsenterer ca. 1cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen:
Brugen af høj titer lentivirale partikler (> 10 8 TU / ml) er et afgørende skridt for succesen af denne protokol, som giver mulighed for omhyggelig kontrol med medierne sammensætning under in vitro transduktion. Mens flere fremgangsmåder til fremstilling af høj-titer viruspartikler er blevet godt beskrevet 18,19; denne protokol bruger lentivirale partikler produceret som beskrevet i detaljer på www.kottonlab.com . En blid metode til fordøjelse af tumorer og dissociation af cancerceller er kritisk for vellykket mærkning og vækst af mærkede tumorer. Forlængelse af fordøjelsen på mere end tre timer eller forøge fordøjelsen temperaturen til 37 ° C, øges antallet af dissocierede celler, men nedsætter cellers levedygtighed og succes af mærkning i de fleste tumorer.
Ændringer og fejlfinding:
Denne protokol bør betragtes dynamisk og kræver tilpasning til unikke PDX med omhyggelig overvågning på hvert trin. Mens denne standard protokol fungerer godt for de fleste xenotransplanterede tumorer, kan små variationer være nødvendigt at optimere mærkning af forskellige PDXs. For eksempel overflod og sammensætningen af stroma og ekstracellulære matrix afviger normalt blandt PDXs, hvilket kan påvirke den nødvendige tid til dissociation, og udbyttet af tumorceller opnået derefter. Store tumorer, der bliver nekrotiske og stærkt vaskulariserede tumorer kan være vanskeligt at mærke på grund af snavs og overdrevne muse blodlegemer. Brugen af Lin + udtømning og epitelial EpCam + celle berigelse beskrevet i denne protokol forbedrer effektiviteten af transduktion i sådanne PDXs. Men udtryk for EpCAM + celler varierer selv i tumorer fra epitel oprindelse, således sin udtryk skal verificeres i hvert PDX før brug som metode til celle berigelse.
egrænsningertioner af teknikken:
Transduktion af dissocierede celler og deres midlertidige kultur in vitro kan resultere i udvælgelsen af celle subpopulationer, som derefter vil give anledning til mærkede tumorer fundamentalt forskellige fra forældrenes PDXs. Præ-inkubering af lentivirale partikler med neuraminidase anbefales at øge bindingen af virale partikler til cellesubpopulationer 21 vanskelige at transducere, hvorved den transduktion bias, som kunne indføres på dette trin. Det er vores erfaring, tumorer rekonstitueret af transducerede celler ligner funktionerne i forældrenes PDXs ikke kun histologisk, men også ved hjælp af hierarkiske clustering analyse af mRNA-ekspression (RNA seq, data ikke vist). bør udføres kvalitetskontrol på mærknings- effektiviteten og tumor fidelity for hver PDX hver passage. Da PDX mærkning kræver udvidelse af tumoren in vivo og tumor afdrift kunne forekomme efter gentagen passaging, transduktion skal udføres så hurtigt som muligt passage.
Betydningen af teknikken:
Denne protokol beskriver, hvordan brystkræft PDXs kan være fluorescerende en bioluminescently mærket in vitro og re-implanteres in vivo til sporing af orthotopisk og metastatisk tumorvækst. Mens tidligere undersøgelser har anvendt en lignende strategi til at mærke PDX-afledte organoids 18, den nuværende protokol omfatter variationer i tumor fordøjelse og mærkning, der resulterer i en høj transduktionseffektivitet af flere PDXs.
Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering denne teknik:
Evnen til stabilt at udtrykke sporbare markører (GFP, luciferase), og at overudtrykke eller Knockdown specifikke gener (dvs. pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro kan anvendes til at afgive shRNAs) tillader anvendelse af PDXs at besvare fundamentale spørgsmål omtumorvækst og metastase i en lignende måde som etablerede cellelinier. Konkret denne protokol demonstrerer brugen af mærkede PDXs i eksperimentelle metastase modeller til at studere orgel-kolonisering trin i metastatiske kaskade. Metastaser til forskellige organer kan nemt visualiseres og kvantificeres ved hjælp af selvlysende billeddannelse med levende dyr, og GFP udtryk bruges til guidede dissektioner og visualisere metastaser i udskårne organer. Dette er et effektivt redskab til at lette anvendelsen af PDXs for metastaser forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Darrel Kotton ved Boston University for at levere fag-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W vektor og protokoller for høj titer lentiviral produktion anvendt i disse undersøgelser. Dette arbejde blev finansieret af DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) og R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 center tilskud understøttet in vivo imaging og vævskultur cores ved University of Colorado AMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M.
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
